Name: TRUE Gene Silencing: Screening van een heptameer-type Kleine Gids RNA bibliotheek voor potentiële Cancer Therapeutische Agents (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer een protocol voor het screenen van heptameer-type sgRNA-bibliotheken om potentiële therapeutische middelen tegen bloedkanker te identificeren. Deze methode versnelt het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door flexibele en naadloze Technology Transfer Program via Target-gedreven R &amp; D, Japan Science and Technology Agency, de Science Research Stimuleringsfonds voor de actie en de Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan, en de JSPS KAKENHI Grant Numbers 24300342 en 15H04313 .

1. Bouw van een heptameer-type sgRNA Library <ol><li> Selecteer een subset van de 16.384 (4 7) 7-nt sequenties tenzij de full-scale bibliotheek te construeren. LET OP: De sequenties kunnen willekeurig en / of om specifieke cellulaire RNA&#39;s doelwit. Voor dit laatste voorbeeld haarspeldstructuren lijkt de T-arm van tRNA in een doel-RNA met behulp van een geschikt computerprogramma en / of visueel en selecteer sequenties complementair aan 7-nt sequenties onmiddellijk stroomafwaarts van de haarspeldstructuren 4,10, 17,18. </li><li> Synthetiseren elk van de geselecteerde heptameren als volledig 2&#39;-methylated, 5&#39;- en 3&#39;-gefosforyleerd RNA een DNA / RNA synthesizer. Gebruik de fosforamidiet methode op gecontroleerde porie glas (CPG) support, en laat de 5&#39;-terminale 4,4&#39;-dimethoxy- trityl (DMT) beschermende groep in de laatste cyclus (de toevoeging van de 5 &#39;fosfaat) van de synthese 23. LET OP: Aangepaste synthetic RNA kan ook worden verkregen uit oligonucleotide leveranciers. </li><li> Na voltooiing van de laatste synthesecyclus Breng het CPG het gesynthetiseerde oligonucleotide van de kolom een ​​glazen flacon met een Teflon-bekleding schroefdop, voeg 1 ml 29% ammoniumhydroxide, en incubeer deze bij 55 ° C gedurende 8 uur tot klieven het oligonucleotide uit de CPG en verwijder de beschermende groepen van de grondslagen en fosfaten. </li><li> Damp ammoniumhydroxide met een centrifugale verdamper bij 40 ° C en opnieuw los het oligonucleotide in 0,2 ml 0,1 M n-hexylammonium acetaat. </li><li> Zuiver het synthetische oligonucleotide door middel van reverse-fase hoge prestatie vloeistofchromatografie onder toepassing van polystyreen-divinylbenzeen kolom met een buffer met 10-50% acetonitril / 0,1 M n-hexylammonium acetaat. Run de kolom bij 2,0 ml / min gedurende 25 min bij 80 ° C. </li><li> Voeg 0,25-0,5 ml geconcentreerd azijnzuur op de gefractioneerde monster (1-2 ml) een 20% azijnzuuroplossing maken en incubate deze oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de DMT groep verwijderd. </li><li> Droog het monster met een centrifugale verdamper bij 40 ° C, opnieuw oplossen in 1 ml 29% ammoniumhydroxide, en incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur aan de zijketen van het 5 &#39;fosfaat te verwijderen. </li><li> Verminder het volume (1 ml) van het monster tot ongeveer 0,3 ml met een centrifugale verdamper bij 40 ° C. </li><li> Dialyseer de gehele geconcentreerde monster tegen gedestilleerd water (500 ml) onder toepassing van een dialysebuis met een molecuulgewicht cut-off 1000 bij 4 ° C overnacht. </li><li> Breng het gedialyseerde monster uit de dialysebuis een 1,5 ml buis met een pipet, drogen met een centrifugale verdamper bij 40 ° C en vervolgens opnieuw oplossen in water-voor-injectie-grade water, waarvan het volume moet klein genoeg om meer dan 100 pM oplossing. </li><li> Meet een optische dichtheid van het RNA monster bij 260 nm met een spectrofotometer en pas de concentratie 100uM door toevoeging van water-for-injection-grade water. Bewaar de oplossing bij RNA beneden -20 ° C voor gebruik. </li></ol> 2. Screening van de sgRNA Bibliotheek voor de levensvatbaarheid van de cellen <ol><li> Bereid 10 3 cellen / 99 ul / putje (bijvoorbeeld HL60 en RPMI-8226) op een 96-putjes in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Bereid putjes die de media alleen achtergrond aftrek. Om randeffecten te elimineren, voeg steriel water om putten rond de monsterputjes legen. </li><li> Voeg 1 pl heptameer type sgRNA (100 uM) opgelost in water-voor-injectie-grade water aan elk putje. Assay elke sgRNA in drievoud. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3 dagen. </li><li> Voeg een zodanige hoeveelheid van een commercieel verkrijgbare WST-8-oplossing aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C in dezelfde incubator gedurende 1 tot 4 uur. </li><li> Meet de absorptie van eent 450 nm met een microplaat reader. Opmerking: In de meeste gevallen wordt lineariteit tussen absorptie en levensvatbaar celaantal te handhaven indien de absorptiewaarde boven 1,0. </li></ol> 3. Evaluatie van de effectieve sgRNAs door flowcytometrie <ol><li> Bereid 10 3 cellen / 99 ul / putje (bijvoorbeeld HL60) op een 96-putjes in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Maak minstens 10 putjes één sgRNA te testen. Om randeffecten te elimineren, voeg steriel water om putten rond de monsterputjes legen. </li><li> Voeg 1 pl heptameer type sgRNA (100 uM) opgelost in water-voor-injectie-grade water aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3 dagen. </li><li> Verzamel de cellen behandeld met dezelfde sgRNA van ten minste 10 putjes in een 5 ml-buis met een pipet. Spin de buis gedurende 5 minuten in een centrifuge bij 300 XG, en gooi de media. </li><li> Voeg 2 ml van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de buis en resuspendeer de cellen. Spin de buis gedurende 5 minuten in een centrifuge bij 300 g, en gooi PBS. Voeg 150 ul van 1 x annexine V binding buffer aan de buis en resuspendeer de cellen. </li><li> Voeg 2 pl fycoerytrine (PE) geconjugeerd annexine V-oplossing en 1 gl 7-amino-actinomycine D (7AAD) oplossing voor de buis goed mengen en incubeer de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Analyseer het monster met een flow cytometer 24. </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

De Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences heeft een lopende octrooiaanvraag op een deelverzameling van de heptamer-type sgRNA's.

In de meeste gevallen lijken volledig 2′-O-gemethyleerde, 5′- en 3′-gefosforyleerde heptameer-type sgRNA's, opgelost in water voor injectie (met een concentratie van 100 µM), stabiel te zijn onder -20 °C gedurende minimaal een jaar, te oordelen naar hun activiteit om apoptose in kankercellen te induceren. Hun stabiliteit zou echter veranderen afhankelijk van hun sequentie, kwaliteit en zuiverheid. In sommige gevallen lijkt 5′- of 3′-fosfaat van een deel van de sgRNA-moleculen spontaan te worden verwijderd tijden...

TRUE genuitschakeling (genoemd na tR Nase ZL - u tilizing e fficacious genuitschakeling) is een van de RNA-gerichte gene silencing technologie 1. Deze technologie werd ontwikkeld op basis van eigenschappen van tRNase ZL (of 3 &#39;tRNase), tRNA 3&#39; verwerking endoribonuclease: het kan elke doel-RNA op een verwachte plaats splitsen onder leiding van een kunstmatige geleidepen RNA (sgRNA) door het herkennen pre-tRNA-achtige of micro-pre-tRNA-achtige structuur gevormd tussen het doelwit-RNA en sgRNA 2-9. sgRNA, dat gewoonlijk 7-31 nt lang is onderverdeeld in vier groepen, 5&#39;-half-tRNA, heptameer RNA, 14-nt lineair RNA en RNA haak. We hebben de effectiviteit van TRUE gene silencing aangetoond door de invoering van verschillende kunstmatig ontworpen sgRNAs in levende cellen 10-15. We hebben ook aangetoond dat sgRNAs kan worden opgenomen door cellen without elke transfectiereagentia en kunnen hun doelwit RNA-spiegels downregulate en / of apoptose in menselijke kankercellen 16-18. TRUE genuitschakeling lijkt te werken op de intracellulaire en intercellulaire genregulerend netwerksysteem via tRNase ZL en natuurlijke sgRNAs 19-21. We hebben een sgRNA bibliotheek met 156 heptameer-type sgRNAs geconstrueerd om te zoeken naar potentiële therapeutische heptameer-type sgRNAs voor bloedkanker 22. We hebben het gescreend op het effect op de levensvatbaarheid van humane myeloma en leukemie cellen en vonden dat 20 ze efficiënt apoptose in ten minste één van de kanker cellijnen kan induceren. En 4 ervan is aangetoond dat tumorgroeisnelheden in muis xenograft experimenten verminderen. Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker. Het protocol bevat hoehet sgRNA construeren, hoe het effect van elke sgRNA op cellevensvatbaarheid en hoe de effectieve sgRNAs verdere beoordeling door flowcytometrie beoordelen. Analyse voor sgRNA de cellulaire doelwit RNA en evaluatie van effectieve sgRNAs in muizen xenograft modellen kan worden uitgevoerd volgens conventionele werkwijzen 17,22, hoewel deze niet in dit protocol.

<table><tbody><tr><td>Custom heptamer RNA</td><td>Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoSep Prep HC Cartridge</td><td>Transgenomic</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>Water-for-injection-grade Water</td><td>Otsuka Pharmaceutical&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 solution</td></tr><tr><td>Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS Round-Bottom Tube</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

true gene silencing: screening van een heptameer-type kleine gids rna bibliotheek voor potentiële cancer therapeutische agents

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE genuitschakeling (genoemd na tR Nase ZL - u tilizing e fficacious genuitschakeling) is een van de RNA-gerichte gen silencing technieken, die een kunstmatige geleidepen RNA (sgRNA) ingezet om tRNA 3 &#39;verwerking endoribonuclease, tRNase ZL gids , een doel-RNA te herkennen. sgRNAs kunnen door cellen worden zonder transfectie reagentia en hun doel-RNA niveaus downreguleren en / of apoptose in humane kankercellen. We hebben een sgRNA bibliotheek met 156 heptameer type sgRNAs voor het effect op de levensvatbaarheid van humane myeloma en leukemie cellen onderzocht en vonden dat 20 ze efficiënt apoptose in ten minste één van de kanker cellijnen kan induceren. Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker. Het protocol bevat hoe de sgRNA bibliotheek te construeren, hoe het effect van elke sgRNA op de levensvatbaarheid van de cellen, en te beoordelen hoe om te further evalueren effectieve sgRNAs met flowcytometrie. Rond 2000 treffers zou naar verwachting worden verkregen door het screenen van de full-scale sgRNA bibliotheek bestaat uit 16.384 heptameren.

De zes heptameer type sgRNAs 5&#39;-AUCUUCA-3 &#39;(H1885), 5&#39;-ACACACA-3&#39; (H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3 &#39;(H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3&#39; (H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287) en 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) werden chemisch gesynthetiseerd als 2&#39;-O-methyl RNA-bevattende 5&#39;- en 3&#39;-fosfaten. Deze sgRNAs werden onderzocht op de effecten op de levensvatbaarheid van een menselijke leukemie cellijn, ...

Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker.

TRUE Gene Silencing: Screening van een heptameer-type Kleine Gids RNA bibliotheek voor potentiële Cancer Therapeutische Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Het algemene doel van deze screening is het vinden van potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker. Begin deze procedure door een subset van heptameersequenties te selecteren. De sequenties kunnen willekeurig zijn of ontworpen om specifieke cellulaire RNA's te targeten. Om specifieke cellulaire RNA's te targeten, gebruikt u een geschikt computerprogramma om haarspeldstructuren te vinden die lijken op de T-arm in een doel-RNA. Selecteer complementaire sequenties van zeven nucleotiden direct stroomafwaarts van de haarspeld. Synthetiseer elke geselecteerde heptameer met de DNA-RNA-synthesizer als een volledig 2-prime O-gemethyleerd, 5-prime en 3-prime gefosforyleerd RNA met de fosforamidietmethode op gecontroleerd poreus glas, of CPG-drager. Laat de 5-prime terminale DMT-beschermende groep in de laatste cyclus van de synthese behouden. Na voltooiing van de laatste cyclus brengt u de CPG met het gesynthetiseerde oligonucleotide vanuit de kolom over naar een glazen vial met een teflon-gevoerde schroefdop. Voeg 1mL 29% ammoniumhydroxide toe en incubeer de buis bij 55

true-gene-silencing-screening-heptamer-type-small-guide-rna-library

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier gebruiken we een menselijke esiRNA bibliotheek in een high-throughput screen voor genen die betrokken zijn bij de celdeling. Laten we zien hoe het opzetten en uitvoeren een esiRNA schermen, en hoe te analyseren en valideren van de resultaten.

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

Hier gebruiken we een menselijke LentiPlex samengevoegde bibliotheek en traditionele sequencing methoden om gen-doelstellingen het bevorderen van overleving van de cel te identificeren. Laten we zien hoe op te zetten en deconvolute een LentiPlex scherm en valideren van de resultaten.

MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene...

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Een CRISPR/sgRNA-bibliotheek is toegepast op het ondervragen van eiwit-codeert genen. De haalbaarheid van een bibliotheek van de sgRNA aan het licht brengen van de functie van een scheidingswand CTCF in genregulatie blijft echter onontgonnen. Hier beschrijven we een HOX loci specifieke sgRNA bibliotheek te verhelderen van de functie van CTCF grenzen in HOX loci.

HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Leer een protocol voor het screenen van heptameer-type sgRNA-bibliotheken om potentiële therapeutische middelen tegen bloedkanker te identificeren. Deze methode versnelt het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen.

TRUE Gene Silencing: Screening van een heptameer-type Kleine Gids RNA bibliotheek voor potentiële Cancer Therapeutische Agents

Meer video's verkennen