Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo's
12 maart 2016
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.
Het algemene doel van dit experiment is om enkele cellen te isoleren uit vroegstadium zebravisembryo's voor hun opname in een op microfluïdica gebaseerd enkelcellig multiplex systeem om de genexpressie van individuele cellen te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van de ontwikkelingsbiologie, zoals welke transcriptionele veranderingen cellen ondergaan tijdens specificatie en differentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een onbevooroordeelde aanpak is voor het onthullen van de heterogeniteit die wordt gemaskeerd in conventionele op populatie gebaseerde technieken.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze techniek worstelen omdat het genereren van de levensvatbare preparaten van enkele cellen technisch uitdagend is, maar essentieel voor downstream-analyse. Eenmaal beheerst, kan het verwerken van de hele embryo-monsters in enkele geliseerde cellen op een geïntegreerde microfluïdische chip in zes uur worden voltooid als de stappen correct worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alleen enkele cellen worden vastgelegd op het microfluïdische apparaat.
Na het kweken van volwassen wild-type en transgene zebravissen, verzamel embryo's met tussenpozen van 15 minuten volgens de door de faciliteit en instelling goedgekeurde standaard werkprocedures. Ten minste twee uur later, breng 100 tot 300 bevruchte embryo's van een enkel tijdstip over in een nieuwe petrischaal met vers eierwater. En gebruik fijne pincetten om het chorion handmatig van elk embryo te verwijderen.
Gebruik vervolgens een glaspipet met een brede opening om de embryo's over te brengen in een microcentrifugebuisje van 2 milliliter in een minimale hoeveelheid eierwater. Wanneer alle embryo's zijn overgebracht, vervang het water door 1 milliliter ijskoud eierwater en dompel de buis in ijs gedurende 20 minuten. Na de euthanasie, gebruik een glaspipet met een brede opening om het supernatant te verwijderen.
En gebruik een P-1000 pipet om twee keer vers eierwater aan de embryo's toe te voegen. Na de tweede wasbeurt, vervang het eierwater door 1 milliliter ontdooiingsbuffer en gebruik een P-1000 pipet om de embryo's acht tot twaalf keer te tritureren totdat de dooier is opgelost en alleen de lichamen van de embryo's zichtbaar zijn. Verzamel het weefsel door centrifugatie.
Gebruik vervolgens de pipet om voorzichtig het supernatant te verwijderen zonder het weefselpellet te verstoren, en suspendeer de cellen in 1 milliliter vers eierwater. Na het twee keer wassen van de embryo's, suspendeer het pellet in 1 milliliter celdissociatiereagens-1 op kamertemperatuur. Plaats vervolgens de buis op zijn zij voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.
Met zachte trituratie om de twee tot drie minuten om klontering te voorkomen. Aan het einde van de incubatie, centrifugeert u de cellen opnieuw en suspendeert u het pellet in 1 milliliter celdissociatiereagens-2. Incubeer de cellen horizontaal bij kamertemperatuur gedurende nog eens vijf tot vijftien minuten met zachte trituratie om de twee tot drie minuten.
Elke vijf minuten, verdun 2 microliter supernatant in 18 microliter FACS-buffer, en verdeel de cellen als een druppel op een celkweekschaal. Plaats een dekglas over het monster en gebruik een weefselkweekmicroscoop om de verteringsvoortgang te beoordelen bij 10 en 20x vergroting. Wanneer de voorbereiding lijkt op een mix van voornamelijk enkele cellen met enkele kleine en grote celklonen en een paar meestal intacte embryolichamen, centrifugeert u de cellen opnieuw en suspendeert u het pellet in 1 milliliter koude FACS-buffer.
Bevochtig vervolgens een 40-micron celzevener met FACS-buffer. En filter de cellen door de zeef in een 35-millimeter celkweekschaal. Na het opnieuw centrifugeren van de cellen, suspendeer het pellet in 100 microliter FACS-buffer, en tel het aantal levensvatbare cellen door Trypan blauwe uitsluiting.
Verdun vervolgens het monster tot 5 keer 10 tot de 6e cellen per milliliter. En bewaar 10 tot 20%van de cellen voor de ongekleurde controle. Kleur de rest van de cellen met een fluorescente levend/dood onderscheidingskleurstof.
Bevochtig vervolgens een 35-micron celzevener met een afgesloten FACS-buis met 20 microliter FACS-buffer, en voeg de cellen toe aan de zeef, die ze door zwaartekracht verzamelen. Gebruik de geïllustreerde gatingstrategie om de enkele levende cellen die de fluorescente marker tot expressie brengen te sorteren. Verifieer de gating met de dubbelgelabelde cellen.
Sorteer 2.000 tot 4.000 cellen uit de populatie van belang in 5 microliter koude FACS-buffer in een microcentrifugebuisje op ijs. Breng vervolgens 1 microliter van de gesorteerd cellen over in een nieuwe FACS-buis met 100 microliter FACS-sorteringsbuffer en een 1 op 1.000 verdunning van levend/dood kleurstof. En voer het celmonster uit met behulp van de sorteerpoorten om de levensvatbaarheid na het sorteren te beoordelen.
Laad vervolgens 1 microliter cellen verdund in 9 microliter FACS-buffer op een hemocytometer om de celconcentratie en gemiddelde diameter te bepalen. Selecteer nu een geïntegreerd microfluïdisch circuit, of IFC-chip, van de juiste grootte voor de gemiddelde celdiameter van het monster, en primeer de vloeistof volgens de instructies van de fabrikant. Laad de cellen op de plaat volgens de instructies van de fabrikant, en laad de plaat in een compatibele vloeistofmachine.
Voer vervolgens een geschikt celbelastingscript uit voor de IFC-chip om de cellen in de opvangbanen te duwen. Om te bevestigen dat de cellen in de opvangplaatsen zijn gelokt, monteer de plaat op een microscoop uitgerust met een plaatadapter en verkrijg helderveld- en fluorescentiebeelden van elke opvangplaats bij een 10x vergroting. De cellen kunnen vervolgens worden verwerkt voor downstream-beoordeling van hun doelgenexpressie door QRT-PCR.
In het 18-somietstadium kan fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om de ZsYellow-expressie van de embryo's te verifiëren. Na het sorteren worden cellen met een reeks diameters verkregen. De IFC-plaat kan worden gebruikt om
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang en het beoordelen van genexpressie van enkele cellen met behulp van een op microfluïdica gebaseerd systeem. Deze techniek onthult cellulaire heterogeniteit die vaak verborgen blijft in traditionele populatiegebaseerde methoden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
- Genexpressieanalyse
Achtergrond
- Het isoleren van enkele cellen uit embryo's is technisch uitdagend.
- Deze methode maakt een onbevooroordeelde beoordeling van transcriptionele veranderingen mogelijk.
- Het begrijpen van celspecificatie en differentiatie is cruciaal in de ontwikkelingsbiologie.
- Microfluïdische systemen verbeteren de efficiëntie van single-celanalyse.
Doel van het onderzoek
- Om enkele cellen uit vroegstadium zebravis-embryo's te isoleren.
- Om deze cellen te vangen voor genexpressieanalyse.
- Om transcriptionele veranderingen tijdens celdifferentiatie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van enkele cellen uit zebravis-embryo's.
- Verrijking van specifieke celtypen.
- Gebruik van op microfluïdica gebaseerde systemen voor celvangst.
- Beoordeling van genexpressie van individuele cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare enkele cellen.
- Identificatie van transcriptionele heterogeniteit tussen cellen.
- Demonstratie van de efficiëntie van de methode bij het verwerken van monsters.
- Inzichten in ontwikkelingsprocessen door genexpressieanalyse.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van celdifferentiatie.
- Het vergemakkelijkt een dieper begrip van de ontwikkelingsbiologie.
- Het beheersen van de techniek maakt snelle verwerking van monsters mogelijk.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-cell isolation and gene expression profiling from zebrafish embryos enables high-resolution analysis of cellular heterogeneity during early vertebrate development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation by revealing transcriptional diversity and intermediate differentiation states. Integrating these workflows at the discovery stage enhances predictive confidence for downstream portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental gene expression at the single-cell level for pathway clarification.
- Supports biological de-risking by distinguishing progenitor and differentiating cell populations.
- Facilitates functional target validation through unbiased detection of cellular heterogeneity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell suspensions for high-throughput multiplexing and sequencing assays.
- Standardizes cell isolation and viability assessment for reproducible downstream workflows.
- Enables quantitative gene expression readouts for robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant developmental models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation by enabling transcriptomic profiling of defined cell types.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying cellular responses to genetic or chemical perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions single-cell analysis at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in vertebrate models.
- Discovery Biology: Reveals transcriptional changes during specification and differentiation for pathway analysis.
- Screening: Delivers standardized, viable single-cell preparations for multiplexed gene expression assays.
- Analytics: Provides quantitative gene expression data and heterogeneity metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of developmental gene expression signatures with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse cell types and genetic backgrounds in zebrafish.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental studies.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying cellular heterogeneity and differentiation trajectories.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in zebrafish handling, cell dissociation, and microfluidics.
- Needs access to fluorescence-activated cell sorting and microfluidic capture platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell viability and gating strategies.
- Adaptable to various transgenic lines and developmental stages with appropriate markers.
- Dependent on careful optimization to ensure single-cell capture and minimize technical variability.
