Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren
7 juni 2016
Hier presenteren we een protocol om de lokalisatie van angiotensine II Type 1 receptoren in de hersenen van ratten te beschrijven door kwantitatieve, densitometrische, in vitro receptor autoradiografie met behulp van een jodium-125 gelabeld analoog van angiotensine II.
Het algemene doel van deze procedure is om Angiotensine II-receptorexpressie in hersensecties anatomisch te lokaliseren en te kwantificeren met behulp van receptor-autoradiografie en de histologische identificatie van hersenstructuren. Deze methode identificeert de hersengebieden waar Angiotensine II gedrag, cognitieve functie en het cardiovasculaire systeem beïnvloedt, en biedt inzichten voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van neurodegeneratieve en cardiovasculaire ziekten. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het kwantitatief, kwalitatief is en het mogelijk maakt om functionele receptoren voor Angiotensine II met grotere specificiteit te identificeren dan andere methoden.
Deze methode kan ook de functionaliteit van andere hormoonreceptorsystemen door het hele lichaam karakteriseren, zoals receptoren die gerelateerd zijn aan drugsmisbruik. Plaats de hersenweefsels onmiddellijk na het oogsten in hersenvormen die het binnenste van de schedel simuleren en wikkel de vormen in aluminiumfolie voor opslag bij min 20 graden Celsius. Breng de weefsels na 30 minuten over in een afsluitbare vrieszak en bewaar de zak bij min 80 graden Celsius.
Voor het doorsnijden verwijdert u voorzichtig de hersenen uit de hersenvorm. Om het hersenweefsel te doorsnijden, brengt u het specimen van belang over in een cryostat ingesteld tussen min 10 en min 18 graden Celsius. Wanneer het weefsel geëquilibreerd is naar de nieuwe temperatuur, gebruikt u een glycol- en harsgebaseerd medium om een klein deel van het specimen verticaal in een weefselmontage in te bedden om doorsneden van het coronale vlak mogelijk te maken.
Laad het weefsel op de microtoom en draai de montage stevig vast, begin vervolgens met het snijden van de hersenen op de gewenste dikte, en monteer vervolgens de secties op microscoopglazen in verticale richting om een groter oppervlak van het weefsel op het glas aan te brengen. Verzamel de secties in opeenvolgende sets van vijf. Wanneer alle secties zijn verzameld, laat de glazen tot een uur aan de lucht drogen.
Plaats vervolgens de monsters in een plastic glasdoos in een zelfsluitende vrieszak voor opslag bij min 20 graden Celsius. Om de monsters radioactief te labelen, verwijdert u de eerste en tweede glazen uit elke set van vijf en monteert u ze in commercieel verkrijgbare of 3D-geprinte glasklemmen. De afgevinkte één glazen zijn voor de niet-specifieke behandelingsgroep en de afgevinkte twee glazen zijn voor de totale behandelingsgroep.
Keer de glazen om in 35 tot 40 milliliter kamertemperatuur AM5 plus hun respectieve remmers in de juiste pre-incubatie Coplin-potten. Het uitvoeren van meerdere sets van glazen kan overweldigend zijn. Daarom is het uiterst belangrijk om de glazen met vier minuten intervallen in de pre-incubatiepotten te plaatsen om ervoor te zorgen dat er geen overlap is tijdens de droogstap.
Na 30 minuten brengt u de glazen over naar incubatie-slidemailers die 10 milliliter AM5 bevatten, aangevuld met de juiste concentratie van I125 SI Angiotensine II en de respectieve behandelingsgroepremmers, gedurende 60 tot 90 minuten bij kamertemperatuur. Het bepalen van de exacte concentratie van 125I SI Ang II is cruciaal om de Angiotensine II-receptoren te vergelijken van de ene dag naar de andere. Aan het einde van de incubatie, brengt u de glazen terug naar de glasklemmen, blokkeert u de glazen en draait u ze voorzichtig gedurende één tot twee seconden in twee aparte containers met 400 milliliter gedistilleerd water.
Na de tweede waterwas spoelt u de glazen met vier opeenvolgende een minuut wasbeurten in 30 tot 40 milliliter AM5. Na de vierde wasbeurt, draait u de secties voorzichtig gedurende één tot twee seconden in vier veranderingen van ijskoud gedistilleerd water. Gebruik vervolgens vier föhns ingesteld op verschillende hoeken om de glazen gedurende vier minuten te drogen met koude lucht.
Wanneer alle secties droog zijn, brengt u de glazen over op een papieren handdoek. Gebruik vervolgens dubbelzijdig plakband om de glazen te monteren, weefselzijde omhoog, op een stuk karton voor röntgenfilm op positie en inclusief ten minste één jodium 125 kalibratiestandaardglas per groep. Om de secties bloot te stellen, plaatst u de kartonnen glazen in een donkere kamer in een röntgencassette met een riem en zet u de lichten uit.
Zet het veiligheidslicht aan en open voorzichtig een doos röntgenfilm. Plaats één film, glanzende kant omhoog met de gekartelde rand in de rechter benedenhoek, bovenop de glazen in de cassette. Sluit vervolgens de cassette voorzichtig met de vergrendelingsstaven om licht te voorkomen en bewaar de cassette bij min 20 graden Celsius.
Na de juiste belichtingsperiode, brengt u de film over in ontwikkelaarsoplossing gedurende twee minuten gevolgd door 30 seconden in stopbad, dubbel gedistilleerd water met azijnzuur en vervolgens vijf minuten in fixeeroplossing. Was de film in een bak met stromend water gedurende 20 minuten. Breng het over in een oppervlakteactieve stof gedurende ongeveer 10 seconden en hang de film om te drogen.
Voor histologische analyse van de hersenweefselsecties, ontdooit u de afgevinkte drie secties in een glazenrek. Was vervolgens de secties in gedeïoniseerd water gedurende één minuut gevolgd door een 10 minuten incubatie in thionine-kleuroplossing en drie doppen in één gedeïoniseerd watercontainer. Dompel de glazen onder voor een extra 30 seconden gedeïoniseerd water wassen.
Was vervolgens de glazen in opeenvolgende ethanol-wassen zoals aangegeven. Na de laatste 100% ethanol-was, was de glazen in twee containers xyleen gedurende drie en vijf minuten achter elkaar. Aan het einde van de tweede xyleen-was, bedekt u de bovenrand van één glas per keer met een harsbasis, anorganisch oplosmiddel montagemedium.
Monteer 24 bij 60 millimeter dekglasjes op de glazen en laat de glazen 48 uur drogen. Scan vervolgens de glazen en film in de computer op 2400 DPI grijswaarden. Om de film te analyseren door densitometrie, omcirkelt u na het scan
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de lokalisatie en kwantificering van Angiotensine II Type 1-receptoren in de rattenhersenen middels in vitro receptorautoradiografie. De methode biedt inzicht in de hersengebieden die worden beïnvloed door Angiotensine II, wat essentieel is voor het begrijpen van de rol hiervan in het gedrag en de cardiovasculaire functie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Receptorbiologie
- Cardiovasculair onderzoek
Achtergrond
- Angiotensine II is betrokken bij diverse fysiologische processen.
- Inzicht in de lokalisatie van de receptor kan bijdragen aan therapeutische strategieën.
- Deze methode maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse mogelijk.
- Deze kan ook worden toegepast op andere hormoonreceptorsystemen.
Doel van de studie
- Om Angiotensine II-receptoren anatomisch te lokaliseren in de hersenen.
- Om de receptorexpressie in hersensecties te kwantificeren.
- Om de implicaties voor neurodegeneratieve en cardiovasculaire ziekten te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Receptorautoradiografie met een jodium-125 gelabelde analoog.
- Histologische identificatie van hersenstructuren.
- Kwantitatieve densitometrische analyse.
- Opslag van hersenweefsels bij lage temperaturen voor conservering.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van hersengebieden die beïnvloed worden door Angiotensine II.
- Kwantitatieve gegevens over receptor-expressieniveaus.
- Inzichten in de functionele rollen van deze receptoren.
- Potentiële toepassingen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Conclusies
- De methode biedt een gedetailleerd inzicht in de lokalisatie van receptoren.
- Het verbetert de specificiteit van de receptoridentificatie in vergelijking met andere technieken.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan vorderingen in de behandeling van gerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Receptorautoradiografie maakt nauwkeurige anatomische mapping en kwantificering van de expressie van Angiotensine II-receptoren in hersenweefsel mogelijk, wat targetvalidatie in de neurofarmacologie en cardiovasculaire research ondersteunt. Deze methode levert kwantitatieve en kwalitatieve gegevens die essentieel zijn voor het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen met betrekking tot neurodegeneratieve en cardiovasculaire aandoeningen. Door functionele receptoren in situ te lokaliseren, biedt het informatie voor lead-identificatie en portfolio-prioritering voor modulatoren van het Ang II-pad.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de distributie van Ang II-receptoren in ziekte-relevante hersengebieden in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve bindingsgegevens om specifiek receptorcontact te onderscheiden van niet-specifiek contact.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door anatomische bevestiging van receptorexpressie via histologische co-registratie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten van receptorbinding die geschikt zijn voor assay-optimalisatie en compound-screening.
- Operationele waarde: Faciliteert de bereiding van gevalideerde weefselcoupes voor downstream farmacologische profilering.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt kwantitatieve densitometrie mogelijk ter ondersteuning van lead-identificatie en analyse van structuur-activiteitsrelaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt receptorlokalisatie aan functionele resultaten in gedrag, cognitie en cardiovasculaire regulatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door receptordichtheid te correleren met fysiologische responsen.
- Wetenschappelijke waarde: Informeert risicogestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling door hersengebieden te identificeren die waarschijnlijk therapeutische of bijwerkingen bemiddelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door receptorlokalisatiegegevens te leveren die hypothese-gestuurde screening en lead-optimalisatiecampagnes gericht op het Ang II-systeem sturen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door het identificeren van hersengebieden waar Ang II neurobehaviorale en cardiovasculaire functies moduleert.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare bindingsmetingen die essentieel zijn voor assay-standaardisatie en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt densitometrische analyse mogelijk om specifieke binding te kwantificeren en receptorexpressie tussen verschillende experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt receptorlokalisatie met preklinische continuïteit door expressiepatronen te koppelen aan functionele ziektemodellen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het karakteriseren van andere hormoonreceptorsystemen buiten Ang II, inclusief targets gerelateerd aan drugs van misbruik.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in Ang II-gemedieerde pathways te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde incubatie-, was- en kwantificatieprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de ontdekkingsfase anatomische en kwantitatieve receptorgegevens te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van target engagement in relevante hersencircuits.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met radioliganden, weefselcoupes en autoradiografietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot een cryostaat, autoradiografiefilm, beeldvormingssystemen en infrastructuur voor het beheer van radioactief afval.
- Vereist standaardisatie tussen de teams voor histologie, farmacologie en beeldvorming voor een consistente interpretatie van de gegevens.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op niet-hersenweefsels of alternatieve receptorsystemen.
- Bevat praktische beperkingen met betrekking tot veiligheidsprotocollen voor radioactiviteit, belichtingstijd en consistentie bij de filmontwikkeling.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Receptor Autoradiography Tissue Section Preparation
3:03
Receptor Autoradiography
5:35
Film Exposure and Development
6:49
Histology and Densitometric Image Analysis
8:44
Results: Representative Receptor Autoradiography Imaging and Specific Binding Assessment
10:38
Conclusion
