Een eenvoudige bioassays voor de beoordeling van de vasculaire endotheliale groeifactoren

Het algemene doel van deze eenvoudige, celgebaseerde bioassay is het detecteren, kwantificeren en monitoren van de activiteit van leden van de familie van vascular endothelial growth factor-liganden. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in de vasculaire biologie, virologie, oncologie en oogheelkunde, waarbij VEG-FR-familieliganden cruciale processen bij deze ziekten aansturen. Het belangrijkste voordeel van deze assay is dat het de evaluatie van VEG-FM-familieliganden mogelijk maakt wat betreft hun vermogen om hun verschillende receptoren te binden en te crosslinken, zonder dat hiervoor gespecialiseerde epitheelcellen vereist zijn.

Kweek de IL3-secreterende cellijn WEHI-3D door vijf keer 10⁶ cellen in de logaritmische groeifase te pipetteren in vier tot tien T175-flessen die 50 ml vers kweekmedium bevatten. Incubeer gedurende zeven dagen of totdat de cellen hun logaritmische groeifase met ongeveer 24 tot 48 uur zijn gepasseerd. Giet de vloeistof en de cellen uit de flessen af.

Centrifuge vervolgens bij 1,000 Gs gedurende 15 minuten om cellen en cellulair debris te verwijderen. Verwijder daarna de bovenste 90% van het supernatant en filter dit door een filterunit van 0,22 micron. Verdeel het geconditioneerde medium in aliquoten van één milliliter ter voorbereiding op de assay.

Aliquoten van 50 milliliter voor het maken van kweekmedium om factor-afhankelijke cellijnen te passeren en volumes van 200 milliliter voor langdurige bewaring bij 20 degree Celsius. Bewaar de kleinere volumes bij 20 Celsius. Kweek controle BAF3-cellen in kweekmedia die 10% WEHI-3D geconditioneerd medium bevatten.

en VegFR2-EPoR-BAF3-cellen in hetzelfde medium plus 1 mg/mL G418. Pas de cellen over in verdunningen van 1:15 vanuit cellen die in de logaritmische groeifase verkeren. Oogst controle-BAF3- of VegFR2VPoR-BAF3-cellen uit culturen in de midden-logfase.

Pipette de cellen voorzichtig van de bodem van de kolf en centrifugeer 5 minuten bij 750 Gs om de celpellet terug te winnen. Resuspendeer de pellet in 10 milliliters muis-tonische fosfaatgebufferde zoutoplossing en centrifugeer opnieuw 5 minuten bij 750 Gs. Herhaal deze wasstap nog twee keer om het medium dat IL3 bevat te verwijderen.

Was de cellen één keer met medium zonder DEHI-3D geconditioneerd medium. Het is belangrijk om het kweekmedium dat IL3 bevat weg te wassen om te garanderen dat er geen extra groeifactoren achterblijven, die een fout-positief resultaat of een hoge achtergrondactiviteit kunnen veroorzaken. Na het centrifugeren en het verwijderen van het supernatant worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in hetzelfde IL3-vrije medium bij een concentratie van 7,4 × 10⁴ cellen per milliliter.

Meng tot slot gelijke volumes trypaanblauw in PBS met een celpopulatie en breng dit over in een hemocytometer. Tel ten minste 100 cellen. Cellen die de kleurstof opnemen, worden beschouwd als dood of stervend.

Het is essentieel dat de cellen die voor de assay worden gebruikt een hoge levensvatbaarheid hebben, om ervoor te zorgen dat ze in staat zijn te reageren op de assaycondities. Gebruik een goed gekalibreerde P20 automatische pipet en geautoclaveerde tips om 1 000 cellen in 13,5 µL IL-deficiënt medium aan de wells van een 72-wells plaat toe te voegen. Zorg ervoor dat de celsuspensie tijdens het aliquoteren wordt gemengd, zodat bezinking van de cellen door zwaartekracht de celconcentratie niet beïnvloedt.

Gebruik een goed gekalibreerde P2-pipet om 1,5 µL IL3-vrij medium in triplikaat aan de controleputjes toe te voegen. Meng voorzichtig. Voeg op dezelfde wijze het 10% WEHI-3D geconditioneerde medium en de 100 ng/mL VegFA zonder IL3 controle toe aan de gewenste putjes.

Voeg tenslotte 1,5 microliters van de testmonsters in triplikaat toe. Vul alle ongebruikte wells van de microwellplaat met steriel water, PBS of medium. Plaats met water verzadigd weefselpapier in een gasdoorlatige container om een bevochtigde kamer te creëren die gasuitwisseling mogelijk maakt.

Incubeer de assayplaten in de kamers in een bevochtigde atmosfeer van 10% koolstofdioxide gedurende 16 uur. Analyseer de platen na 16 uur incubatie met een standaard omgekeerde fasemicroscoop bij een vergroting van 40 tot 100x. Op dit moment is het mogelijk om onderscheid te maken tussen positieve en negatieve monsters.

Putjes zonder ondersteuning van groeifactoren of met enkel medium zullen een verminderd aantal ronde cellen vertonen, evenals dode of stervende cellen en cellulair debris. Daarentegen zijn cellen die zijn geïncubeerd met medium dat IL3 of liganden voor VegFR2 bevat groot en translucent, waarbij er geen of minimale aanwijzingen zijn van granulariteit in het cytoplasma van de cel of celdebris in de kweek. Voeg 10.000 gewassen cellen in 135 µL IL3-deficiënt medium toe aan de putjes van een standaard 96-wells plaat.

Gebruik een gekalibreerde P20-pipet om 15 µL van de testmonsters en controles aan de putjes toe te voegen. Incubeer het mengsel van cellen, groeifactoren en/of remmende middelen zoals voorheen gedurende 48 uur. Evalueer aan het einde van de incubatieperiode het aantal levensvatbare cellen in de putjes met de methoden die worden beschreven in het geschreven gedeelte van het protocol.

Hier zijn de resultaten weergegeven van een assay waarin de VEGF-R2 EPoR BAF3-bioassay wordt gebruikt om de activiteit van de drie recombinante humane liganden met specificiteit voor VEGF-R2 te kwantificeren: VEGF-A165, VEGF-C en VEGF-D. De activiteit werd gekwantificeerd in aanwezigheid van bevacizumab, een inhiberend monoklonaal antilichaam tegen VEGF-A165, of in aanwezigheid van trastuzumab, een niet-neutraliserend antilichaam.

De gegevens zijn genormaliseerd ten opzichte van de respons op VEGF-A165 alleen. Zoals verwacht blokkeerde bevacizumab het effect van VEGF-A165 in de assay, maar had het geen effect op de activiteit van VEGF-C en VEGF-D. Cellen die waren blootgesteld aan IL3 vertoonden een hoge levensvatbaarheid.

Daarentegen vertonen cellen die niet aan een extra groeifactor zijn blootgesteld een slechte levensvatbaarheid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er rekening mee te houden dat er een reeks controlerende agentia in het geconditioneerde medium aanwezig zijn die voorafgaand aan de assay moeten worden gegenereerd. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor een heropleving in de vasculaire biologie, virologie, oncologie en oogheelkunde om de rol van VEG-FM in ligines te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de bioassay-cellen voorbereidt, hoe u de bioassay uitvoert en hoe u de kwantitatieve of semikwantitatieve analyses van de VEG-FM ligine-activiteit uitvoert.