Name: Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Leer chromatine-immunoprecipitatie voor epigenetische regulatie van hartontwikkeling met embryonale stamcellen. Deze methode onthult hoe genexpressie wordt gecontroleerd tijdens differentiatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen financiering van agentschappen, het IMI StemBANCC Europees gemeenschapsprogramma, de leducq Stichting (SHAPEHEART) en de Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. DNA-eiwit Verknoping <ol><li> Fix in 15 ml buisjes geoogste-ES-cellen (2 x 10 6 cellen regelmatige ChIP, 2 x 10 5 cellen Microchip), embryo organen (EBS) gegenereerd uit ES-cellen en embryonale hartweefsel ontleed van E9.5 muizenembryo&#39;s (atrioventriculaire kanaal uitstroombaan en ventrikel) middels 1% formaldehyde in PBS gedurende cellen of permeabilisatie buffer PB2 voor embryonale weefsels. Plaats de buizen op rondschudapparaat bij een snelheid van 60 rpm bij kamertemperatuur gedurende exact 10 minuten. </li><li> Stop de verknopingsreactie door toevoeging van glycine tot een eindconcentratie van 125 mM en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudinrichting bij snelheid van 60 rpm. </li></ol> 2. Cell Lysis en chromatine fragmentatie <ol><li> Was tweemaal verknoopte cellen geresuspendeerd in 10 ml PBS 1x of embryonale weefsels geresuspendeerd in 1 ml PB2. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de supernatanten. &lt;/ Li&gt; <li> Voeg proteaseremmers aan PB1 of PB2 (2 ug / ml leupeptine, 1 ug / ml aprotinine en 0,1 mM PMSF) (Tabel 1) buffer. Resuspendeer de celpellet of embryonaal weefsel uit stap 1 in 2,1 ml buffer PB1 of PB2 respectievelijk. Pipet op en neer en resuspendeer de cellen of weefsels. Gebruik een 1 ml spuit met een 21 gauge naald om cellen of weefsels te homogeniseren. Incubeer bij 4 ° C (op een wiel) gedurende 10 min. </li><li> Spin down bij 3.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gooi de supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in 300 gl respectieve SB buffers (tabel 1) aangevuld met proteaseremmers in een schone buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij) één DNA degradatie voorkomen. Incubeer gedurende 15 tot 30 minuten op ijs. </li><li> Ultrasone trillingen de monsters bij 4 ° C om de chromatine met een sonicator volgens de in tabel 2 vermeld voor elk materiaal programma scheren. Pas duur ultrasoonapparaat, afhankelijk van de volgende applicatie (&lt;em&gt; dat wil zeggen, PCR of sequencing). Geknipt DNA grootte moet ongeveer 500 bp voor PCR en 300 bp voor sequencing. </li><li> Centrifugeer gesonificeerd cellysaat gedurende 10 minuten bij 6000 xg bij 4 ° C en breng het supernatans (chromatine) in een schone buis van 1,5 ml en gooi de pellet. </li><li> Verdun het chromatine in oplossing (supernatant buffer B) gedurende 10 maal met water en beoordeelt de extinctie toepassing van 1,5 pi van een nano-spectrofotometer. Lees de concentratie van eiwitten in pg / pl volgens de volgende formule: 1,55 OD x 280-0,76 x 260 OD. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Buffer </td><td> benutting </td><td colspan="4"> Samenstelling </td><td> materialen </td></tr><tr><td rowspan="2"> EEN </td><td rowspan="2"> permeabilisatie </td><td colspan="4"> PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40 </td><td> Alle </td></tr><tr><td colspan="4"> PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl2 60 mM KCl, 0,5% TRITON X-100 </td><td> embryonaal weefsel </td></tr><tr><td rowspan="3"> B </td><td rowspan="3"> Lysis / Sonicatie </td><td colspan="4"> SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2: 50 mM HEPES-KOH pH7.9; 140 mm; 1 mM EDTA; 0,1% deoxycholaat; 0,1% SDS </td><td> EBS </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% TRITON-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% laurylsarcosine </td><td> embryonaal weefsel </td></tr><tr><td> C </td><td> ChIP buffer </td><td colspan="4"> 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100. </td><td> Alle </td></tr><tr><td> D </td><td> DNA / eiwit Elution </td><td colspan="4"> D1: 1% SDS; 1003 mM NaHCOs D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS </td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> DNA-bindende kralen voorbereiding </td><td colspan="4"> E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. ChIP buffers. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Materiaal </td><td> sonicatie programma </td></tr><tr><td> Embryonale stamcellen </td><td> 15 cycli van 30 sec ON en 30 sec OFF </td></tr><tr><td> embryoid lichamen </td><td> 30 cycli van 30 sec ON en 30 sec OFF </td></tr><tr><td> embryonale weefsels </td><td> 21 cycli van 30 sec ON en 30 sec OFF </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Sonicatie Programs. 3. Immunoprecipitatie enwast <ol><li> Was 3 maal proteïne A-geconjugeerde kralen met buffer C. Neem 100 ul van kralen in een schone buis van 1,5 ml en voeg 1 ml buffer C (Tabel 1). De buis wordt dan overgebracht op een magneet; wacht 1 min en zuig de supernatant. Tweemaal herhalen de wasstap. </li><li> Incubeer antilichaam opgewekt tegen gemodificeerde histonen of transcriptiefactor (concentraties in tabel 3) met 20 ul Proteïne A gewassen geconjugeerde kralen en 1 ml buffer C aangevuld met proteaseremmers in een schone buis van 1,5 ml. Stel de monsters op een rotator bij 40 rpm gedurende ten minste 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Wash antilichaam-complexen beads 3 maal met 1 ml buffer C (3,1 manipulatie beschreven). </li><li> Bereid 2 buizen, een met 150 ug chromatine en antilichaam-beads-complexen en de andere buis met 150 ug chromatine en 20 ui gewassen kralen; Voeg 1 ml buffer C aangevuld met proteaseremmers aan elke buisen incubeer de monsters op een roterend wiel bij 40 rpm gedurende de nacht bij 4 ° C. Opmerking: De concentratie van chromatine moet minstens 300 pg tot een transcriptiefactor of sequentiële ChIP immunoprecipitatie. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Standaard </td><td> concentratie (ng / gl) </td><td> Volume (pl) </td><td> Totaal DNA-concentratie (ng) </td></tr><tr><td> EEN </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> C </td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> D </td><td> 1.25 </td><td> 1 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0,625 </td><td> 1 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0,3125 </td><td> 1 </td><td> 00,3125 </td></tr><tr><td> G </td><td> 0,156 </td><td> 1 </td><td> 0,156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Normen concentraties. 4. DNA Elutie, Cross-link-Reversal en Proteinase K Digestion <ol><li> Stel de monsters in de magnetische rek. Herstellen van de supernatant dat ongebonden antilichaam chromatine. OPMERKING: Monsters kunnen snel ingevroren in vloeibare stikstof bij die stap en opgeslagen bij -80 ° C. Chromatine kunnen worden gebruikt in andere immunoprecipitatie assays met andere antilichamen. Was elk monster 3 maal met 1 ml buffer C (manipulatie eerder beschreven). </li><li> Elueer het antilichaam gebonden eiwit door toevoeging van 150 ul buffer D1 of D2 indien sequentiële chip moet worden gedaan (tabel 1) tot gewassen ChIP materiaal en incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 50 ° C in een verwarmingsblok. </li><li> Verwijderen buizen uitde verwarming blok en zet de monsters in de magnetische rek, herstellen van de bovenstaande vloeistof in een schone 1,5 ml buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij) en gooi de kralen. </li><li> Gebruik supernatant een sequentiële toevoeging ChIP 1-3 ug van het tweede antilichaam in 2 volumes buffer C of omgekeerde verknopen door toevoeging van 5 M NaCl tot een eindconcentratie van 200 mM te verkrijgen. </li><li> Bereid een inputsteekproef van chromatine in een schone 1,5 ml buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij) waarbij evenveel chromatine als die van de IP monster (150 ug) in een eindvolume van 150 ui water (RNase DNase gratis water). Voeg 5M NaCl tot een uiteindelijke concentratie van 200 mM. Incubeer de monsters een nacht bij 65 ° C. </li><li> De volgende dag, verwijder monsters van het verwarmingsblok, voeg 250 mM EDTA tot een eindconcentratie van 12,5 mM en proteinase K te verkrijgen tot een uiteindelijke concentratie van 250 ug / ml in de ChIP materiaal te verkrijgen en verwerken bij 55 ° C gedurende 2 uur in de blokverwarming. </li></ol><ol><li> Bereiding van kralen <ol><li> Start de korrels bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min, vortex de kralen grondig te brengen. Kralen vestigen, zo snel werken als pipetteren. Breng 1 ml kralen in schone 1,5 ml buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij). </li><li> Stel op magneet, wacht 2-3 minuten voor de oplossing te verduidelijken, teruggooi supernatant. Verwijderen uit magneet, voeg 1 ml van 0,5 M EDTA en meng door kort vortexen. </li><li> Herhaal stap 5.1.2 twee keer, en gooi supernatant aan het eind. </li><li> Verwijderen uit magneet, voeg 1 ml buffer E en langzaam resuspendeer de kralen. Breng de gehele mengsel (kralen in buffer E) in 50 ml buffer E. plaatsen op een schudapparaat en laat het mengsel langzaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Test DNA-bindende kralen volgens de zuiveringsprotocol daaronder; 3 experimentele omstandigheden beschreven: 50 ui bolletjes / 50 ui DNA (1 volume / volume 1), 100 ui kralen/ 50 pl DNA (2 volumes / 1 volume) en 125 pl kralen / 50 pl DNA (2,5 volume / volume 1). Laat migreren gezuiverd DNA op een 1,5% agarosegel om de grootte van de fragmenten (Figuur 1A) controleren. </li></ol></li><li> DNA Purification <ol><li> Voeg 425 pl (2,5 volumina) DNA binding magnetische beads aan elk DNA-monster (ongeveer 170 ui). Resuspendeer langzaam op en neer te pipetteren (ongeveer 10 keer) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Plaats op magneet gedurende 5 minuten, dan aspireren supernatant en gooi (op magneet). </li><li> Voeg 600 ul van vers bereide 80% ethanol aan de buis op magneet, wacht 1 min, aspireren supernatant af en gooi en herhaal de vorige stap nog eens. </li><li> Geef een snelle rotatie, gedurende 5 sec (microfuge), plaats de buis op de magneet en verwijder de laatste druppels ethanol. Laten drogen 1 min bij KT </li><li> Elueer het DNA door het toevoegen van 20 ul van DNase RNase vrij water. Verwijderen uit de magneet en vortex het monster. </li><li> Incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur en plaats monsters op magneet. Aspireren geëlueerde DNA in een nieuwe buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij). </li><li> Voer het DNA van de inputfractie op een 1,5% agarosegel om de grootte van DNA-fragmenten (Figuur 1B) controleren. </li></ol></li></ol> 6. DNA Kwantificering Met behulp van een fluorescentiedetectie Instrument <ol><li> Serieel verdund in water 1 pg DNA (1 kb ladder) in totaal 7 verdunningen en een niet-DNA point (verdunningen verzameld in Tabel 3) werd verkregen. </li><li> Bereid een oplossing van PCR Green I kleurstof, voldoende voor alle monsters (gezuiverd DNA en standaard verdunningen AH): verdunnen 10.000 x de groene kleurstof in 1x TE-buffer. </li><li> Voeg 1 pl van elk DNA monsters (gezuiverd DNA en standaardverdunningen AH) aan 10 pl 1x groene kleurstof mix capillairen cuvettes worden gelezen in een fluorimeter bij 488 nm golflengte. Voor de niet-DNA-test, gebruik maken van 1 pl van de 1 x TE-buffer. </li><li> Bouweneen ijkkromme met een grafische software en bepalen de relatieve concentraties om te zien welke DNA-monsters in ng / ul. Het DNA is dan klaar voor PCR of sequencing bibliotheken te maken. </li></ol> 7. PCR <ol><li> Selectie van primers <ol><li> Ontwerp primers van belang voor de genomische regio&#39;s van belang ondervragen. Ontwerp primers aan enhancer gebieden van genen met behulp van de UCSC genoom browser te versterken. Enhancers worden verder voorspeld met behulp van H3K4me1 of p300 ChIP-seq 9 gegevens beschikbaar in GEO-dataset. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> Run PCR reacties voor 45 cycli (8 sec 95 ° C, 8 sec 60 ° C, 8 sec 72 ° C) met een real-time PCR thermocycler in 25 pi groene kleurstof mix, 2 ng DNA en 0,5 ui primer mix (20 uM voorraad oplossing) 10. </li></ol></li><li> Analyse van de verrijking <ol><li> Bereken Absolute verrijking ervan uitgaande dat hoogstens 1% van nucleosoom werden immunogeprecipiteerd 11. </li><li> ontr de genomische als verrijkte of 10 ng IP monsters een grotere verrijking in vergelijking met 0,1 ng DNA ingang. </li><li> Drukken resultaten als de voudige toename van verrijking over een niet-verrijkte gebied na normalisatie naar de ingang en aanpassing met een niet-specifiek controlemonster. </li><li> Denk aan de ingang DNA worden verdund met 100 (verdunningsfactor of DF). </li><li> Normaliseren van de ingang met de volgende vergelijking 2 -ΔCt x 100%, waarbij -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF]. </li><li> Pas controle met behulp van de volgende vergelijking (ACt [IP] -ΔCt [NS]) waarbij NS is de niet-specifieke monster (geen antilichaam IP, of IgG IP). </li><li> Bereken de vouw verrijking van het monster 2 -ΔΔCt. Een bestand met alle stappen van berekeningen met formules die op elke PCR monster kan worden ingevoerd zal de analyse van de resultaten te vergemakkelijken. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+and+remodellers%3A+regulators+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li>
<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).</li>
<li>Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+bivalent+epigenetic+marks+in+two+human+embryonic+stem+cell+lines+reveals+a+different+cardiogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential.</a> Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).</li>
<li>Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li>
<li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin-OCT4+complex+mediates+Sox+enhancers+to+prime+an+early+embryonic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage.</a> Nat Commun. 6, 6749(2015).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).</li>
<li>Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li>
<li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li>
<li>Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154, 888-903 (2013).</li>
<li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat Commun. 6, 6033(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Epigenetica is een belangrijk gebied van onderzoek in ontwikkelingsbiologie geworden. Hoe een genetische programma wordt geactiveerd in embryonale cellen om de cellen te laten verwerven van een specifieke identiteit binnen een embryonale geslacht is al lange tijd een belangrijke vraag voor de ontwikkelingsbiologie biologen. Chip is in grote lijnen gebruikt in de laatste jaren en gecombineerd om DNA-sequencing volgende verbetering van de resolutie van sequencing. Dit is uitgegroeid tot een kr...

<html> Het hart is het eerste orgaan te vormen en functioneel in het embryo worden. Het hart is opgebouwd uit vele cellijnen die voortkomen uit de eerste en tweede embryonale hart velden 1. Uit de post-bevruchting blastocyst stadium tot aan de gevormde hart, embryonale cellen moeten dus veel mobiele beslissingen over het lot te maken. Gene transcriptie wordt geregeld in een tijd- en ruimte-afhankelijke manier en is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Een dergelijke werkwijze wordt gemedieerd door specifieke transcriptiefactoren die regelende gebieden in het genoom waaronder enhancers en promoters van cardiale genen constitutieve binden. DNA wordt rond histonen die onderhevig zijn aan modificaties zoals acetylatie, methylatie, ubiquitinylation en / of fosforylering. Histon modificatie leidt tot onderdrukte, geactiveerd of evenwichtig gentranscriptie afhankelijk van welke lysinerest van histon is gemodificeerd 2. jove_content &quot;&gt; Chromatine immunoprecipitatie assay (chip) is opgericht jaar geleden 3 en is momenteel de meest algemeen gebruikte technologie om targets van een van beide gemodificeerde histonen of transcriptiefactoren 4. Na immunoprecipitatie van histonen of transcriptiefactoren identificeren, kan gebonden DNA hetzij geamplificeerd door polymerasekettingreactie (PCR) en gesequenced. ChIP heeft technisch overwonnen lastiger gelretardatie assays 5. echter ChIP geen directe binding van een transcriptiefactor aan DNA, een voordeel van gelretardatie assay impliceren. anderzijds, ChIP gecombineerd om DNA sequentiebepaling een nieuwe genoom-brede kijk op genregulatie geopend. ES-cellen (ES-cellen) recapituleren binnen embryo lichamen (bijv., Mobiele aggregaten) of in 2D cultuur van de eerste stappen van de ontwikkeling van het hart 6 en bieden in principe genoeg materiaal voor de chip. Bovendien humane ES-cellen zijn een menselijke cel model cardiogenesis hoewel hun potentieel cardiogene afhankelijk van hun epigenetische handtekening 7. In latere stadia van ontwikkeling, muis embryonale weefsels zorgen voor het onderzoeken van specifieke epigenetische landschappen vereist voor het bepalen van celidentiteit. Echter, het genoom getranscribeerd in een tijds- en celtype-specifieke wijze 8. Epigenetische regulatie van gentranscriptie moet worden bestudeerd in gelokaliseerde gebieden. Hierin beschrijven we de protocollen van de chip, sequentiële ChIP gevolgd door PCR of sequentiebepaling met behulp van ES-cellen, embryo lichamen en cardiale specifieke embryonale regio&#39;s. Deze protocollen laten onderzoeken van de epigenetische regulatie van cardiale gen-transcriptie.

<table><tbody><tr><td>Formaldehyde&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Cel Fixatie&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>Cross-link stop</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>Proteasenremmer</td></tr><tr><td>Leupeptin hemisulfate</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>Proteasenremmer</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Proteasenremmer</td></tr><tr><td>Protein A magnetische kralen&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>10001D</td><td>Immunoprecipitatie</td></tr><tr><td>SPRI magnetische kralen</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>25530-015</td><td>Eiwitvertering&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA BR standaard&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Q32850</td><td>Calibratiebereik&nbsp;</td></tr><tr><td>Syber groen</td><td>Molecular Probes</td><td>S-11484</td><td>DNA-kwantificering</td></tr><tr><td>TE buffer&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA-kwantificering</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td>Wassen</td></tr><tr><td>DNase RNase-vrij water</td><td>Life technologies</td><td>10977-035</td><td>Verdunning</td></tr><tr><td>Axygen buis</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP-zuivering</td></tr><tr><td>Antilichaam&nbsp;</td><td>Bedrijf</td><td>Referentie</td><td>ChIP-concentratie</td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &micro;g voor ESC en EB's, 1 &micro;g voor weefsels</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &micro;g voor ESC en EB's, 1 &micro;g voor weefsels</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &micro;g voor ESC en EB's, 1 &micro;g voor weefsels</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 &micro;g voor ESC en EB's, 1 &micro;g voor weefsels</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &micro;g voor ESC en EB's, 1 &micro;g voor weefsels</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &micro;g voor ESC en EB's, 1 &micro;g voor weefsels</td></tr></tbody></table>

epigenetische regulatie van cardiac differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specifiek gen transcriptie is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Het biologisch proces wordt gemedieerd door transcriptiefactoren die genomische regulatoire gebieden zoals enhancers en promoters van cardiale genen constitutieve binden. DNA wordt rond histonen die worden blootgesteld aan chemische modificaties. Modificaties van histonen verder leiden tot een onderdrukte, geactiveerd of poised gentranscriptie, dus brengt een ander niveau van fine tuning regulatie van gentranscriptie. Embryonale stamcellen (ES-cellen) herhalen binnen embryo organen (dwz cel aggregaten) of 2D kweek de vroege stappen van ontwikkeling van het hart. Ze bieden in principe genoeg materiaal voor chromatine immunoprecipitatie (chip), een technologie die in grote lijnen gebruikt om gen regulerende gebieden te identificeren. Verder menselijke embryonale cellen vormen een menselijke cel model van cardiogenese. In latere stadia van ontwikkeling, muis embryonale weefsels mogelijk makenonderzoek naar specifieke epigenetische landschappen die nodig zijn voor de bepaling van de cel identiteit. Hierin beschrijven we de protocollen van de chip, sequentiële ChIP gevolgd door PCR of ChIP-sequencing met behulp van ES-cellen, embryo lichamen en cardiale specifieke embryonale regio&#39;s. Deze protocollen laten onderzoeken van de epigenetische regulatie van cardiale gen-transcriptie.

Figuur 1A illustreert de eerste bereiding van DNA-bindende kralen en kwaliteitscontrole middels DNA van verschillende grootte (1 kb ladder). 0ne, 2 en 2,5 volumes (1-3) van de korrels werd een volume van het monster hoog en laag molecuulgrootte DNA-fragmenten te zuiveren toegevoegd. Figuren 1 B, C, D zijn typische voorbeelden van DNA gelen uit geheel gesoniceerde DNA geëxtraheerd uit muizen ES...

Een fijnafstemming regulatie van gentranscriptie ten grondslag ligt aan embryonale cel lot beslissing. Hierin beschrijven we chromatine immunoprecipitatie assays gebruikt om epigenetische regulatie van zowel cardiale differentiatie van stamcellen en cardiale ontwikkeling van muizenembryo&#39;s te onderzoeken.

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Het algemene doel van het toepassen van deze chromatin immunoprecipitatie-benaderingen op differentiërende embryonale stamcellen of cardiale embryonale weefsels, is het ontrafelen van de epigenetische regulatie van de hartontwikkeling. Aangezien de fijnafstemming van gentranscriptie tijdens de embryonale hartontwikkeling wordt gereguleerd door epigenetische componenten, is chromatin immunoprecipitatie een geschikte methode om dit proces te begrijpen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we specifiek een locus kunnen targeten en kunnen kijken naar de epigenetische markeringen die zich op dat specifieke stuk DNA bevinden. Deze methode kan inzicht bieden in de epigenetische regulatie van de hartontwikkeling. Het kan ook worden toegepast op andere organen of willekeurige celtypen.Dit is Imen. Zij is een PhD-student in het laboratorium en zij zal vandaag het experiment uitvoeren. Deze procedure maakt gebruik van embryonale stamcellen of ES-cellen.Embryonale lichaampjes gegenereerd uit ES-cellen en embryonaal hartweefsel gedissecteerd uit E9.5 muizenembryo's. Fixeer de cellen en weefsels. Gebruik 1% formaldehyde in PBS voor de cellen en PB2 permeabilisatiebuffer voor de embryonale weefsels.Plaats de buisjes op een orbitale schudmachine met een snelheid van 60 RPM bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten. Stop de cross-linkingreactie door glycine toe te voegen tot een eindconcentratie van 125 millimolar en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op de orbitale schudmachine met een snelheid van 60 RPM. Om deze procedure te starten, resuspendeert u het pellet in 10 milliliters PBS.En de embryonale weefsels in één milliliter PB2. Centrifugeer bij 1000 ×g gedurende vijf minuten bij vier °C. Verwijder het supernatant en voeg de betreffende buffer toe voor een tweede wasbeurt.Voeg protease-remmers toe aan buffers PB1 en PB2 op ijs. Voeg één milliliter van buffer PB1, aangevuld met protease-remmers, toe aan de celpellet en pipetteer herhaaldelijk om de cellen te resuspenderen. Resuspendeer op dezelfde wijze de embryonale weefsels in één milliliter gebufferde PB2, aangevuld met protease-remmers.Gebruik daarna een spuit van 1 milliliter met een naald van 21-gauge om de cellen of weefsels te homogeniseren. Breng de celsuspensie over naar een schone buis van 1,5 milliliter. Incubeer de gehomogeniseerde cellen en weefsels gedurende 10 minuten bij 4 °C.Centrifuge gedurende vijf minuten bij 3000 ×g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer elk pellet in 300 µL van de betreffende sonicatiebuffer, aangevuld met protease-remmers. Breng de celsuspensie over naar een gecertificeerde RNase-, DNase- en pyrogene-vrije buis om DNA-degradatie te voorkomen en incubeer dit gedurende 15 tot 30 minuten op ijs.Om het chromatine te fragmenteren, worden de monsters gesoniceerd bij vier graden Celsius met het geschikte sonicatieprogramma voor elk materiaal. Pas de sonicatieduur aan afhankelijk van of het DNA zal worden gebruikt voor PCR of sequencing. Centrifugeer vervolgens de gesoniceerde cellysaten gedurende 10 minuten.Overbreng de supernatant, die het chromatine in oplossing bevat, van elk monster naar een schone buis van 1,5 milliliter en gooi het pellet weg. Neem een aliquot van 1,5 microliter van elk monster en verdun dit 1:10 met water. Bepaal de optische dichtheid van alle monsters in een nano-spectrofotometer om de proteïneconcentratie vast te stellen.Bereid vóór de chromatinimmunoprecipitatie proteïne A-geconjugeerde beads voor door deze te wassen zoals beschreven in de protocoltekst. Meng in een schone buis van 1,5 milliliter het antilichaam tegen gemodificeerde histonen of transcriptiefactoren, 20 µL van de gewassen proteïne A-geconjugeerde beads en één milliliter buffer C aangevuld met proteaseremmers. Incubeer de monsters op een rotator bij 40 RPM gedurende ten minste twee uur bij 4 °C.Was de antilichaam-beadcomplexen drie keer met één milliliter buffer C zoals beschreven in de protocoltekst. Bereid twee buisjes voor, één met 150 micrograms chromatine en antilichaam-beadcomplexen en de andere met 150 micrograms chromatine en 20 microliters gewassen beads. Voeg één milliliter buffer C aangevuld met protease-remmers toe aan elk buisje en incubeer de monsters op een rotatiewiel bij 40 RPM gedurende de nacht bij vier degree Celsius.Wanneer de overnachtse immunoprecipitatie is voltooid, plaatst u de monsters in het magnetische rek en verzamelt u het supernatant dat het ongebonden antilichaamchromatine bevat. Elueer het antilichaamgebonden eiwit door 150 µL buffer D1 toe te voegen aan de gewassen materialen. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 50 °C in een heating block.Verwijder de monsters na 20 minuten uit het warmteblok en plaats ze in het magnetische rek. Verzamel het supernatant in een schone buis van 1,5 milliliter en gooi de beads weg. Om de crosslink ongedaan te maken, voegt u vijf molar natriumchloride toe aan het supernatant om een eindconcentratie van 200 millimolar te verkrijgen.Bereid een inputmonster van chromatine voor in een schone buis van 1,5 milliliter. Gebruik dezelfde hoeveelheid chromatine als die van het immunoprecipitatiemonster in een eindvolume van 150 microliters RNase- en DNase-vrij water en vijf molar natriumchloride tot een eindconcentratie van 200 millimolar. Incubeer de monsters overnight bij 65 degree Celsius.Verwijder de volgende dag de monsters uit het warmteblok. Voeg EDTA toe tot een eindconcentratie van 12,5 millimolair en Proteinase K tot een eindconcentratie van 250 microgram per milliliter en verteer gedurende twee uur bij 55 °C. Begin deze procedure met het voorbereiden van de beads.Breng de beads eerst gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur. Vortex de beads vervolgens zeer grondig en pipetteer snel 1 milliliter beads in een schone buis van 1,5 milliliter. Plaats de buis met beads gedurende twee tot drie minuten op de magneet totdat de oplossing helder is en verwijder het supernatant.Verwijder de buis uit de magneet. Voeg één milliliter 0,5 molar EDTA toe en meng door kortstondig te vortexen. Was de beads twee keer op deze manier en verwijder het supernatant na de laatste wasstap.Verwijder de buis uit de magneet. Voeg één milliliter buffer E toe en resuspendeer de beads langzaam. Draag het gehele mengsel over naar 50 milliliter buffer E. Plaats dit op een shaker en laat het mengsel gedurende één uur langzaam mengen bij kamertemperatuur.Test vervolgens de DNA-bindende beads met een 1 KB DNA-ladder en drie verschillende ratio's van beadvolume ten opzichte van DNA-volume. De ratio 2,5/1 bleek het meest effectief voor DNA-binding. Om de beads te gebruiken voor DNA-purificatie, voegt u 425 microliters of 2,5 volumes beads toe aan elk DNA-monster en resuspendeert u dit langzaam door ongeveer 10 keer op en neer te pipetteren.Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats het monster vijf minuten op de magneet. Aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit weg.Was twee keer met vers bereide 80%ethanol door 600 µL aan elke buis toe te voegen. Wacht één minuut, en aspireer en gooi vervolgens het supernatant weg. Centrifugeer de buisjes kort.Plaats de buisjes op de magneet. Verwijder de laatste druppels ethanol en laat ze één minuut drogen bij kamertemperatuur. Haal het monster van de magneet en elueer het DNA door 20 µL DNase- en RNase-vrij water toe te voegen. Vortex.Agarosegelelektroforese onthulde de grootten van de DNA-fragmenten die waren verkregen na het omkeren van de cross-link van volledig gesoniceerd DNA, geëxtraheerd uit muis-ES-cellen, embryoïde lichaampjes en embryonaal hartweefsel. Een chromatine-immunoprecipitatie-experiment werd ontworpen om de epigenetische regulatie van genen voor de epitheliale-mesenchymale transitie te bestuderen in wild-type of genetisch gemuteerde cellen, wanneer ES-cellen differentiëren naar een mesodermaal cellot. De binding van gemodificeerde histonen werd gemonitord via PCR van de promotoren of enhancers van de E-Cadherin- en Twist-genen.Sequentiële chromatine-immunoprecipitatie werd uitgevoerd op chromatine geëxtraheerd uit vier menselijke ES-cellijnen, waarbij gebruik werd gemaakt van antilichamen tegen een activerende chromatine-markering, gevolgd door antilichamen tegen een repressieve markering. Deze markeringen worden gewijzigd wanneer cellen worden blootgesteld aan morfogenen, maar variëren afhankelijk van de menselijke ES-cellijnen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de oorspronkelijke blastocysten waaruit ze zijn afgeleid.Chromatine-immunoprecipitatie kan ook worden toegepast op chromatine dat is geëxtraheerd uit specifieke embryonale hartregio's. Deze figuur toont genomische regio's van de hartgenen Nkx2.5 en TBx5 die verrijkt zijn in het gemodificeerde histon, en één genomische regio van het pacemaker-specifieke gen Shox2 die niet verrijkt is en niet tot expressie komt in de ventrikel. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in drie uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de sonicatie-efficiëntie moet worden bepaald voordat het IP-protocol wordt gestart. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Eth-ek-se-ek, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het onderzoeken van de vorige staat van het chromatine (of deze open of gesloten was) of het monitoren van de nucleosoomafstand. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de epigenetica om elke epigenetische regulatie van celbestemmingsbeslissingen in elk celtype of embryonaal orgaan te verkennen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe chromatin-immunoprecipitatie-assays kunnen worden uitgevoerd.

epigenetic-regulation-cardiac-differentiation-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Het genereren van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen in vitro biedt toegang tot grote hoeveelheden hartweefsel in vitro voor fundamentele wetenschappen en klinische toepassingen. Dit protocol gebruikt de atrialiserende factor Grem2 om zowel het aantal verkregen cardiomyocyten te verhogen als om cardiomyocyten met een atriumfenotype te genereren.

Differentiatie van atriale cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen Met behulp van de BMP Antagonist Grem2

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

Leer chromatine-immunoprecipitatie voor epigenetische regulatie van hartontwikkeling met embryonale stamcellen. Deze methode onthult hoe genexpressie wordt gecontroleerd tijdens differentiatie.

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Meer video's verkennen