Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Het algemene doel van deze procedure is om fibroblasten om te zetten in insuline-afscheidende cellen zonder pluripotentie te induceren of retrovirale vectoren te gebruiken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van regeneratieve geneeskunde en met name bij celtherapie voor diabetes. Het grote voordeel van deze techniek is dat we een verandering in het fenotype kunnen verkrijgen zonder een stabiel pluripotente toestand in de bekeerde cellen te induceren en zonder retrovirale vectoren.

Georgia Pennarossa, een post-doc in ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om deze procedure te beginnen, voegt u 1,5 milliliter steriele 0,1% varkensgelatine toe aan de 35-millimeter petrischalen en laat u de coating gedurende twee uur op kamertemperatuur plaatsen. Was vervolgens de humane huidbiopsieën met PBS aangevuld met 2% antibioticum-antimycotische oplossing.

Plaats daarna de biopsieën in een 100-millimeter petrischaal en snijd ze in ongeveer twee kubieke millimeter fragmenten met steriele scalpels. Plaats vervolgens vijf tot zes huidfragmenten in de vooraf gecoate 35-millimeter petrischaal. Voeg een druppel fibroblastmedium toe over elk fragment en kweek ze bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.

Na zes dagen incubatie, gooit u de weefselfragmenten voorzichtig weg. De fibroblasten zouden uit de weefselfragmenten moeten beginnen te groeien en een celmonolaag moeten beginnen te vormen. Bij deze procedure kweekt u de fibroblasten bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide tot 80% confluentie.

Plaat vervolgens de cellen in nieuwe kweekschalen. Kweek ze bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide en houd het passageverhouding tussen één op twee en één op vier, afhankelijk van de groeisnelheid. Voeg vervolgens 0,1% varkensgelatine toe aan de celkweekschalen en laat het twee uur coaten.

Verwijder overtollig coatingoplossing 10 tot 30 minuten voorafgaand aan het beplaten van fibroblasten. Verwijder vervolgens het fibroblastcultuurmedium uit de kweekschalen. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 1% antibioticum-antimycotische oplossing.

Voeg vervolgens een dunne laag Trypsin-EDTA-oplossing toe. Incubeer het bij 37 graden Celsius totdat de celmonolaag zich begint los te maken van de bodem van de weefselkweekschaal en de cellen dissociëren. Verdun vervolgens de celsuspensie met negen delen fibroblastcultuurmedium om de trypsinactie te neutraliseren.

Tel vervolgens de cellen met behulp van een tellingskamer onder de microscoop bij kamertemperatuur. Bereken het volume fibroblastcultuurmedium dat nodig is om de cellen te resuspenderen en om de celconcentratie van 7,8 keer 10 tot de 4e fibroblast per vierkante centimeter te verkrijgen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 150 g bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen met een berekend volume fibroblastcultuurmedium. Plaat vervolgens de cellen op de 0,1% gelatine vooraf gecoate schalen en kweek ze gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Op dag nul, onmiddellijk voor gebruik, bereid een 5-aza-CR stamoplossing voor door 2,44 milligram 5-aza-CR op te lossen in 10 milliliter DMEM hoog glucose medium.

Steriliseer het door filtratie. Verdun vervolgens één microliter 5-aza-CR stamoplossing in één milliliter fibroblastcultuurmedium. Om de celplasticiteit te verhogen, verwijdert u 24 uur na celbeplating het kweekmedium van de gezaaide fibroblasten.

Voeg één micromolaire 5-aza-CR stamoplossing toe en kweek gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Op dag één bereidt u vers HP medium. Na incubatie met één micromolaire 5-aza-CR, verwijdert u het medium en wast u de cellen drie keer met HP medium om ervoor te zorgen dat 5-aza-CR wordt weggespoeld.

Incubeer vervolgens de 5-aza-CR behandelde fibroblasten met HP medium gedurende drie uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Controleer eventuele morfologische veranderingen om de efficiëntie van de 5-aza-CR behandeling te controleren. Cellen zouden de typische langwerpige morfologie van fibroblasten moeten verliezen en een kleinere ronde of ovale vorm moeten krijgen met vergrote kernen.

Op dag één tot zes bereidt u het pancreas basale medium en Activin A stamoplossing voor. Kweek vervolgens de 5-aza-CR behandelde fibroblasten in pancreas basaal medium aangevuld met Activin A stamoplossing gedurende zes dagen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide en ververs het medium dagelijks. Op dagen zeven tot acht bereidt u retinoïnezuur stamoplossing voor door 16,6 milliliter DMSO toe te voegen aan 50 milligram retinoïnezuur.

Kweek de cellen in pancreas basaal medium aangevuld met Activin A stamoplossing en retinoïnezuur stamoplossing gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide en ververs het medium dagelijks. Op dagen negen tot 36 kweekt u de cellen en pancreas basaal medium aangevuld met ITS, B27 en BFGS stamoplossing en ververs het medium dagelijks gedurende de eerste 15 dagen en ververs het medium elke andere dag vanaf dag 16. Kweek de cellen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.

Deze figuur toont de morfologische veranderingen die plaatsvinden tijdens de endocrine pancreasdifferentiatie. Na zeven dagen inductie organiseren menselijke cellen zich geleidelijk in clusters. Als reactie op de toevoeging van retinoïnezuur, herschikken ze zich in een reticulair patroon en groepen ze zich samen in onderscheidbare aggregaten.

Deze formaties vorderen met de tijd, rekruten cellen en aggregatie vergroten 3D-kolonies. Uiteindelijk worden kolonies bolvormige structuren die de neiging hebben om los te komen en vrij in het kweekmedium te stromen, wat doet denken aan typische pancreaseilandjes in vitro. Na 36 dagen van pancreasinductie keerden de globale DNA-methylatieniveaus van humane epigenetisch geconverteerde cellen terug naar die waargenomen in de onbehandelde fibroblasten.

De co-lokalisatie van PDX1 met CPEP wordt