Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren
June 7th, 2016
Hier presenteren we een protocol om de lokalisatie van angiotensine II Type 1 receptoren in de hersenen van ratten te beschrijven door kwantitatieve, densitometrische, in vitro receptor autoradiografie met behulp van een jodium-125 gelabeld analoog van angiotensine II.
Het algemene doel van deze procedure is om Angiotensine II-receptorexpressie in hersensecties anatomisch te lokaliseren en te kwantificeren met behulp van receptor-autoradiografie en de histologische identificatie van hersenstructuren. Deze methode identificeert de hersengebieden waar Angiotensine II gedrag, cognitieve functie en het cardiovasculaire systeem beïnvloedt, en biedt inzichten voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van neurodegeneratieve en cardiovasculaire ziekten. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het kwantitatief, kwalitatief is en het mogelijk maakt om functionele receptoren voor Angiotensine II met grotere specificiteit te identificeren dan andere methoden.
Deze methode kan ook de functionaliteit van andere hormoonreceptorsystemen door het hele lichaam karakteriseren, zoals receptoren die gerelateerd zijn aan drugsmisbruik. Plaats de hersenweefsels onmiddellijk na het oogsten in hersenvormen die het binnenste van de schedel simuleren en wikkel de vormen in aluminiumfolie voor opslag bij min 20 graden Celsius. Breng de weefsels na 30 minuten over in een afsluitbare vrieszak en bewaar de zak bij min 80 graden Celsius.
Voor het doorsnijden verwijdert u voorzichtig de hersenen uit de hersenvorm. Om het hersenweefsel te doorsnijden, brengt u het specimen van belang over in een cryostat ingesteld tussen min 10 en min 18 graden Celsius. Wanneer het weefsel geëquilibreerd is naar de nieuwe temperatuur, gebruikt u een glycol- en harsgebaseerd medium om een klein deel van het specimen verticaal in een weefselmontage in te bedden om doorsneden van het coronale vlak mogelijk te maken.
Laad het weefsel op de microtoom en draai de montage stevig vast, begin vervolgens met het snijden van de hersenen op de gewenste dikte, en monteer vervolgens de secties op microscoopglazen in verticale richting om een groter oppervlak van het weefsel op het glas aan te brengen. Verzamel de secties in opeenvolgende sets van vijf. Wanneer alle secties zijn verzameld, laat de glazen tot een uur aan de lucht drogen.
Plaats vervolgens de monsters in een plastic glasdoos in een zelfsluitende vrieszak voor opslag bij min 20 graden Celsius. Om de monsters radioactief te labelen, verwijdert u de eerste en tweede glazen uit elke set van vijf en monteert u ze in commercieel verkrijgbare of 3D-geprinte glasklemmen. De afgevinkte één glazen zijn voor de niet-specifieke behandelingsgroep en de afgevinkte twee glazen zijn voor de totale behandelingsgroep.
Keer de glazen om in 35 tot 40 milliliter kamertemperatuur AM5 plus hun respectieve remmers in de juiste pre-incubatie Coplin-potten. Het uitvoeren van meerdere sets van glazen kan overweldigend zijn. Daarom is het uiterst belangrijk om de glazen met vier minuten intervallen in de pre-incubatiepotten te plaatsen om ervoor te zorgen dat er geen overlap is tijdens de droogstap.
Na 30 minuten brengt u de glazen over naar incubatie-slidemailers die 10 milliliter AM5 bevatten, aangevuld met de juiste concentratie van I125 SI Angiotensine II en de respectieve behandelingsgroepremmers, gedurende 60 tot 90 minuten bij kamertemperatuur. Het bepalen van de exacte concentratie van 125I SI Ang II is cruciaal om de Angiotensine II-receptoren te vergelijken van de ene dag naar de andere. Aan het einde van de incubatie, brengt u de glazen terug naar de glasklemmen, blokkeert u de glazen en draait u ze voorzichtig gedurende één tot twee seconden in twee aparte containers met 400 milliliter gedistilleerd water.
Na de tweede waterwas spoelt u de glazen met vier opeenvolgende een minuut wasbeurten in 30 tot 40 milliliter AM5. Na de vierde wasbeurt, draait u de secties voorzichtig gedurende één tot twee seconden in vier veranderingen van ijskoud gedistilleerd water. Gebruik vervolgens vier föhns ingesteld op verschillende hoeken om de glazen gedurende vier minuten te drogen met koude lucht.
Wanneer alle secties droog zijn, brengt u de glazen over op een papieren handdoek. Gebruik vervolgens dubbelzijdig plakband om de glazen te monteren, weefselzijde omhoog, op een stuk karton voor röntgenfilm op positie en inclusief ten minste één jodium 125 kalibratiestandaardglas per groep. Om de secties bloot te stellen, plaatst u de kartonnen glazen in een donkere kamer in een röntgencassette met een riem en zet u de lichten uit.
Zet het veiligheidslicht aan en open voorzichtig een doos röntgenfilm. Plaats één film, glanzende kant omhoog met de gekartelde rand in de rechter benedenhoek, bovenop de glazen in de cassette. Sluit vervolgens de cassette voorzichtig met de vergrendelingsstaven om licht te voorkomen en bewaar de cassette bij min 20 graden Celsius.
Na de juiste belichtingsperiode, brengt u de film over in ontwikkelaarsoplossing gedurende twee minuten gevolgd door 30 seconden in stopbad, dubbel gedistilleerd water met azijnzuur en vervolgens vijf minuten in fixeeroplossing. Was de film in een bak met stromend water gedurende 20 minuten. Breng het over in een oppervlakteactieve stof gedurende ongeveer 10 seconden en hang de film om te drogen.
Voor histologische analyse van de hersenweefselsecties, ontdooit u de afgevinkte drie secties in een glazenrek. Was vervolgens de secties in gedeïoniseerd water gedurende één minuut gevolgd door een 10 minuten incubatie in thionine-kleuroplossing en drie doppen in één gedeïoniseerd watercontainer. Dompel de glazen onder voor een extra 30 seconden gedeïoniseerd water wassen.
Was vervolgens de glazen in opeenvolgende ethanol-wassen zoals aangegeven. Na de laatste 100% ethanol-was, was de glazen in twee containers xyleen gedurende drie en vijf minuten achter elkaar. Aan het einde van de tweede xyleen-was, bedekt u de bovenrand van één glas per keer met een harsbasis, anorganisch oplosmiddel montagemedium.
Monteer 24 bij 60 millimeter dekglasjes op de glazen en laat de glazen 48 uur drogen. Scan vervolgens de glazen en film in de computer op 2400 DPI grijswaarden. Om de film te analyseren door densitometrie, omcirkelt u na het scan
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de lokalisatie en kwantificering van Angiotensine II Type 1 receptoren in de hersenen van ratten met behulp van in vitro receptor autoradiografie. De methode biedt inzicht in de hersengebieden die door Angiotensine II worden beïnvloed, wat cruciaal is voor het begrijpen van de rol ervan in gedrag en cardiovasculaire functie.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Receptorbiologie
- Cardiovasculair onderzoek
Achtergrond
- Angiotensine II is betrokken bij verschillende fysiologische processen.
- Inzicht in de receptorlokalisatie kan therapeutische strategieën informeren.
- Deze methode maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse mogelijk.
- Het kan ook worden toegepast op andere hormoonreceptorsystemen.
Doel van het onderzoek
- Om Angiotensine II receptoren anatomisch in de hersenen te lokaliseren.
- Om de receptorexpressie in hersensneden te kwantificeren.
- Om de implicaties voor neurodegeneratieve en cardiovasculaire ziekten te verkennen.
Gebruikte methoden
- Receptor autoradiografie met jodium-125 gelabeld analoog.
- Histologische identificatie van hersenstructuren.
- Kwantitatieve densitometrische analyse.
- Opslag van hersenweefsels bij lage temperaturen voor bewaring.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van hersengebieden beïnvloed door Angiotensine II.
- Kwantitatieve gegevens over receptorexpressieniveaus.
- Inzichten in de functionele rollen van deze receptoren.
- Mogelijke toepassingen bij het ontwikkelen van nieuwe therapieën.
Conclusies
- De methode biedt een gedetailleerd begrip van receptorlokalisatie.
- Het verbetert de specificiteit van receptoridentificatie in vergelijking met andere technieken.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan vorderingen in de behandeling van gerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Receptor autoradiography enables precise anatomical mapping and quantification of Angiotensin II receptor expression in brain tissue, supporting target validation in neuropharmacology and cardiovascular research. This method provides quantitative and qualitative data essential for de-risking therapeutic hypotheses related to neurodegenerative and cardiovascular diseases. By localizing functional receptors in situ, it informs lead identification and portfolio prioritization for Ang II pathway modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping Ang II receptor distribution in disease-relevant brain regions.
- Operational Value: Provides quantitative binding data to distinguish specific from non-specific receptor engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through anatomical confirmation of receptor expression via histological co-registration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible receptor binding readouts suitable for assay optimization and compound screening.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated tissue sections for downstream pharmacological profiling.
- Scientific Value: Enables quantitative densitometry to support lead identification and structure-activity relationship analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links receptor localization to functional outcomes in behavior, cognition, and cardiovascular regulation.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating receptor density with physiological responses.
- Scientific Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying brain regions most likely to mediate therapeutic or adverse effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing receptor localization data that guides hypothesis-driven screening and lead optimization campaigns targeting the Ang II system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying brain regions where Ang II modulates neurobehavioral and cardiovascular functions.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding measurements essential for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables densitometric analysis to quantify specific binding and compare receptor expression across experimental conditions.
- Translational Research: Connects receptor localization to preclinical continuity by linking expression patterns to functional disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing other hormone receptor systems beyond Ang II, including targets related to drugs of abuse.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in Ang II-mediated pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined incubation, washing, and quantification protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing anatomical and quantitative receptor data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on target engagement in relevant brain circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radioligand handling, tissue sectioning, and autoradiography techniques.
- Dependent on access to cryostat, autoradiography film, imaging systems, and radioactive waste management infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between histology, pharmacology, and imaging teams for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-brain tissues or alternative receptor systems.
- Includes practical limitations related to radioactivity safety protocols, exposure timing, and film development consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Receptor Autoradiography Tissue Section Preparation
3:03
Receptor Autoradiography
5:35
Film Exposure and Development
6:49
Histology and Densitometric Image Analysis
8:44
Results: Representative Receptor Autoradiography Imaging and Specific Binding Assessment
10:38
Conclusion
