Name: Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer hoe je huidfibroblasten omzet in insuline-afscheidende cellen via epigenetische conversie zonder pluripotentie of retrovirale vectoren. Deze veilige methode biedt nieuwe mogelijkheden voor celtherapie bij diabetes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Carraresi Foundation en de Europese Stichting voor de Studie van Diabetes (EFSD). GP wordt ondersteund door een post-doc fellowship van de Universiteit van Milaan. De auteurs zijn lid van de COST Actie FA1201 Epiconcept: Epigenetica en Periconception omgeving en de COST Actie BM1308 Sharing voorschotten op grote diermodellen (SALAAM). TALB is lid van de COST Actie CM1406 Epigenetische Chemical Biology (EPICHEM).

Opmerking: Alle hieronder beschreven procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming kap onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat alle cultuur procedures worden uitgevoerd op thermostaatkraan podia bij 37 ° C gedurende hun behandeling uitgevoerd en cellen worden gehandhaafd. 1. Skin Fibroblast Isolation <ol><li> Bereid Cultuur Dish Coating Solution <ol><li> Los 0,1 g varkensgelatine in 100 ml water (eindconcentratie 0,1%). Steriliseren oplossing met een autoclaaf. </li><li> Voeg 1,5 ml steriel 0,1% varkensgelatine tot 35 mm petrischalen. Wacht 2 uur om de vacht, het behoud van hen bij kamertemperatuur. Opmerking: menselijke huid biopten worden verzameld door excisie onder plaatselijke verdoving een avasculaire gebied van het voorste aspect van de onderarm en opgeslagen in Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% antibiotica-antimycotische oplossing bij 4 ° C vóór gebruik. </li></ol></li><li> Wassen biopten met nieuwe PBS gesupplementeerd met 2% antibiotische antimycotische oplossing. </li><li> Plaats biopsieën in een 100 mm petrischaal en snijd ze in ongeveer 2 mm 3 fragmenten met steriele scalpels. </li><li> Verwijder de overmaat bekledingsoplossing direct voorafgaand aan uitplaten fragmenten. </li><li> Plaats 5-6 huid fragmenten in de pre-gecoate 35 mm petrischaal. </li><li> Bereid fibroblast kweekmedium: 77% Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose, 20% foetaal runderserum (FBS), 1% L-Glutamine-oplossing en 2% antibiotica antimycotische oplossing. </li><li> Voeg een druppel fibroblast medium dan elk fragment (meestal 100 pl per fragment) en kweken ervan bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Na 24 uur, voeg 500 pl fibroblast kweekmedium via fragmenten om ze vochtig houden 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Verander het medium met een pipet ten minste eenmaal per 48 uur. </li><li> Na 6 dagen incubatie, verwijder weefsel fragmenten voorzichtig en gooi ze weg. Let op: Na 6 dagen, fibroblasts beginnen te groeien uit het weefsel fragmenten en beginnen een cel monolaag te vormen. </li><li> Vernieuwen medium, voeg 2 ml fibroblast kweekmedium en blijven cel monolaag cultuur bij 37 ° C in 5% CO 2 incubator. </li></ol> 2. Fibroblast Cultuur <ol><li> Fibroblasten kweek bij 37 ° C in 5% CO2 tot 80% confluentie </li><li> Voor passage, aspireren fibroblast kweekmedium uit weefselkweek gerechten. Was de cellen drie keer met 4 ml PBS aangevuld met 1% antibioticum antimycoticum oplossing. </li><li> Voeg een dunne laag (10% van het kweekmedium volume) van trypsine-EDTA-oplossing (0,5 g / l varkens trypsine en 0,2 g / l EDTA) en incubeer bij 37 ° C tot cel monolaag begint los van de bodem van het weefsel cultuur schotel en cellen distantiëren. </li><li> Verdun celsuspensie met 9 delen van fibroblast kweekmedium trypsine actie te neutraliseren. Centrifugatie niet noodzakelijk. </li><li> Plaat cellen in nieuwe cultuur gerechten (metuit gelatine) en de cultuur bij 37 ° C in 5% CO 2 incubator. Houd de doorgang verhouding tussen 1: 2 en 1: 4, afhankelijk van de groeisnelheid. </li><li> Wanneer de cellen bereikt ongeveer 80% confluentie passage daarvan (meestal twee keer per week). </li></ol> 3. fibroblast Plating voor Epigenetische Conversion <ol><li> Voeg 0,26 ml / cm 2 of 0,1% varkensgelatine (bereid zoals beschreven in 1.1) naar celkweekschalen. Wacht 2 uur tot vacht. </li><li> Verwijder de overtollige coatingoplossing 10-30 min voorafgaand aan uitplaten fibroblasten. </li><li> Verwijder fibroblast kweekmedium van cultuur gerechten. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 1% antibioticum antimycoticum oplossing. </li><li> Voeg een dunne laag (10% van het kweekmedium volume) van trypsine-EDTA-oplossing (0,5 g / l varkens trypsine en 0,2 g / l EDTA) en incubeer bij 37 ° C tot cel monolaag begint los van de bodem van het weefsel cultuur schotel en cellen distantiëren. </li><li> Verdun celsuspensie met 9 delen fibroblast kweekmedium trypsine actie te neutraliseren. </li><li> Aantal cellen met behulp van een telkamer onder een microscoop bij kamertemperatuur. Bereken het vereiste volume van fibroblast kweekmedium om cellen te resuspenderen, een celconcentratie van 7,8 x 10 4 fibroblasten / cm2 verkregen. Dit zal afhangen van het specifieke type gebruikte kamer. Cellen / l = Gemiddeld aantal cellen per kleine rooster x 90 (vermenigvuldigingsfactor) x verdunning </li><li> Centrifugeer celsuspensie bij 150 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen met de eerder berekende volume van fibroblast kweekmedium. </li><li> Plaat cellen op 0,1% gelatine vooraf beklede schalen en kweken ervan gedurende 24 uur bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. </li></ol> 4. Verhoog Cell Plasticiteit De demethyleren Agent 5-aza-CR <ol><li> dag 0 <ol><li> Bereid 5-aza-CR voorraadoplossing door het oplossen van 2,44 mg van 5-aza-CR 10 ml DMEM hoge glucose medium. Steriliseren door middel van filtratie. Bereid 5-aza-CR stock onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Verdun 1 pi van 5-aza-CR voorraadoplossing in 1 ml fibroblast kweekmedium (eindconcentratie 1 uM). </li><li> Naar cel plasticiteit, 24 uur na plateren cell (post 3,8) toeneemt, verwijdert kweekmedium geënt fibroblasten en voeg 1 uM 5-aza-CR voorraadoplossing en kweek gedurende 18 uur bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Vers bereid pluripotente menselijke (HP) medium volgens Tabel 1. </li><li> Na incubatie met 1 uM 5-aza-CR, verwijderen medium en wassen cellen drie keer met PBS zodat 5-aza-CR wordt weggespoeld. </li><li> Incubeer 5-aza-CR behandelde fibroblasten HP medium voor 3 uur (herstelperiode) bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Na de herstelperiode, te verwijderen medium, was drie keer met PBS. </li><li> Om de efficiëntie van 5-aza-CR behandeling te controleren, controleren in deze stap fof de aanwezigheid van morfologische veranderingen (gespecificeerd in resultaten sectie). Cellen verliezen de typische langwerpige morfologie van fibroblasten en het verwerven van een ronde of ovale vorm, steeds kleiner in omvang, met vergrote kernen. </li><li> Ga verder met pancreas differentiatie. </li></ol></li></ol> 5. Pancreatic Differentiatie Protocol <ol><li> dagen 1-6 <ol><li> Bereid Pancreatic Basale Medium zoals beschreven in Tabel 2. </li><li> Bereid activine A voorraad: los 5 ug activine A recombinant humaan eiwit in 166,6 ul van steriel water. </li><li> Cultuur 5-aza-CR behandelde fibroblasten in 0,26 ml / cm2 alvleesklier- Basal Medium, aangevuld met 1 ul / ml activine A voorraadoplossing (zie 5.1.2) gedurende 6 dagen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Veranderen medium elke dag. </li></ol></li><li> dagen 7-8 <ol><li> Bereid retinoïnezuur voorraadoplossing door het toevoegen van 16,6 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om 50 mg reti- acid. </li><li> Kweekcellen in 0,26 ml / cm2 Pancreatic basismedium gesupplementeerd met 1 ul / ml activine A voorraadoplossing (zie 5.1.2) en 1 ul / ml voorraadoplossing retinoïnezuur (zie 5.2.1) gedurende 2 dagen bij 37 ° C in 5% CO2. Veranderen medium elke dag. </li></ol></li><li> dagen 9-36 <ol><li> Kweekcellen in 0,26 ml / cm2 Pancreatic basismedium gesupplementeerd met 1% (v / v) insuline-transferrine-selenium (ITS), 2% (v / v) B27 en 0,1% (v / v) recombinant humaan FGF basis- (bFGF) stockoplossing (zie tabel 1) bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Verander het medium dag gedurende de eerste 15 dagen. </li><li> Vanaf dag 16 verder, verversen medium om de dag, onder een microscoop, aangezien vormende geaggregeerde cellen los van de bodem van de kweekschaal. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dit manuscript beschrijft een werkwijze die de omzetting van menselijke huidfibroblasten in insulineproducerende cellen toestaat, door een voorbijgaande en korte blootstelling aan 5-aza-CR, gevolgd door een weefselspecifieke inductieprotocol. Deze benadering maakt een overstap van mesoderm naar endoderm gerelateerde cellen, zonder dat de geforceerde expressie van transcriptiefactoren of microRNAs, noch de verwerving van een stabiele pluripotente toestand, dat cellen meer instabiel en gevoelig voor fouten 14 m...

Een fundamentele doelstelling van de regeneratieve geneeskunde is het genereren van nieuwe, functionele cellen die kunnen worden gebruikt voor het repareren of vervangen van beschadigde, ontaardde weefsels. Herbouwen gemakkelijk beschikbaar volwassen cellen in nieuwe, door ze te converteren van de ene cel naar het andere, is een bijzonder aantrekkelijke benadering, vooral wanneer de gewenste celpopulatie niet overvloedig of moeilijk toegankelijk. Echter, volwassen cellen opmerkelijk stabiel. Zij krijgen hun gedifferentieerde toestand via een geleidelijke beperking van hun mogelijkheden en, als ze eenmaal de volwassen terminal specialisatie te bereiken, ze stabiel te houden dat 1. In de afgelopen jaren een aantal protocollen ontwikkeld, dat de herprogrammering mogelijk om pluripotentie van een somatische cel (iPS) gerealiseerd door geforceerde expressie van een aantal transcriptiefactoren 2,3. Als alternatief kan de cel conversie worden verkregen door directe afstamming transdifferentiatie, de invoering van een enkele 4 </sup&gt; of een combinatie van transcriptiefactoren 5-7. Deze strategie is niet de overgang door middel van een-de gedifferentieerde toestand te betrekken, maar vereist een hoge expressie van het specifieke transcriptiefactoren 8. We hebben onlangs een conversie protocol gebaseerd op de korte blootstelling van volwassen cellen aan de demethylerende eigenschappen van het cytidine analoog 5-azacytidine (5-aza-CR), een goed gekarakteriseerde DNA-methyltransferase inhibitor. De demethylering stap wordt onmiddellijk gevolgd door een differentiatie protocol 9-11 waarmee de vereiste terminal fenotype te verkrijgen. Deze methode kan rijpe, gedifferentieerde cellen omgezet in cellen van een ander geslacht en heeft aanzienlijke voordelen voor zowel het gebruik van virale vectoren en transfectie van elke exogene transcriptiefactoren voorkomen. De overname van een stabiele pluripotente toestand, en de daarmee samenhangende verhoogde gevoeligheid voor instabiliteit cel wordt ook vermeden. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; De gedetailleerde protocol dat de omzetting van volwassen menselijke huid fibroblasten in volledig functionele insuline uitscheidende cellen te bestuderen wordt hier gepresenteerd. Het is echter opgemerkt dat de techniek toegepast op verschillende celtypes en positieve resultaten heeft gegenereerd, bij het adresseren cellen aan verschillende differentiatieomzettingswegen. Bovendien is epigenetische omzetting met succes gebruikt in de humane en varkens 9-13 en bij honden (manuscript ingediend) suggereert een grote effectiviteit en robuustheid van de benadering.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS; voor celwassing en oplossingsbereiding</td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>Component van Fibroblast, HP en Pancreatische media</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>Voor fibroblastisolatie</td></tr><tr><td>Porcine Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Voor schaalcoating</td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Voor oplossingsbereiding</td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>Voor fibroblastisolatie</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>Voor fibroblastcultuurmedium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td>FBS; Component van fibroblast- en HP-media</td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Component van fibroblast-, HP- en pancreatische media</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Voor fibroblastdissociatie</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Celtelling</td></tr><tr><td>5-Azacytidine</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, voor verhoging van celplasticiteit in fibroblasten</td></tr><tr><td>Ham's F-10 Nutrient Mix</td><td>Life Technologies</td><td>31550031</td><td>Voor HP-medium</td></tr><tr><td>DMEM, lage glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>31885023</td><td>Voor HP-medium</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>Component van HP-medium</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Life Technologies</td><td>11140035</td><td>Component van HP- en pancreatische basaalmedium</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Component van HP- en pancreatische basaalmedium</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium</td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td>Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium</td></tr><tr><td>Cytidine</td><td>Sigma</td><td>C4654</td><td>Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td>Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T1895</td><td>Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Voor het steriliseren van oplossing</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td>bFGF; Component van HP- en pancreatische basaalmedium</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>BSA; Component van pancreatisch basaalmedium</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td>Voor pancreatisch basaalmedium</td></tr><tr><td>B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>Component van pancreatisch medium</td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Component van pancreatisch basaalmedium</td></tr><tr><td>Activin A Recombinant Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG9014</td><td>Voor pancreatisch medium</td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Voor pancreatisch medium</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO; voor bereiding van retinoïnezuurvoorraaddeling</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>ITS; voor pancreatisch eindmedium</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:100</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI. Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning&nbsp; 1 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>5-Methylcytidine</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:500</td></tr><tr><td>Anti-C Peptide antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:100</td></tr><tr><td>Anti-PDX1 antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia Insulin ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>Voor insuline-afgiftedetectie</td></tr></tbody></table>

epigenetische conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regeneratieve geneeskunde vereist nieuwe, volledig functionele cellen die aan patiënten worden geleverd om gedegenereerd of beschadigd weefsel te herstellen. Wanneer dergelijke cellen niet direct beschikbaar zijn, kunnen ze worden verkregen met behulp van verschillende benaderingen, waaronder reprogrammering en transdifferentiatie, met voor- en nadelen die specifiek zijn voor de verschillende technieken. Hier wordt een nieuwe strategie beschreven voor de omzetting van een volwassen volwassen fibroblast in een insuline-afscheidende cel, willekeurig aangeduid als epigenetisch geconverteerde cellen (EpiCC). De methode is ontwikkeld op basis van het toenemende begrip van de mechanismen die de epigenetische regulatie van celbestemming en differentiatie controleren. In het bijzonder gebruikt de eerste stap een epigenetisch modificator, namelijk 5-aza-cytidine, om volwassen cellen in een "zeer permissieve" toestand te brengen. Het profiteert vervolgens van deze korte en omkeerbare venster van epigenetische plasticiteit, om cellen opnieuw te richten naar een andere lijn. De aanpak wordt aangeduid als "epigenetische celconversie". Het is een eenvoudige en robuuste manier om een efficiënte, gecontroleerde en stabiele celinter-lijnswitch te verkrijgen. Aangezien het protocol geen gebruik maakt van gentransfectie, het is vrij van virale vectoren en omvat geen stabiel pluripotente toestand, het is zeer veelbelovend voor toepassingen in de translationele geneeskunde.

Oprichting van primaire kweek van de huid biopsieën Skin biopsies werden in kleine stukken gesneden en in gelatine vooraf beklede schalen. Na 6 dagen, fibroblasten gaan groeien uit het weefsel fragmenten en vormden een monolaag van cellen (Figuur 1A). Cellen vertoonden typische langwerpige vorm en, zoals verwacht, vertoonden een uniforme immuun-positiviteit voor fibroblast specifieke marker vimentine (Vim, figuur 1B). <p class="jove_content" f...

Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd die de omzetting van volwassen huidfibroblasten in insulineproducerende cellen mogelijk maakt. Deze techniek is gebaseerd op epigenetische omzetting, gebruikt geen retrovirale vectoren en vereist geen verkrijging van een stabiel pluripotente toestand. Het is daarom zeer veelbelovend voor toepassingen in de translationele geneeskunde.

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Het algemene doel van deze procedure is om fibroblasten om te zetten in insulinesecreterende cellen zonder pluripotentie op te wekken of retrovirale vectoren te gebruiken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de regeneratieve geneeskunde en in het bijzonder bij celtherapie voor diabetes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een overschakeling in het fenotype kunnen bereiken zonder een stabiele pluripotente toestand in de converterende cellen op te wekken en zonder het gebruik van retrovirale vectoren.De procedure wordt gedemonstreerd door Georgia Pennarossa, een post-doc in ons laboratorium. Begin de procedure door 1,5 milliliters steriele 0,1% porcine gelatine aan de 35-millimeter petrischalen toe te voegen en laat dit twee uur bij kamertemperatuur coaten. Was vervolgens de menselijke huidbiopten met PBS aangevuld met 2% antibioticum-antimycotische oplossing.Plaats de biopsieën vervolgens in een petri-schaal van 100 millimeter en snijd ze met steriele scalpels in fragmenten van ongeveer twee kubieke millimeter. Plaats daarna vijf tot zes huidfragmenten in de vooraf gecoate petri-schaal van 35 millimeter. Voeg over elk fragment een druppel fibroblastmedium toe en kweek deze bij 37 °C in 5% CO2.Gooi na zes dagen incubatie de weefselfragmenten voorzichtig weg. De fibroblasten zouden uit de weefselfragmenten moeten groeien en een monolaag van cellen moeten beginnen te vormen. Kweek in deze procedure de fibroblasten bij 37 °C in 5% koolstofdioxide tot een confluentie van 80%.Zaai de cellen vervolgens uit in nieuwe kweekschalen. Kweek ze bij 37 °C in 5% CO2 en houd de passageverhouding tussen 1:2 en 1:4, afhankelijk van de groeisnelheid. Voeg daarna 0,1% porcine gelatine toe aan de celkweekschalen en laat dit twee uur lang coaten.Verwijder de overtollige coatingoplossing 10 tot 30 minuten voordat de fibroblasten worden uitgeplaat. Verwijder vervolgens het fibroblastkweekmedium uit de kweekschalen. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met een antibioticum-antimycotica-oplossing van 1%.Voeg vervolgens een dunne laag Trypsin-EDTA-oplossing toe. Incubeer dit bij 37 °C totdat de cellaag begint los te laten van de bodem van de weefkweekschaal en de cellen dissociëren. Verdun daarna de cellsuspensie met negen delen fibroblastkweekmedium om de werking van het trypsine te neutraliseren.Tel vervolgens de cellen met een telkamer onder de microscoop bij kamertemperatuur. Bereken het volume fibroblast-cultuurmedium dat nodig is om de cellen opnieuw te suspenderen en een celconcentratie van 7,8 × 10⁴ fibroblasten per vierkante centimeter te verkrijgen. Centrifugeer daarna de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 150 g bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in een berekend volume fibroblastcultuurmedium. Zaai de cellen daarna uit op met 0,1% gelatine voorgecoate schaaltjes en kweek ze gedurende 24 uur bij 37 °C in 5% koolstofdioxide. Bereid op dag nul, vlak voor gebruik, de 5-aza-CR-stoomoplossing door 2,44 mg 5-aza-CR op te lossen in 10 mL DMEM high glucose-medium.Steriliseer dit door filtratie. Verdun vervolgens één µL van de 5-aza-CR-stamoplossing in één mL fibroblasten-kweekmedium. Om de celplasticiteit te verhogen, wordt 24 uur na het uitplaten van de cellen het kweekmedium van de gezaaide fibroblasten verwijderd.Voeg één micromolaire 5-aza-CR-stockoplossing toe en kweek gedurende 18 uur bij 37 °C in 5% CO2. Bereid op dag één vers HP-medium voor. Na incubatie met één micromolaire 5-aza-CR wordt het medium verwijderd en worden de cellen drie keer gewassen met HP-medium om er zeker van te zijn dat 5-aza-CR is weggespoeld.Incubeer vervolgens de met 5-aza-CR behandelde fibroblasten gedurende drie uur bij 37 °C in 5% koolstofdioxide in HP-medium. Controleer op morfologische veranderingen om de efficiëntie van de 5-aza-CR behandeling te monitoren. De cellen moeten de typische langgerekte morfologie van fibroblasten verliezen en een kleinere ronde of ovale vorm met vergrote kernen verkrijgen.Bereid op dag één tot en met zes het pancreatische Basal Medium en de Activin A-stamsoplossing. Kweek vervolgens de met 5-aza-CR behandelde fibroblasten gedurende zes dagen bij 37 °C in 5% koolstofdioxide in pancreatisch Basal Medium aangevuld met de Activin A-stamsoplossing en verschangel dagelijks het medium. Bereid op dag zeven en acht een stamsoplossing van retinoïnezuur door 16,6 ml DMSO toe te voegen aan 50 mg retinoïnezuur.Kweek de cellen gedurende twee dagen bij 37 °C in 5% koolstofdioxide in pancreas Basal Medium aangevuld met Activin A-stamoplossing en retinoïnezuur-stamoplossing, en verschoon het medium dagelijks. Kweek de cellen op dag 9 tot en met 36 in pancreas Basal Medium aangevuld met ITS-, B27- en BFGS-stamoplossing; verschoon het medium dagelijks gedurende de eerste 15 dagen en ververs het medium vanaf dag 16 om de dag. Kweek de cellen bij 37 °C in 5% koolstofdioxide.Deze figuur toont de morfologische veranderingen die optreden tijdens de endocriene pancreasdifferentiatie. Na zeven dagen inductie organiseren menselijke cellen zich geleidelijk in clusters. Als reactie op de toevoeging van retinoïnezuur herschikken ze zich in een reticulair patroon en clusteren ze in onderscheidbare aggregaten.Deze formaties vorderen met de tijd, waarbij cellen worden gerekruteerd en vergrote 3D-koloniën aggregeren. Uiteindelijk worden de koloniën sferische structuren die de neiging hebben om los te raken en vrij te drijven in het kweekmedium, wat doet denken aan typische pancreaseilandjes in vitro. Na 36 dagen van pancreatische inductie keerden de globale DNA-methyleringsniveaus van menselijke epigenetisch geconverteerde cellen terug naar de niveaus die werden waargenomen in de onbehandelde fibroblasten.De co-lokalisatie van PDX1 met CPEP wordt waargenomen aan het einde van de conversieperiode, terwijl deze endocriene pancreasmarkers volledig afwezig zijn in onbehandelde fibroblasten. Deze grafiek toont de hoeveelheid insulineafgifte van de epigenetisch geconverteerde cellen als reactie op blootstelling aan 20 millimolar D-glucose en 20 millimolar L-glucose. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 38 dagen worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Na de ontwikkeling heeft dit onderzoek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van regeneratieve geneeskunde om celtherapie voor diabetes bij mensen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe fibroblasten kunnen worden omgezet in insuline-secreterende cellen zonder pluripotentie op te wekken of retrovirale vectoren te gebruiken.

epigenetic-conversion-as-safe-simple-method-to-obtain-insulin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

De differentiatie van stamcellen in eilandjescellen biedt een alternatieve oplossing voor conventionele diabetesbehandeling en ziektemodellering. We beschrijven een gedetailleerd stamcelkweekprotocol dat een commerciële differentiatiekit combineert met een eerder gevalideerde methode om te helpen bij het produceren van insuline-afscheidende, van stamcellen afgeleide eilandjes in een schaaltje.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

Leer hoe je huidfibroblasten omzet in insuline-afscheidende cellen via epigenetische conversie zonder pluripotentie of retrovirale vectoren. Deze veilige methode biedt nieuwe mogelijkheden voor celtherapie bij diabetes.

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Meer video's verkennen