Name: Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer receptorautoradiografie voor de lokalisatie en kwantificering van angiotensine II-receptoren in de hersenen van ratten. Deze methode biedt inzicht in hersengebieden die gedrag en cardiovasculaire functie beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant HL-113905

Alle dierlijke procedures voor deze studie uitgevoerd werden in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Nova Southeastern University, 8 e editie (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ). 1. Voorbereiden Tissue Secties voor Receptor Autoradiography <ol><li> Bij het offer, oogst verse hersenweefsel, en wikkel in aluminiumfolie en plaats in een -20 ° C vriezer zo snel mogelijk. Om de juiste vorm te behouden, plaats de hersenen in de hersenen schimmel die de binnenkant van de schedel simuleert, wikkel in aluminiumfolie en plaats in een - 20 ° C vriezer. Na 30 min, plaats weefsels in een afsluitbare zak en vriezer naar een -80 ° C vriezer voor langdurige opslag. <ol><li> Haal de bevroren weefselspecimen plaats van de -80 ° C vriezer, en overbrengen in een cryostaat ingesteld op een minimum van -10 ° C en ten hoogste -18 ° C, om te voorkomen ontdooien. </li&gt; <li> Plaats het monster op het weefsel houder met een glycol en harsbasis inbeddingmedium, Insluiten alleen een klein deel van het monster in het medium. Voor de hersenen, wordt de hersenen verticaal gemonteerd in staat te stellen het snijden in het frontale vlak. </li></ol></li><li> Plaats het weefsel monteren op de microtoom binnen de cryostaat en stevig vast op zijn plaats. Zorgen de linker- en rechterkant van de hersenen dezelfde antero-postero coördinaten en de dorso-ventrale as loodrecht op gebruikte atlassen hersenen. </li><li> Gaan knippen op de gewenste dikte (20 um aanbevolen) en ontdooien monteer de secties op objectglaasjes in een verticale richting naar een groter oppervlak van de ruimte in de schuif hebben. Verzamel secties op objectglaasjes in opeenvolgende groepen van vijf, dat wil zeggen de eerste reeks dia gelabeld 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 en 1-5 (figuur 3). </li><li> Na het invullen van een reeks dia met secties, laat dia&#39;s aan de lucht drogen voor maximaal 1 uur, plaats dan de slides in een plastic dia doos in een zelfdichtende vriezer opbergtas, en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 2. Receptor Autoradiografie LET OP: De radioactiviteit. Gebruik beschermende kledij om radioactiviteit te behandelen. Verwijdering wordt afhing van vestiging, en moeten richtlijnen te volgen om goed te vervallen (halfwaardetijd 60 dagen) of worden opgepikt door een gecertificeerd bedrijf. <ol><li> Verwijder de &quot;-1&quot; en &quot;-2&quot; dia&#39;s van de belangstelling van de -20 ° C vriezer en monteer in slide grepen (Figuur 5). Monteer de &quot;-1&quot; slides samen voor &#39;niet-specifieke&#39; behandeling en de &#39;-2&#39; slides voor &#39;totale&#39; behandeling. &#39;Niet-specifieke&#39; potten zal 10 pM uiteindelijke concentraties van PD123319 een bevatten AT 2 R-antagonist, en losartan een AT 1 R-antagonist, in testmedium buffer (AM5) (tabel 1), de &#39;totale&#39; binding potjes bevat alleen 10 uM PD123319 in AM5. </li><li> Keren de diagrepen de dia&#39;s in het pre-incubatie Coplin potten gevuld met 35-40 ml AM5 en respectievelijke inhibitoren plaats gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Begin volgende sets hun voorincubatie bad bij 4 min intervallen. </li><li> Onmiddellijk overdracht dia&#39;s uit de pre incubatieoplossing de incubatie slide mailers gemaakt met 10 ml AM5, plus een vooraf bepaalde concentratie van 125I-SI-Ang II (berekend figuur 4) met de respectieve remmers gedurende 60-90 minuten bij kamertemperatuur temperatuur. Bij voldoende radioligand, kunnen 10 slides worden geplaatst (rug aan rug) in gewijzigde Preparaathouders en geïncubeerd met 125I-SI-Ang II Coplin potten. </li><li> Plaats schuift terug in de slede grepen (indien nodig), blot en spoel onder voorzichtig schudden gedurende 1-2 seconden in 400 ml gedestilleerd water in twee afzonderlijke houders. </li><li> Breng de dia achtereenvolgens in vier Coplin potten met 35-40 ml AM5 gedurende precies 1 min ieder (zie figuur 4 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Na de laatste 1 min spoelen, zachtjes swirl de secties voor 1-2 sec in vier veranderingen in ijskoud gedestilleerd water. </li><li> Föhnen van de dia&#39;s met koele lucht (Let op: hete lucht volatizes de radioactieve stof) met behulp van vier föhn opgezet vanuit verschillende hoeken voor 4 min (Figuur 5), totdat alle onderdelen droog zijn, plaats dan op een papieren handdoek. </li><li> Mount dia&#39;s met de weefsels naar boven op een karton voor bijstelling naar X-ray film met behulp van dubbelzijdig plakband. </li><li> Mount tenminste één, 125 Jodium kalibratiestandaard dia op elk karton (figuur 6). Opmerking: Kalibratienormen bestaan ​​uit de hersenen pasta grondig gemengd met 125 Jodium gebonden aan een verbinding die een fenol ring, verdicht door centrifugatie in een 1 ml tuberculine spuit, dat cryostaat coupes dezelfde dikte als de hersencoupes en ontdooien gemonteerd op microscoop slides. Als alternatief, 125 ik kalibratie normenkunststofhars coupes 20 urn dikte kan commercieel verkregen worden. De kunststof hars in deze normen beschermt gedeeltelijk de film uit de straling zodanig dat een weefsel gelijkwaardigheid van ~ 40% moet worden verwerkt in de kalibratie. </li></ol> 3. Film Exposure and Development <ol><li> Overgaan tot een donkere kamer met een strap-back röntgencassettehouder en autoradiografie film. Open de cassette en plaats het karton met glijbanen binnen (figuur 6). <ol><li> Doe het licht uit en zet de safelight. Open voorzichtig de doos van X-Ray film, verwijder dan één film, en plaats de film glanzende zijde naar boven (met de scherpe rand aan de rechterbenedenhoek) op de top van de dia&#39;s in de cassette. Sluit voorzichtig de cassette, en draai de vergrendeling bars voor het afdichten van het licht (Figuur 6). Expose de dia&#39;s voor enkele dagen tot enkele weken bij -20 ° C. </li></ol></li><li> In de donkere kamer, opent u de cassette en door te gaan met de film ontwikkelen process. <ol><li> Zet de objectglaasjes in de bakken na elkaar; ontwikkelaar 2 min, water dat 5% ijsazijn gedurende 30 sec, en fixeer 5 min. De films worden de geplaatst in een bak met stromend water gedurende 20 min, vervolgens in Photoflo niet langer dan 10 seconden en hing. Opmerking: De belichtingstijd wordt empirisch bepaald en kan meerdere films met verschillende belichtingstijden omvatten: lang genoeg om meetbare signalen uit gebieden met lage bindingsaffiniteit te verkrijgen, maar niet zo lang dat de film verzadigen door gebieden met een hoge bindingsaffiniteit. Zodra aanvaardbare risico&#39;s worden verkregen, ga dan naar de volgende stap. </li></ol></li></ol> 4. Histologie <ol><li> Bereid de thionine vlek en kleurstoffen (tabel 2, figuur 7). <ol><li> Plaats de &quot;-3&quot; in de slede-rek en overschrijving volgorde beginnend met gedemineraliseerd water gedurende 1 min, vervolgens thionine vlek gedurende 10 minuten gevolgd door drie onderdompelingen in Deionized wateren, en een 30 sec wassen in gedemineraliseerd water. </li><li> Naar aanleiding van het water, plaats de dia rek in ethanol wast als volgt; 50%, 70% en 90% gedurende 30 seconden, gevolgd door twee wasbeurten ethanol bij 100% gedurende 1 min elk. Tenslotte zet de schuif rek in xyleen gedurende 3 min, vervolgens over naar een tweede xyleen oplossing gedurende 5 min. </li></ol></li><li> Verwijder een dia in een tijd van de laatste xyleen bad, en hebben betrekking op de bovenste rand van de dia met een hars base in een organisch oplosmiddel montage medium, en plaats een 24 mm x 60 mm dekglaasje op de dia. Laat dia&#39;s voldoende droog voor ~ 48 uur en vervolgens te scannen naar de computer op 2400 dpi grijstinten. </li></ol> 5. Densitometrische Beeldanalyse <ol><li> Plaats de film glimmende kant naar beneden, met de scherpe rand aan de linker onderhoek en scannen met behulp van een eigen scanner in staat is het verzenden van de informatie film dichtheid zonder enige vervorming in de imaging-systeem computer. </li><li> Open de eigen beeldvorming system en gebruik maken van de kalibratie bars om de kalibratie normen vast te stellen voor toekomstige densitometrische analyse van de beelden op de film (figuren 9-12). </li><li> Maatregel gebieden van belang door ofwel de oprichting van een sjabloon of empirisch waarin de gebieden van belang. De gegevens worden verzameld en de gescheiden op basis van film, ofwel controle of wild-type (sectie), en de regio. Zorg ervoor dat de dichtheid (fmol / g), scan-gebied, en de totale doelgebied in de metingen omvatten (Figuur 9). <ol><li> Pas scangebied bars door ervoor te zorgen dat de regio van belang valt tussen parameters van aandacht voor (Figuur 10). </li><li> Exporteer gegevens in een spreadsheet (tabel 4). Vermenigvuldig de dichtheid maal de totale doelgebied, dan delen door het scangebied om de waarde voor de binding van die specifieke gebied te verkrijgen. Zodra dit is gedaan om alle waarden gemeten, substraat de gevestigde niet-specifieke van total tot de specifieke binding p opleverenkwalijk. Gemiddelden kan ook worden uitgevoerd voor deze waarden. </li></ol></li></ol>

Robert Speth heeft antilichamen voor angiotensine II-receptoren in licentie gegeven aan een commerciële leverancier en ontvangt royalty's van de verkoop van genoemde antilichamen. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol beschreven identificeert de visualisatie van &quot;totale&quot; en &quot;niet-specifieke&quot; binding van de radioligand in aangrenzende secties van coronale secties van een knaagdierhersenen eerder geoogst en opgeslagen bij -80 ° C, en kan goed toepasbaar op vrijwel elk weefsel dat heeft anatomisch opgelost substructuren die differentiële bedragen van receptoren of radioligand bindende websites. De beschreven binnen het protocol procedures zijn eenvoudig en de analyse is van cruciaal belang voor de juiste...

Hart- en vaatziekten nog steeds de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit in de Verenigde Staten, waardoor meer dan 30% van de sterfgevallen in de VS in 2011 1. De meest recente statistieken van de American Heart Association geven aan dat meer dan één op de drie mensen heeft één of meer typen van cardiovasculaire ziekte. Cardiovasculair onderzoek blijft stappen te maken tegen het begrijpen van deze ziekte, maar als de generaties beginnen ouder is het noodzakelijk om deze inspanningen voort te zetten. Het renine-angiotensine systeem (RAS) speelt een centrale rol in de regulatie van het cardiovasculaire systeem voornamelijk door het bevorderen atherosclerose, ontsteking, systemische vasoconstrictie en activatie van het sympathische zenuwstelsel (figuur 1) 2-8. RAS is een hormonaal systeem dat wordt geactiveerd wanneer juxtaglomerulaire cellen in de nier scheiden renine in de bloedstroom in reactie op verlaagde bloeddruk, verhoogde sympathetic stimulatie, of verlaagd natrium stroom door de macula densa. Renine metaboliseert angiotensinogeen (gesynthetiseerd in de lever) op angiotensine I (Ang I) te vormen. Ang I wordt vervolgens gemetaboliseerd door angiotensine omzettend enzym (ACE), een ecto-enzym aan de luminale zijde van vasculaire endotheliale cellen, voornamelijk in de longen en de nieren, in angiotensine II (Ang II), de belangrijkste effector RAS peptide te vormen. Ang II kan activeren twee receptorsubtypen; type 1 receptor (AT 1 R) en type 2 receptor (AT 2 R), welke beide het cardiovasculaire systeem reguleren, onderhouden vocht en elektrolyten homeostase en wordt nu beschouwd als cognitieve functies en neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden verwerkt 8,9. Een lokale, brain-specifieke RAS wordt gemeld om zelfstandig te synthetiseren Ang II. In de hersenen, wordt het precursoreiwit angiotensinogen gesynthetiseerd in astroglia 10 omgezet Ang I een renine enzym 3, eventueel prorenin gebonden aan de receptor prorenin11, en ​​vervolgens omgezet in Ang II-ACE die overvloedig op het extracellulaire oppervlak van neuronen tot expressie wordt gebracht in de hersenen 12. Dit intrabrain gegenereerd Ang II is de agonist voor de hersenen AT 1 en AT 2-receptoren die worden geïsoleerd uit bloed overgedragen Ang II. Terwijl de AT 1 R een belangrijke fysiologische rol speelt, is beter bekend om de pathofysiologische effecten in het lichaam, vooral die de cardiovasculaire systeem en de nieren (afbeelding 2). Wanneer Ang II aan de AT 1 R bindt, veroorzaakt vasoconstrictie; toenemende weerstand tegen de bloedstroom en de bloeddruk te verhogen. Het bevordert ook de synthese en uitscheiding van aldosteron en vasopressine, leidt tot verhoogde natrium- en waterretentie. Deze effecten kunnen induceren ischemische hersenschade en cognitieve stoornissen die verband houdt met de ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer en Diabetes, alsmede zijn recent geïdentificeerd beïnvloeden leren en geheugen 13-15. Er is een terugkoppellus in het RAS, dat AT 1 R op de juxtaglomerulaire cellen in de nier remt renine secretie. Interessant is dat de AT 2 R algemeen tegen regelt de werking van AT 1 R, waardoor vasodilatatie, neurietuitgroei, axonale regeneratie, anti-proliferatie en cerebroprotection onder vele anderen 16-20. De AT 2 R is ook geïdentificeerd als een doelwit voor anti-hypertensie en recent, antikankergeneesmiddelen 21. Het bepalen van de lokalisatie en concentratie van Ang II receptoren in verschillende weefsels en hoe ze worden beïnvloed door verschillende behandelingen en ziektetoestanden met behulp van kwantitatieve densitometrische receptor autoradiografie helpt onthullen de rol speelt in de RAS specifieke ziekten. Receptor autoradiografie is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een effectieve methode voor het aangeven van de aanwezigheid van angiotensine II receptoren en andere componenten van de RAS in de hersenen en andere weefsels van de rat, muis, cavia, hond en mens onder verschillende experimentele omstandigheden 22-34. Het belang van het vinden Ang II receptoren in de hersenen is dat één functionele neuroanatomy kunnen toepassen op de werking van angiotensine II in de hersenen, bijvoorbeeld de aanwezigheid van AT 1 R in de paraventriculaire kern van de hypothalamus (PVN) suggereert een functie van Ang II in de hersenen vasopressine, oxytocine of corticotropine releasing hormoon (CRH) afgifte of activering van het sympathische zenuwstelsel stimuleren. Aldus geneesmiddelen die de AT 1 R blokkeren kunnen sommige PVN gemedieerde effecten geassocieerd met overactiviteit van de hersenen RAS verlagen. Werk in uitvoering suggereert dat het gebruik van AT 1 R-antagonisten Post-Traumatische Stress Stoornis (PTSS) geïnduceerde afgifte van CRH kan verminderen en verbeteren van de symptomen van PTSS (Hurt et al., Ingediend voor publicatie). De PVN, subfornicaleorgel (SFO), en de amygdala zijn bekend voor de regulering van homeostase, honger / dorst, slaap, geheugen, emotionele reacties, en zijn de doelgebieden van deze demonstratie studie. Deze gebieden werden onderzocht door het verzamelen van coronale secties van hersenen op microscoopglaasjes, en behandelen van de secties met specifieke remmers samen met een specifiek radioligand voor Ang II receptoren. In deze studie, alle materialen en reagentia met voorgestelde leveranciers staan, jodium-125 werd gebruikt om een angiotensine II receptor antagonist, sarcosine 1, isoleucine 8 Ang II (SI Ang II), dat vervolgens werd gezuiverd zoals de mono 125I radioactief te -SI Ang II onder toepassing van HPLC methodes zoals eerder 35 beschreven. Het gebruik van deze hoge specifieke activiteit radioligand maakt de visualisatie van gebieden van lage, matige en hoge receptordichtheid na blootstelling van de radioactief gemerkte secties röntgenfilm. Door het kalibreren van de film met de hersenen plakken normen die bekende hoeveelheden jodium-125, het specifieke bedragvan Ang II receptor binding in een gebied kunnen worden gekwantificeerd. In experimentele studies, kunnen de angiotensine II receptor binding in de hersenen van proefpersonen worden vergeleken met die in de hersenen van controlepersonen. Dit kan aangeven of het optreden van Ang II worden gewijzigd als reactie op een genetische aandoening, fenotypische afwijking, ziekte of behandeling met geneesmiddelen. Deze kennis kan vervolgens worden toegepast op de ontwikkeling van therapieën voor ziekten geassocieerd met ontregeling van het RAS behandelen. Alternatieve technieken receptorbindingsplaatsen identificeren, maar met beperkte anatomische resolutie, bindingsonderzoeken die weefselmembraan preparaten uit weefsel homogenaten, die zijn geïncubeerd met het radioligand over een bereik van concentraties radioligand bindingsaffiniteit als de dissociatieconstante beoordelen gebruiken (KD ) en maximaal bindingsvermogen (B max) van het weefsel van belang. De hier beschreven protocol kunnen worden onderverdeeld in 5 grote components: Het voorbereiden van coupes voor Receptor Autoradiography; Receptor Autoradiografie; Film belichting en ontwikkeling; histologie; en Densitometrische Image Analysis.

<table><tbody><tr><td>500 ml Plastic Beakers</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Coverslips</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm</td><td>Carestream-Biomax MR Film</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin (van Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>Kartonplaat 8 x 11</td><td>Crescent Illustration Board #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Potten</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Commerciële haardrogers</td><td>Conair</td><td>Model SD6X</td><td></td></tr><tr><td>Enkelvoudig te gebruiken kweekbuisjes</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Dinatriumzout, Dihydraat)</td><td>USB Corporation</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>16-100-210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vervangingsformule voor D-19 Ontwikkelaar</td><td>Photographers Formulary, Inc.&nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>Glazuur Azijnzuur</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep/OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Film Fixer</td><td>Kodak</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>Photo flo</td><td>Kodak</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>Losartan</td><td>Fisher/Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&trade; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Diagrips</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Charged Slides, Fine Ground Edge</td><td>Premiere Microscope Slides</td><td>9308W</td><td></td></tr><tr><td>125I Liganden</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>125SI-Ang II&nbsp;</td><td>George Washington University</td><td>Geradiojodeerd door Dr. Speth</td><td></td></tr><tr><td>Slide Mailers</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdibasisch Fosfaat Anhydrous (Na2PO4)</td><td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat (Anhydrous)</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Tionine&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>X-Ray Casette (10 x 12)</td><td>Spectronics Corporation</td><td>Four Square</td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

receptor autoradiografie protocol voor de gelokaliseerde visualisatie van angiotensine ii-receptoren

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Dit protocol beschrijft receptor bindende patronen voor angiotensine II (Ang II) in de rattenhersenen met een radioligand specifiek voor Ang II receptoren receptor autoradiografische mapping uitvoert. Weefselmonsters geoogst en opgeslagen bij -80 ° C. Een cryostaat wordt gebruikt om coronaalwaarts sectie van het weefsel (hersenen) en dooi-mount de secties op geladen dia&#39;s. De slide gemonteerde weefselcoupes worden uitgebroed in 125 I-SI-Ang II naar Ang II receptoren radioactief te merken. Aangrenzende glijbanen zijn gescheiden in twee groepen: &quot;niet-specifieke binding (NSP) in aanwezigheid van een receptor verzadigende concentratie van niet- radioactief gemerkt Ang II, of een AT 1 Ang II receptor subtype (AT 1 R) selectieve angiotensine II receptorantagonist en &#39;totale binding&#39; zonder AT 1 R antagonist. Een verzadigende concentratie van 2 Ang II receptor subtype (AT 2 R) antagonist (PD123319, 10 uM) is ook aanwezig in de incubatiop buffer te beperken 125 I-SI-Ang II binding aan de AT 1 R subtype. Gedurende een 30 min pre-incubatie bij ~ 22 ° C, NSP objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319 en losartan, terwijl &#39;de totale binding&#39; objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319. Objectglaasjes worden vervolgens geïncubeerd met 125I-SI-Ang II in aanwezigheid van PD123319 voor &#39;totale binding&#39; en PD123319 en losartan voor NSP in assay buffer, gevolgd door verscheidene &quot;wassingen in buffer, water en zout en niet- verwijderen specifiek gebonden radioligand. Droog de glaasjes gebruikt blow-drogers, vervolgens blootgesteld aan autoradiografie film met een speciale folie en cassette. De film wordt ontwikkeld en de beelden worden gescand in een computer voor visuele en kwantitatieve densitometrie behulp van een eigen imaging-systeem en een spreadsheet. Een extra set van dia&#39;s worden thionine-gekleurd voor histologische vergelijkingen. Het voordeel van autoradiografie receptor is de mogelijkheid om te visualiserenAng II receptoren in situ binnen een sectie van een weefselspecimen en anatomisch bepalen het gebied van het weefsel door het te vergelijken met een aangrenzend histologische referentiesectie.

Het overzicht van de metabole route van het renine-angiotensine-systeem is getoond in figuur 1 en de directe aandacht voor de angiotensine II-receptor subtypen (AT1 R en AT 2R) is beschreven in figuur 2. Figuur 3 toont de overdracht van coronale hersenen delen op microscoopglaasjes, die vervolgens worden geleid door een receptor autoradiografie werkwijze volgens een vooraf bepaalde 125I-siang II concentra...

Hier presenteren we een protocol om de lokalisatie van angiotensine II Type 1 receptoren in de hersenen van ratten te beschrijven door kwantitatieve, densitometrische, in vitro receptor autoradiografie met behulp van een jodium-125 gelabeld analoog van angiotensine II.

Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van de Angiotensine II-receptor anatomisch te lokaliseren en te kwantificeren in hersencoupes middels receptorautoradiografie en de histologische identificatie van hersenstructuren. Deze methode identificeert de hersengebieden waar Angiotensine II invloed heeft op het gedrag, de cognitieve functie en het cardiovasculaire systeem, wat inzichten biedt voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van neurodegeneratieve en cardiovasculaire aandoeningen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze kwantitatief en kwalitatief is, en dat het de identificatie van functionele receptoren voor Angiotensine II met een grotere specificiteit mogelijk maakt dan andere methoden.Deze methode kan ook de functionaliteit van andere hormoonreceptorsystemen in het hele lichaam karakteriseren, zoals receptoren die gerelateerd zijn aan drugs van misbruik. Plaats het hersenweefsel direct na het oogsten in hersenvormen die de binnenkant van de schedel simuleren en wikkel de vormen in aluminiumfolie voor opslag bij -20 °C. Na 30 minuten worden de weefsels overgebracht naar een afsluitbare vrieszak en wordt de zak bewaard bij -80 °C.Verwijder vóór het snijden voorzichtig de hersenen uit de hersenvorm. Om het hersenweefsel te snijden, plaatst u het betreffende specimen in een cryostaat die is ingesteld tussen -10 en -18 °C. Wanneer het weefsel is geëquilibreerd aan de nieuwe temperatuur, gebruikt u een medium op basis van glycol en hars om een klein gedeelte van het specimen verticaal in een weefselhouder in te bedden, zodat snijden in het coronale vlak mogelijk is.Plaats het weefsel op de microtoom en draai de houder stevig vast, begin vervolgens met het snijden van de hersenen in de gewenste dikte en monteer de coupes in verticale oriëntatie op microscoopglaasjes, zodat een groter oppervlak van het weefsel contact maakt met het glaasje. Verzamel de coupes in opeenvolgende sets van vijf. Wanneer alle coupes zijn verzameld, laat u de glaasjes tot een uur aan de lucht drogen.Plaats de monsters vervolgens in een plastic objectglassendoos in een zelfsluitende vrieszak voor bewaring bij -20 °C. Om de preparaten radioactief te labelen, verwijdert u het eerste en tweede objectglas van elke set van vijf en monteert u deze in commercieel verkrijgbare of 3D-geprinte objectglashouders. De -1 glazen zijn bedoeld voor de niet-specifieke behandelgroep en de -2 glazen voor de totale behandelgroep.Keer de preparaten om in 35 tot 40 milliliter kamertemperatuur AM5 met de respectievelijke inhibitoren in de geschikte Coplin-potten voor pre-incubatie. Het verwerken van meerdere sets preparaten kan overweldigend zijn. Daarom is het uiterst belangrijk om de preparaten met intervallen van vier minuten in de pre-incubatiepotten te plaatsen om er zeker van te zijn dat er geen overlap optreedt tijdens de droogstap.Breng de objectglazen na 30 minuten over naar incubatiebakjes voor objectglazen die 10 milliliters AM5 bevatten, aangevuld met de juiste concentratie I125 SI Angiotensine II en de respectievelijke remmers van de behandelgroep, voor 60 tot 90 minuten bij kamertemperatuur. Het bepalen van de exacte concentratie 125I SI Ang II is cruciaal om de Angiotensine II-receptoren van dag tot dag te kunnen vergelijken. Keer de objectglazen na de incubatie terug naar de objectglashouders, blokkeer de objectglazen en zwenk ze voorzichtig gedurende één tot twee seconden in twee afzonderlijke containers met 400 milliliters gedestilleerd water.Na de tweede wasbeurt met water worden de glaasjes gespoeld met vier opeenvolgende wasbeurten van één minuut in 30 tot 40 milliliters AM5. Na de vierde wasbeurt worden de coupes voorzichtig één tot twee seconden rondgedraaid in vier opeenvolgende spoelingen met ijskoud gedestilleerd water. Gebruik vervolgens vier blaasdrogers onder verschillende hoeken om de glaasjes vier minuten lang te drogen met koele lucht.Wanneer alle coupes droog zijn, worden de objectglaasjes overgebracht naar een papieren handdoek. Gebruik vervolgens dubbelzijdige tape om de objectglaasjes, met de weefzijde naar boven, te bevestigen op een stuk karton voor röntgenfilm op de juiste positie, inclusief ten minste één kalibratiestandaard-objectglasje met jodium-125 per groep. Om de coupes te belichten op film, worden de objectglaasjes op het karton in een donkere kamer in een röntgen cassette met klembeugel geplaatst en worden de lichten uitgeschakeld.Schakel het veiligheidslicht in en open voorzichtig een doos röntgenfilm. Plaats één film met de glanzende zijde naar boven en de gekartelde rand in de rechteronderhoek bovenop de objectglaasjes in de cassette. Sluit vervolgens de cassette voorzichtig door de vergrendelingsstangen te draaien om licht buiten te sluiten en bewaar de cassette bij -20 °C.Na de juiste belichtingsperiode wordt de film gedurende twee minuten in de ontwikkelaar geplaatst, gevolgd door 30 seconden in het stopbad (dubbel gedestilleerd water met azijnzuur) en vervolgens vijf minuten in de fixeeroplossing. Was de film gedurende 20 minuten in een bak met stromend water. Plaats de film vervolgens ongeveer 10 seconden in een surfactant en hang de film op om te drogen.Ontdooi voor histologische analyse van de hersenweefselcoupes de drie coupes in een objectglasrek. Was de coupes vervolgens gedurende één minuut in gedeïoniseerd water, gevolgd door een incubatie van 10 minuten in thionine-kleuringsoplossing en drie dips in een reservoir met gedeïoniseerd water. Dompel de objectglazen voor een extra wasstap van 30 seconden onder in gedeïoniseerd water.Was de objectglazen vervolgens in opeenvolgende ethanolwasbeurten zoals aangegeven. Na de laatste wasbeurt met 100% ethanol, worden de objectglazen in twee bakken met xyleen gewassen, respectievelijk drie en vijf minuten lang. Aan het einde van de tweede xyleenwasbeurt wordt de bovenrand van elk objectglas afzonderlijk bedekt met een harsenbase, een anorganisch oplosmiddel voor het montage-medium.Bevestig dekglasplaten van 24 bij 60 millimeter op de objectglazen en laat de objectglazen 48 uur drogen. Scan vervolgens de objectglazen en de film in de computer in grijswaarden bij 2400 DPI. Om de film via densitometrie te analyseren, bakent u na het scannen empirisch de gebieden van belang op elke film af.Dit is de pseudokleurenafbeelding die is gegenereerd na het openen van de gescande film in het beeldanalyseprogramma. Neem de dichtheid, het scangebied en het totale doelgebied op in de metingen. Pas de balken van het scangebied aan om er zeker van te zijn dat elk interessegebied binnen de parameters van de markering valt.Exporteer vervolgens de gegevens naar een spreadsheet om de specifieke binding voor elk monster te bepalen. De eenheden van de kalibratiestandaard voor kwantificering worden bepaald op basis van de datum waarop de assay is uitgevoerd. Na het scannen van de films worden de kalibratiewaarden gebruikt om een curve te genereren op basis van de variërende concentraties van jodium 125-standaarden voor die specifieke film.De kalibratie- en standaardwaarden worden in drievoud geregistreerd voor de nauwkeurigheid. De onderscheiden tussen de aspecifieke binding en de totale groepen, evenals de weefseletiketten, worden vastgesteld door elke dataset toe te wijzen aan de overeenkomstige subgroepen. Een hogere drempelwaarde moet worden ingesteld door de parameters van rood naar zwart aan te passen, terwijl de lagere drempelwaarde dicht bij nul moet worden ingesteld om een nauwkeurigere meting van het gehele gescande interessegebied mogelijk te maken.Hier worden bijvoorbeeld de definitieve gemeten oppervlakten van de paraventriculaire kern van de hypothalamus in de groepen voor totale binding versus aspecifieke binding vergeleken met een met thionine gekleurde sectie ter anatomische bevestiging. Aspecifieke binding is de hoeveelheid radioligand die gebonden is aan andere receptoren dan Angiotensine-receptoren in aanwezigheid van een verzadigende concentratie van een niet-radioactief Angiotensine I-receptorligand, terwijl totale binding de hoeveelheid gebonden radioligand is bij afwezigheid van een niet-radioactief Angiotensine I-receptorligand. De waarden voor aspecifieke binding kunnen vervolgens van de waarden voor totale binding worden afgetrokken om de waarden voor specifieke binding van de Angiotensine I-receptoren te verkrijgen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan de stap van receptorautoradiografie in ongeveer vier uur worden voltooid, terwijl de stap van filmontwikkeling ongeveer 30 minuten per film in beslag neemt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de tijd nauwkeurig bij te houden om te garanderen dat alle coupes precies gedurende dezelfde periode worden geïncubeerd, gespoeld en gedroogd. Na deze procedure kunnen aanvullende studies naar de hersenmorfologie worden uitgevoerd om de veranderingen in de grootte van de regio's met Angiotensine II-receptor-expressie te evalueren.Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de receptorfarmacologie om te bepalen hoe verschillende hersengebieden worden beïnvloed door diverse neurohormonen, neurotransmitters en geneesmiddelen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u met succes een receptorautoradiografie-assay uitvoert, coupes histologisch kleurt en autoradiogrammen evalueert om receptoren in specifieke hersengebieden te lokaliseren. Onthoud dat werken met radioactiviteit gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals juiste afscherming, insluiting, blootstellingsbewaking en afvoer, altijd moeten worden genomen om radioactieve besmetting te voorkomen.

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het doel van dit artikel is om een ​​methode aan te tonen immunofluorescentie detectie van oestrogeen receptor-α (ERα) in ratten pial arteriële plakken met behulp van een digitale immunofluorescentie microscoop te optimaliseren.

Beeldvorming van Oestrogeen Receptor-α in Rat Pial arteriolen met behulp van een Digital Microscope Immunofluorescente

De bioorthogonale inverse elektrone-vraag Diels-Alder cycloadditie is gebruikt om een effectieve en modulaire pretargeted PET-beeldvormingsstrategie voor kanker te creëren. In dit protocol worden de stappen van deze methodologie beschreven in de context van een modelsysteem dat gebruikmaakt van het op colorectale kanker gerichte antilichaam huA33 en een 64Cu-gelabelde radioligand.

Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Dit manuscript beschrijft het gebruik van transgene reporter muizen en andere beheerprogramma routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II-geïnduceerde hypertensie met behulp van intravital videomicroscopie van bloedvaten te evalueren van de activering van immune cellen en hun mogelijkheid te rollen en zich houden aan het endotheel.

Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

De αvβ3 integrine is een soort hechting eiwit dat zeer wordt uitgedrukt op geactiveerde endotheliale cellen ondergaan van angiogenese. Evaluatie van de integriteit van het integrine is dus van groot belang in de oncologie. Hier introduceren we een methode voor het bereiden van 68Ga-label radiopeptides en een methode om haar biologische effectiviteit te beoordelen.

Voorbereiding van een 68Ga-geëtiketteerden Arginine Glycine aspartaat (RGD)-peptide voor angiogenese

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Proteomic profilering van tyrosine-nitraat eiwitten is een uitdagende techniek vanwege de geringe overvloed van de 3-nitrotyrosine modificatie. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak voor nitropeptide verrijking en profilering met behulp van angiotensine II als model. Deze methode kan worden uitgebreid voor andere in vitro -of in vivo -systemen.

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor de meting van isolevuglandinen in weefsels door immunofluorescentie met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde ScFv D11-antilichamen. Hypertensiemodellen bij zowel muizen als mensen worden gebruikt om de stapsgewijze procedures en fundamentele principes uit te leggen die verband houden met isolevuglandinemeting in weefselmonsters.

Directe detectie van isolevuglandinen in weefsels met behulp van een D11 scFv-alkalisch fosfatasefusie-eiwit en immunofluorescentie

In dit artikel onderzoeken we de methodologie en de overwegingen die relevant zijn voor de FDA goedgekeurde behandeling van depressie protocol van het gebruik van de Neuronetics NeuroStar TMS-apparaat.

De NeuroStar TMS-apparaat: Het uitvoeren van de FDA goedgekeurde protocol voor de behandeling van depressie

Video afspelen is een veel gebruikte techniek in het gedrag van dieren. We creëerden en geëvalueerd worden een programma dat op regels gebaseerd, interactief afspelen van 3-D computer animatie is van toepassing in reactie op real-time, geautomatiseerde data over het onderwerp gedrag.

Geautomatiseerde Interactive Video Playback voor Studies van Animal Communication

Leer receptorautoradiografie voor de lokalisatie en kwantificering van angiotensine II-receptoren in de hersenen van ratten. Deze methode biedt inzicht in hersengebieden die gedrag en cardiovasculaire functie beïnvloeden.

Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren

Meer video's verkennen