Name: Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryos: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer een geoptimaliseerd immunokleuringprotocol voor erwtenbladluisembryo's dat weefseldoorlaatbaarheid verhoogt en achtergrondkleuring vermindert. Deze methode verbetert de detectie van eiwitexpressie in Acyrthosiphon pisum embryonale weefsels aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) dankbaar voor het verstrekken van het monoklonale 4D9-antilichaam, Technology Commons (TechComm) van de College of Life Science NTU voor confocale microscopie, Hsiao-Ling Lu voor het corrigeren van het manuscript, en Chen-yo Chung voor hulp bij het filmen. CC bedankt met name Charles E. Cook voor het verstrekken van strategische suggesties en voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie (101-2313-B-002-059-MY3 en 104-2313-B-002-022-MY3 voor GWL en CC), en de National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 voor CC; 103R4000 voor GWL).

1. Cultuur van bladluizen NB. Het laboratorium stam van de parthenogenetische levendbarende erwtenbladluis Een pisum werd oorspronkelijk verzameld in het centrum van Taiwan en is grootgebracht op waardplanten (de tuin erwt Pisum sativum of tuinboon Vicia faba) op basis van lange-dag fotoperiode voor meer dan 300 generaties (één generatie: ~ 10 dagen). <ol><li> Kieming van zaden <ol><li> Week de zaden van de waardplanten in leidingwater gedurende 3-5 dagen bij RT. Vullen met vers water een keer per dag. OPMERKING: U zet zaden van waardplanten recht in vochtige grond kan ontkiemen en veroorzaken. </li><li> Kweek 10 kiemende zaden in een kleine pot (9 cm diameter x 7 cm lang) met de bodem in de groeikamer onder lichtperiode 16 uur licht / 8 uur donker bij 20 ° C. </li><li> Ongeveer 10 dagen na de groei begint, overdragen bladluizen op planten waarvan de hoogte is meer dan 8 cm. </li></ol></li><li> Overdracht van bladluizen <ol&gt; <li> Houd elke pot planten binnen een 1 liter glazen beker, overdragen 8 volwassen bladluizen op planten met behulp van een penseel, en dan sluit de beker met een luchtdoorlatende hoes zoals gaas gaas om bladluizen voorkomen ontsnappen. </li><li> Incubeer bladluizen in een groeikamer onder lichtperiode 16 uur licht / 8 uur donker bij 20 ° C. Water per pot planten eenmaal per dag. </li><li> Voor het verkrijgen van de volgende generatie van bladluizen, herhaal stappen 1.1.3-1.2.2 tien dagen na de primaire bladluis overdracht. </li></ol></li></ol> 2. Dissection en Fixatie van Eierstokken <ol><li> Vers bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als fixatie buffer. </li><li> Vul een putje van een plek plaat met PFA (ongeveer 500 pl), plaatst u de plaat onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting, en dompel een volwassen bladluis binnen de PFA voor dissectie. </li><li> Ontleden eierstokken door het houden van het hoofd en buik met een set van een tang, opensnijden van de dorsalecuticula van de buik en het slepen van de eierstokken verwijderd uit de buikholte. </li><li> Bevestig drie paar eierstokken in een 1,5 ml buis die 1 ml PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Decant fixatie buffer met een transfer pipet (ofwel glas of wegwerp) en was daarna de eierstokken met 0,2% Triton-100 in 1x PBS (PBST) 3 keer voor 10 minuten elk. Milde schudden op een mixer / rotator (draaihoek: 60 ° (F60) / rotatiesnelheid: 8 RPM) wordt aanbevolen voor zowel fixatie en wassen. </li></ol> 3. De behandeling met Proteinase K (PK) om de permeabiliteit van embryonale weefsels verhogen OPMERKING: PK behandeling wordt toegepast om embryo&#39;s uit kiem band uitbreiding verder (fase 11 van de ontwikkeling). Voor jongere embryo&#39;s, deze stap is optioneel. <ol><li> In serie verdunde voorraadoplossing van het PK (10 mg / ml) met 1 x PBS om de werking concentratie 1 gg / ml. </li><li> Incubeer eierstokken met 1 ug / ml PK (ongeveer 500 ui) gedurende 10 min met lichte schudden. </li><li> Decant PK Solutiop en spoel daarna de eierstokken met 700 gl Glycine (2 mg / ml) 3 maal gedurende 5 min elk. </li><li> Was eierstokken met 0,2% PBST tweemaal gedurende 10 min elk. </li><li> Bevestig eierstokken opnieuw met fixatie buffer gedurende 15 min bij kamertemperatuur met milde schudden. </li><li> Gooi supernatant en was eierstokken met 0,2% PBST tweemaal gedurende 10 min elk. </li></ol> 4. Methanol Incubatie onderdrukken de endogene peroxidase-activiteit (POD) OPMERKING: Methanol incubatie wordt niet toegepast op embryo&#39;s onderworpen aan Phalloidin vlekken of antilichaam epitopen die methanol gevoelig zijn. <ol><li> In serie dehydrateren eierstokken met verschillende percentage methanol in PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) door incubatie eierstokken bij elke concentratie van methanol gedurende 10 minuten onder zacht roeren. </li><li> Dehydrateren eierstokken met 100% methanol gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met milde schudden. OPMERKING: Bevredigende resultaten van de kleuring kan nog worden verkregen van bladluis weefsels die werden opgeslagen in 100% methanol bij -20 &amp;# 176; C gedurende één maand. </li><li> In serie hydrateren eierstokken met verschillende percentage methanol in PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) door incubatie eierstokken bij elke concentratie van methanol gedurende 10 minuten onder zacht roeren. </li></ol> 5. antilichaamkleuring <ol><li> Verdun de 10x blokkerende oplossing van de DIG-based buffer set (DIG-B) naar 1x. Opmerking: De 1x DIG-B blokkerende oplossing effectiever voor het reduceren van de kleuring achtergrond dan de standaard blokkerende reagens bestaande uit 5% (v / v) normaal geitenserum (NGS) en 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA ) in 0,2% PBST. </li><li> Incubeer de eierstokken met 1 x DIG-B blokkerende oplossing gedurende 2,5-4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden. LET OP: Voor de drie paren van de eierstokken in een 1,5 ml tube, 200 pi is het minimale volume voor het monster blokkeren en antilichaam kleuring. </li><li> Giet supernatant en te vervangen door verse 1x DIG-B blokkerende oplossing die primaire antilichaam op geschikte dilution ratio. Vlekken de eierstokken voor 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden. OPMERKING: Voor de hier beschreven experiment, gebruikt u de volgende optimale verdunningen van primaire antilichamen: (1) ApVas1 antilichaam: 1: 500 voor chromogene kleuring, 01:50 voor immunofluorescentiekleuring; (2) anti-α tubuline antilichaam: 1: 500; (3) 4D9 monoklonaal antilichaam: 01:25. </li><li> Was eierstokken met 0,2% PBST 4 keer gedurende 15 minuten elk. </li><li> Incubeer eierstokken met 1x DIG-B blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met milde schudden. </li><li> Giet supernatant en te vervangen door verse 1x DIG-B blokkerende oplossing die secundair antilichaam op geschikte verdunningsverhouding. Vlekken de eierstokken voor 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden. <ol><li> Gebruik de volgende verdunningsverhoudingen van secundaire antilichamen: (1) Voor immunofluorescentiekleuring: 1: 500 van Alexa Fluor 633 geit anti-konijn IgG of Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG; (2) Voor chromogene kleuring: 1: 200 van gebiotinyleerd geit anti-konijn IgG. Opmerking: Het gebiotinyleerde secundaire antilichaam wordt toegepast voor interactie met het avidine-biotine-complex (ABC) in het substraat-gebaseerde (chromogene) detectie, waardoor de kleuring signalen aanzienlijk versterkt. </li><li> Voor immunofluorescentiekleuring, voeren vlekken in het donker, omdat het secundaire antilichaam is lichtgevoelig. </li></ol></li><li> Afwassen secundair antilichaam met 0,2% PBST 4 keer voor 10 minuten elk. </li></ol> 6. Nucleaire en F-actine kleuring NB: Dit wordt alleen toegepast voor immunofluorescentiekleuring. <ol><li> Vlek eierstokken met 0,2% PBST dat DAPI (2 ng / ul) en Phalloidin-TRITC (100 nM) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was eierstokken met 0,2% PBST 4 keer gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer eierstokken de montage medium O / N bij 4 ° C onder mild schudden. </li></ol> 7. Signaal Ontwikkeling NB: Dit wordt alleen toegepast voor chromogene kleuring. <ol><li> Bereid 100 pireagens avidine-biotine-complex (ABC) teneinde de signalen door toevoeging van 1 pi van Reagens A (avidine) in 98 pl 0,2% PBST, grondig mengen via zacht pipetteren, en het toevoegen van 1 pi van Reagens B (biotine geconjugeerd met mierikswortelperoxidase ), gevolgd door onmiddellijk mengen. Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur met milde schudden. </li><li> Incubeer eierstokken (inclusief gedissocieerd ei kamers) in het mengsel van reagentia A en B gedurende 30 min bij kamertemperatuur met milde schudden. </li><li> Wassen het mengsel van reagentia A en B met 0,2% PBST 4 keer gedurende 10 minuten elk. </li><li> Transfer eierstokken ondergedompeld in PBST tot een goed op de plek plaat met een plastic druppelaar. </li><li> Bereid substraat oplossing van 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB): los een tablet DAB plus een andere die ureum waterstofperoxide in 1 ml van DDH 2 O via krachtig vortexen gedurende 1 min. OPMERKING: DAB, een substraat neerslaan van peroxidase, is een populaire chromogen voor immunokleuring. Het produceert een breigen en onoplosbare neerslag na geoxideerd door het peroxidase. Zwakke signalen kunnen worden verbeterd door toevoeging van nikkelchloride de substraatoplossing (eindconcentratie 0,05-0,08%). </li><li> Verwijder de PBST oplossing achterblijft in de put en vul met 100 ul van de DAB substraatoplossing voor signaalverwerking ontwikkeling. </li><li> Monitor intensiteit van signalen onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting. </li><li> Stop reacties door het verwijderen van de DAB-oplossing, gevolgd door het bijvullen met 1x PBS onmiddellijk. Herhaal het wassen twee keer. </li><li> Transfer eierstokken terug naar de 1,5 ml buis en daarna wassen met 1x PBS of PBST tweemaal voor 15 minuten elk. </li><li> Incubeer eierstokken in een glycerol-based montage medium (70% glycerol) O / N bij 4 ° C onder mild schudden. </li></ol> 8. Montage van de Bladluis Embryo OPMERKING: De dikte van bladluis embryo varieert ontwikkelingsstadia. Montage strategieën worden dus gewijzigd om vroeg te passen (germaria en stadia 0-10), mid (stadia11-18), en late embryo (stadia 19-20), die zijn getoond in Figuur 2B - D. Embryonale enscenering gevolgd Miura et al 12. <ol><li> Transfer eierstokken samen met montage medium aan de cel dienblad met een plastic druppelaar en acht monsters onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting. </li><li> Snijd de kelken in verband met de laterale eileider met insect pinnen en vervolgens over een geïsoleerde ovariole naar een leeg glas goed met een druppelaar. Deel uitmaken van de uiteindelijke volume op 50-100 pi met montage medium. </li><li> Transfer een ovariole op de dia met een dropper en vervolgens ontleden ei kamers met insect pinnen. LET OP: Voor embryo&#39;s ouder dan 6 fase van de ontwikkeling, de scheiding van ei kamers wordt gesuggereerd; voor germaria en de eerste twee ei kamers jonger dan 6 fase scheiding is optioneel. </li><li> Verplaats een ontleed ei kamer een schone dia met behulp van een glazen pipet. </li><li> Zet een dekglaasje (afmetingen: 22 x 22mm) over de ontleed germaria of ei kamers (met embryo&#39;s in stadia van ontwikkeling 1-10) langzaam om luchtbellen te vermijden. <ol><li> Mount ei kamers (met embryo&#39;s in stadium 18/11 ontwikkeling) op een dia met eenzijdige dekglaasje bridge en plaats een dekglaasje (grootte: 18 x 18 mm) boven het monster. </li><li> Mount ei kamers (met embryo&#39;s ouder dan 19 stadium van ontwikkeling) op een dia met dubbelzijdig dekglaasje brug en plaats een ander dekglaasje (afmetingen: 18 x 18 mm) op de bovenkant van het monster. </li></ol></li><li> Vullen de ruimte onder de top dekglaasje met montage media om te voorkomen dat het drogen van het monster. </li><li> Mild roll het embryo door de dekglaasje te schuiven om de juiste oriëntatie voor observatie te verkrijgen. </li><li> Afdichting rond de rand van de dekglaasjes (met inbegrip van de brug dekglaasjes) met nagellak. </li></ol> 9. Imaging Analyse <ol><li> Foto differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van de hele-mount embryo&#39;s met een compound microscoop uitgerust met DIC optiek en een droge objectieflens (10X, 20X, 40X) verbonden met een camera. Installeer de software voor beeldoverdracht tussen de camera en de computer met behulp van instructies van de fabrikant. </li><li> Verwerven projecties van de fluorescent gelabelde embryo&#39;s met een laser-scanning confocale microscoop 14. De instructies van de fabrikant voor het fotograferen, z-stapelen en 3D uitsteken beeldverwerkingssoftware. <ol><li> Draai de dia ondersteboven, vinden de gemonteerde monster met 10X objectieve en omcirkelen het monster met een fijn geoliede-gebaseerde pen. NB: Dit maakt het identificeren van het monster gemakkelijker bij het zoeken naar deze doelstellingen door middel van een confocale microscoop. </li><li> Een druppeltje olie op de bovenkant van het dekglaasje gebied waarvan tegenoverliggende zijde gelabeld zoals beschreven in 9.2.1. </li></ol></li><li> Vind de focal plane op 40X olie-immersie objectief dan overstappen op een 63x olie-immersie objectief. Handmatig verplaatsen van de fijne scherpstelling controle op en doenwn om de beste focal plane vangen. LET OP: Voor het observeren van structurele details van germaria en vroege embryo&#39;s, raden wij u 40X doelstellingen of mensen met een hogere vergroting. </li><li> Scan de embryo in verschillende excitatie kanalen en het imago van een z-stack te verkrijgen. OPMERKING: Bij erwtenbladluis weefsels verminderen dikte van elke optische gedeelte neer op 1,5 urn of minder. </li></ol>

<ol><li>Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlackman%2C+RL+%22Aphids%3A+their+biology%2C+natural+enemies%22">Aphids: their biology, natural enemies</a>. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).</li>
<li>Davis, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclical+parthenogenesis+and+viviparity+in+aphids+as+evolutionary+novelties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties.</a> J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).</li>
<li>The International Aphid Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biol. 8 (2), e1000313(2010).</li>
<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apvasa+marks+germ-cell+migration+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+%28Hemiptera%3A+Aphidoidea%29%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)).</a> Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+identification+of+gene+transcripts+in+aphids%3A+Protocols+and+evaluation+of+probe+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem%22%5BJournal%5D)">Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility.</a> Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).</li>
<li>Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+protocols+for+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%3A+a+comprehensive+survey+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis.</a> Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).</li>
<li>Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+knockdown+of+a+salivary+transcript+leading+to+lethality+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J. Insect Sci. 6, 38(2006).</li>
<li>Jaubert-Possamai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+by+RNAi+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> BMC Biotechnol. 7, 63(2007).</li>
<li>Sapountzis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+the+RNA+interference+response+against+cathepsin-L+gene+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%3A+Molting+or+gut+phenotypes+specifically+induced+by+injection+or+feeding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).</li>
<li>Braendle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+and+evolution+of+bacteriocytes+in+the+aphid-Buchnera+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis.</a> PLoS Biol. 1 (1), e21(2003).</li>
<li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+parthenogenetic+and+sexual+embryogenesis+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+%28Hemiptera%3A+Aphidoidea%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea).</a> J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).</li>
<li>Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-plasm+specification+and+germline+development+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%3A+Vasa+and+Nanos+as+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers.</a> Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).</li>
<li>Koshy, A. A., Cabral, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+and+analysis+of+neurons+infected+in+vivo+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii.</a> J. Vis. Exp. (94), e52237(2014).</li>
<li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%3A+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological%2C+developmental+and+evolutionary+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Method.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+expression+aspects+of+the+Drosophila+segmentation+gene+hunchback+in+the+short+germ+band+embryo+of+the+flour+beetle+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium.</a> Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23 (4), 345-358 (2001).</li>
<li>Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+localization+of+ApVas1+positions+the+preformed+germ+plasm+in+the+sexual+oviparous+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> Evodevo. 5, 18(2014).</li>
<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+peroxidase+by+methanol+and+by+methanol-nitroferricyanide+for+use+in+immunoperoxidase+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures.</a> J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We identificeerden optimale omstandigheden van cruciaal belang voor een succesvolle immunokleuring in de erwtenbladluis A. Pisum, een opkomende modelorganisme voor genomische en ontwikkelingsstudies 3,15. Geoptimaliseerde omstandigheden voor toenemende weefsel permeabiliteit en verminderen achtergrondkleuring verhoogde intensiteit en specificiteit van signalen. Zij verschillen van standaardprotocollen voor immunokleuring in andere dierlijke modellen in de stappen voor het creëren van poriën ...

Bladluizen zijn Hemipteran insecten met kleine (1-10 mm) zachte lichamen. Ze voeden zich met planten door zuigen phloem sap met piercing monddelen. Bovendien, ze vertrouwen op een obligaat endosymbiotic bacterie, Buchnera aphidicola, essentiële aminozuren die een tekort aan het floëem sap dieet te synthetiseren. Bladluizen hebben een complexe leven geschiedenis die parthenogenetische levendbarende voortplanting in het voorjaar en de zomer lange dag fotoperiodiciteit en seksuele ovipaar voortplanting veroorzaakt door korte-dag fotoperiodiciteit waarin zij lag een beperkt aantal overwinterende eieren 1,2 omvat. In het voorjaar van deze eieren uitkomen van de eerste generatie van de all-female bladluizen (fundatrices) te produceren, na vele rondes van parthenogenetische voortplanting tot de herfst. De cyclische parthenogenese in bladluizen, waar de aseksuele en seksuele fasen wisselen elkaar af in de jaarlijkse levenscyclus, is beschouwd als een evolutionaire nieuwigheid 1,2. In de parthenogenetische levendbarende bladluizen, Embryogenese plaatsvindt binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles). Daarentegen seksuele oviparous embryo&#39;s ontwikkelen in de bevruchte eieren. Afgezien van reproductieve plasticiteit, kunnen bladluizen transgenerationele vleugel polyfenisme weer te geven: in reactie op overbevolking signalen en roofdier bedreigingen, kan het ongevleugelde aseksuele vrouwtjes levendbarende produceren gevleugelde nakomelingen voor migratie over lange afstand. Publicatie van de genoomsequentie van de erwt Acyrthosiphon pisum -het eerste genoom sequentie voor een basale hemimetabolous insect-maakt verdere verkenning van reproductieve plasticiteit, vleugel polyfenisme, en andere functies, waaronder insect-plant interacties, virale vectoring en symbiose in bladluizen op een moleculaire basis 3. Naast het genoom gesequenced, zijn hulpmiddelen voor het karakteriseren genexpressie en functie vereist voor het bevorderen van de erwtenbladluis als volwassen modelorganisme 4. We hebben robuuste protocollen van de hele-mount beschreven <em&gt; in situ hybridisatie voor het detecteren van expressie van mRNA in embryo bladluis 5-7. RNA interferentie (RNAi) via dubbelstrengs RNA injectie en voeding is gebruikt voor silencing in bladluis nimfen en volwassenen, maar stabiele omstandigheden voor gentherapie knockdown in de embryo&#39;s nog niet gerapporteerd 8-10. Immunokleuring, een antilichaam-gebaseerde aanpak die eiwitexpressie kan detecteren in monsters voor en na RNAi knock-down, is uitgevoerd op erwtenbladluis embryo 11-13. Echter, verhoging van weefsel permeabiliteit en de eliminatie van de achtergrond vlekken zijn nog onvoldoende gebruik van standaard protocollen voor immunokleuring in de aseksuele levendbarende embryo&#39;s van erwtenbladluis. Zo vonden we dat penetratie van antilichaam aan het weefsel afgenomen gastrulating embryo (stadia 8-10) en embryo morfologisch identificeerbare ledematen (fasen 13-14) was nauwelijks permeabel voor antilichaam. Bovendien werd achtergrondkleuring gevisualiseerd in de aseksuele viviparoons erwtenbladluis embryo&#39;s gekleurd met behulp van antilichaam tegen het marker kiemlijn Vasa evenals die tegen Engrailed / Invected eiwit tot expressie gebracht in embryonale segmenten 12,13. Eigenlijk achtergrondkleuring nog duidelijk zichtbaar in embryo&#39;s gekleurd met het secundaire antilichaam alleen. Om de permeabiliteit verhogen zonder beschadiging van de integriteit van bladluis weefsels we zorgvuldig getitreerde de concentratie van proteinase K en bepaalde optimale omstandigheden voor weefsel digestie op bladluis embryo. Om niet-specifieke kleuring in de erwtenbladluis te vermijden, hebben we gezocht naar verbindingen die effectief embryo&#39;s kunnen blokkeren en onderdrukken de activiteit van endogene peroxidase (POD), een enzym gebruikt voor het versterken van signalen tijdens immunokleuring. Een blokkerende reagens geleverd door een digoxigenine (DIG) -gebaseerde bufferset plaats de traditioneel gebruikte normaal geitenserum (NGS) / bovine serum albumine (BSA), aanzienlijk verminderd achtergrondkleuring. Bovendien werd gevonden dat methanol inhibeet de endogene activiteit POD effectiever dan waterstofperoxide (H 2 O 2). Details betreffende deze bladluis-specifieke voorwaarden voor immunokleuring op embryo&#39;s worden beschreven in de volgende paragrafen.

<table><tbody><tr><td>30% hydrogen perxidase (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Voor het bleken van endogene peroxidase van embryo's.</td></tr><tr><td>4&rsquo;6-diamidino-2-fenyl-indooldihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Voor het labelen van het dubbelstrengs DNA. TOXIC. Draag handschoenen, doseer in kleine porties en bevries om blootstelling te minimaliseren</td></tr><tr><td>4D9 anti-engrailed/invected muis monoklonaal antilichaam</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>AB_528224</td><td>Voor het labelen van de zich ontwikkelende segmenten van het embryo.</td></tr><tr><td>ApVas1 konijn polyklonaal antilichaam</td><td>Ons laboratorium</td><td>N/A</td><td>Voor het labelen van de afide geslachtsspecifieke Vas1-eiwit in embryo's. Dit antilichaam is gemaakt door ons laboratorium. </td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Voor het scheiden van elke eikamers van een ovariolie. Grootte 000, ZWART GEËMAILLEERD. </td></tr><tr><td>Rund serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Voor het blokkeren van de niet-specifieke binding van antilichamen.</td></tr><tr><td>Camera aangesloten op compound microscoop</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>Voor het fotograferen van afide embryo's.</td></tr><tr><td>Colorimetrische 8-cel tray</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Voor het ontwikkelen van het kleuringssignaal van afide embryo's. Diameter 95 x 57 mm, celdiepte 2 mm.</td></tr><tr><td>Compound microscoop met DIC-optiek</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>Voor het fotograferen van afide embryo gemonteerd op de dia's.</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>Voor het blokkeren van de niet-specifieke binding van antilichamen. We verdundde de 10x blokkeringsoplossing in 1x als blokkeringsreagens.</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>Voor de dissectie van eierstokken van afidae. Fabrikant onderdeelnummer 5: 5 SA. </td></tr><tr><td>Glazen dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voor het overbrengen van eierstokken van afidae van de splotplaat naar buisjes. 150 mm totale lengte en 5 3/4" van tiplengte.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Voor het verduidelijken van afide embryo's en montage.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Voor het blokkeren van de enzymactiviteit van proteinase K (PK).</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Voor de detectie van primaire antilichamen uit muis.</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Voor de detectie van primaire antilichamen uit konijn.</td></tr><tr><td>Intelli mixer</td><td>ELMI laboratory equipment</td><td>RM-2M</td><td>Voor het verbeteren van de volledige reactie van reagentia met eierstokken.</td></tr><tr><td>Laser-scanning confocale microscopie</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Voor het fotograferen van afide embryo gemonteerd op de dia's met fluorescente tag.</td></tr><tr><td>Methanol&nbsp;</td><td>Burdick and Jackson</td><td>AH2304</td><td>Voor het bleken van endogene peroxidase van embryo's.</td></tr><tr><td>Microscoop slides&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>Voor het monteren van embryo's. SUPERFROST gemalen randen, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Microscoop dekglazen</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>Voor het monteren van embryo's op de dia's. Grootte 18 x 18 mm. Dikte No. 1 (0.13 tot 0.16 mm)</td></tr><tr><td>Microscoop dekglazen</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Voor het monteren van embryo's op de dia's. Grootte 22 x 22 mm. Dikte No. 1 (0.13 tot 0.16 mm)</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-alphaTubulin antilichaam (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Voor het labelen van de distributie van alpha-tubuline van cellen.</td></tr><tr><td>Nagellak</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voor het verzegelen van de dekglazen op de dia's.</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Voor het blokkeren van de niet-specifieke binding van antilichamen.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Voor de fixatie van afide eierstokken.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>Voor het labelen van de distributie van F-actine op embryo's.</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Als isotone oplossing voor afide eierstokken.</td></tr><tr><td>Kunststof dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voor het overbrengen van eierstokken van afidae van buisjes naar cel tray. Grootte 3 ml. </td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>Voor het creëren van poriën (punching) op het celmembraan en het vergemakkelijken van de toegang van antilichamen. </td></tr><tr><td>Pyrex spotplaat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voor de dissectie en kleurreacties van afide eierstokken onder microscopie. Elke holte met een diameter van 22 mm en&nbsp; diepte 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3&rsquo;-diaminobenzidine (DAB) tabletten&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Voor het ontwikkelen van substraatsignalen. Ook wel DAB peroxidase substraat tablet set genoemd.</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Voor de dissectie en observatie van afide eierstokken.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Voor het creëren van poriën (punching) op het celmembraan. </td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Vector laboratories</td><td>PK-6101</td><td>Voor het verbeteren van het signaal. Inclusief biotinyleren geit anti-konijn IgG secundair antilichaam, A en B reagentia.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD montagemedium</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>Voor het verd

identificatie van de kritische voorwaarden voor immunokleuring in de erwtenbladluis embryo&#39;s: toenemende tissue permeabiliteit en afnemende achtergrond kleuring

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

De erwt Acyrthosiphon pisum, met een gefaseerde genoom en overvloedige fenotypische plasticiteit, is uitgegroeid tot een opkomende model voor genomische en ontwikkelingsstudies. Net als andere bladluizen, A. Pisum verspreiden zich snel via parthenogenetische levendbarende voortplanting, waar de embryo&#39;s ontwikkelen binnen ei kamers in een lopende band mode in de ovariole. Eerder hebben we een robuust platform van whole-mount in situ hybridisatie waardoor detectie van mRNA expressie in de bladluis embryo&#39;s vastgesteld. Voor het analyseren van de expressie van eiwitten, hoewel, vastgestelde protocollen voor immunokleuring de ovarioles van ongeslachtelijke levendbarende bladluizen leverde geen bevredigende resultaten te produceren. Hier melden wij voorwaarden geoptimaliseerd voor toenemende weefsel permeabiliteit en dalende achtergrond kleuring, die beide waren problemen bij het toepassen van gevestigde benaderingen. Optimalisaties omvatten: (1) incubatie van proteïnase K (1 ug / ml, 10 min) en bleek essentieel fof antilichaam penetratie in de midden- en late fase bladluis embryo&#39;s; (2) vervanging van normale geit serum / runderserumalbumine met een digoxigenine (DIG) toegevoerd blokkerend reagens gebaseerde buffer set en (3) de toepassing van methanol eerder waterstofperoxide (H 2 O 2) voor het bleken endogeen peroxidase; die aanzienlijk verminderde de achtergrondkleuring in de bladluis weefsels. Deze kritische omstandigheden geoptimaliseerd voor immunokleuring zal doeltreffende detectie van genproducten mogelijk maken in de embryo&#39;s van A. Pisum en andere bladluizen.

In deze studie hebben we uitgevoerd whole-mount immunokleuring op embryo&#39;s van aseksueel erwt bladluizen (Figuur 1A). Deze vrouwen produceren nakomelingen parthenogenetisch en levendbarende. Deze vrouwelijke embryo&#39;s ontwikkelen binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles) (Figuur 1B en figuur 2A). Voordat microscopie, de ontleed ovarioles zijn de vlekken doelstellingen; echter gescheiden ei kamers vereis...

Een protocol van gehele immuunkleuring op bladluisembryo's wordt gepresenteerd, waarin kritieke omstandigheden voor het verminderen van achtergrondkleuring en het verhogen van weefseldoorlaatbaarheid worden behandeld. Deze omstandigheden zijn specifiek ontwikkeld voor effectieve detectie van eiwitexpressie in de embryonale weefsels van bladluizen.

Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo&#39;s: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Het algemene doel van dit immunostaining-protocol is het detecteren van eiwitexpressie in bladluisembryo's. Er zijn kritieke condities geïdentificeerd die de weefselpermeabiliteit verhogen en de achtergrondkleuring verminderen, beide langdurige problemen bij het kleuren van embryonale weefsels van bladluizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het specifieke condities biedt voor een effectieve penetratie van antilichamen en een vermindering van de achtergrondkleuring, zaken die gewoonlijk niet worden beschreven in een standaard immunostaining-protocol.We kregen voor het eerst het idee voor deze meting toen we bestudeerden hoe kiemcellen worden gespecificeerd in een erwtluis, een insectmodel voor genomica en milieuonderzoek. De laboratoriumstam van de erwtluis, A. pisum, werd oorspronkelijk verzameld in centraal Taiwan en wordt al meer dan 300 generaties op waardplanten gekweekt.Om te kiemen, week de zaden van de waardplanten drie tot vijf dagen in kraanwater bij kamertemperatuur. Ververs het water dagelijks. Kweek tien kiemende zaden in een kleine pot met grond in de groeikamer onder een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker, bij 20 °C.Ongeveer 10 dagen nadat de groei is begonnen, is de hoogte van de planten gewoonlijk meer dan acht centimeter. Plaats elke pot met planten in een glazen bekerglas van één liter en breng volwassen bladluizen op de planten aan met een penseel. Sluit het bekerglas vervolgens af met een luchtdoorlatende afdekking, zoals gaas, om te voorkomen dat de bladluizen ontsnappen.Incubeer de bladluizen in een groeikamer onder een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker, bij 20 °C, waarbij elke pot met planten één keer per dag wordt bewaterd. Vul één putje van een spotplaat met ongeveer 500 µL 4% paraformaldehyde. Plaats de plaat onder een stereomicroscoop bij lage vergroting en dompel een volwassen bladluis onder in het paraformaldehyde voor dissectie.Dissecteer de eierstokken door de kop en het abdomen met één set pincetten vast te houden, de dorsale cuticula van het abdomen open te snijden en de eierstokken uit de abdominale holte te trekken. Fixeer vervolgens drie paren eierstokken in een buisje van 1,5 milliliter met één milliliter paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, onder matig schudden op een mixer. Verwijder de fixatiebuffer met een glazen pipet en was de eierstokken vervolgens drie keer gedurende 10 minuten met PBST, onder matig schudden.Om de eierstokken te behandelen, worden deze eerst gedurende 10 minuten geïncubeerd met Proteinase K onder mild schudden om de permeabiliteit van de embryonale weefsels te verhogen. Gooi na de incubatie de Proteinase K-oplossing weg en was de eierstokken vervolgens drie keer gedurende vijf minuten met 700 microliters glycine. Was de eierstokken daarna twee keer gedurende 10 minuten met PBST.Fixeer de eierstokken opnieuw met fixatiebuffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder matig schudden. Om de endogene peroxidase-activiteit te onderdrukken, worden de eierstokken opeenvolgend gedehydrateerd met verschillende percentages methanol in 0,2 procent PBST met volumeverhoudingen van één op drie, één op één en drie op één, waarna de eierstokken verder worden geïncubeerd met 100 procent methanol gedurende één uur bij kamertemperatuur onder matig schudden. Rehydrateer de eierstokken vervolgens opeenvolgend, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voor drie paren eierstokken in een 1,5 milliliter buis is 200 microliters het minimale volume voor het blokkeren van de monsters en de antilichaamkleuring. Incubeer de eierstokken met de 1x DIG-B blokkeringsoplossing gedurende vier uur bij kamertemperatuur, of overnacht bij vier graden Celsius, onder matig schudden. Verwijder na de incubatie het supernatant en vervang dit door verse 1x DIG-B blokkeringsoplossing, waarin het primaire antilichaam in de juiste verdunningsverhouding is opgenomen.Kleur de eierstokken vier uur lang bij kamertemperatuur, of overnacht bij vier graden Celsius met lichte schudding. Nadat de eierstokken zijn gewassen zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het supernatant weggegooid en vervangen door verse 1x DIG-B blokkeringsoplossing met de secundaire antilichaam in de juiste verdunningsverhouding, waarna de eierstokken opnieuw worden gekleurd. Voer bij immunofluorescente kleuring de kleuring in het donker uit, aangezien het secundaire antilichaam lichtgevoelig is.De dikte van bladluisembryo's varieert per ontwikkelingsstadium. De montagestrategieën worden daarom aangepast aan vroege, midden en late embryo's. Breng de eierstokken, samen met het montagemedium, met een plastic pipet over naar de celtray en observeer de monsters onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting.Snijd de callusvorming rondom de laterale eileider door met insectenpinnen en overbreng vervolgens een geïsoleerde ovariole met een pipet naar een lege glazen put. Vul het uiteindelijke volume aan tot tussen 50 en 100 µL met montage medium. Breng daarna een ovariole met een glazen pipet over op hetpreparaatglas.Disseceer de eikamers met insectenspelden. Voor embryo's ouder dan ontwikkelingsstadium zes wordt het scheiden van de eikamers aangeraden. Voor germaria en de eerste twee eikamers is scheiding optioneel.Verplaats een gedissecteerde eikammer naar een schoon objectglas met behulp van een glazen pipet. Voor embryo's in de ontwikkelingsstadia 1 tot 10, plaats dan voorzichtig een dekglas over de gedissecteerde germaria of eikammers om luchtbellen te voorkomen. Alternatief, voor embryo's in de ontwikkelingsstadia 11 tot 18, monteer de eikammers op een objectglas met een eenzijdige dekglasbrug en plaats vervolgens een ander dekglas bovenop het monster.Voor embryo's ouder dan ontwikkelingsstadium 19 worden de eikamers op een objectglas gemonteerd met een dubbelzijdig dekglasbruggetje, waarna een tweede dekglas bovenop het monster wordt geplaatst. Vul vervolgens de ruimte onder het bovenste dekglas met montage medium om uitdroging van het monster te voorkomen. Rol het bovenste dekglas voorzichtig om de juiste oriëntatie voor observatie te verkrijgen.Smeer ten slotte, vóór het uitvoeren van de beeldanalyse, een rand van nagellak rond de randen van de dekglasjes, inclusief de brug-dekglasjes, zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier wordt een paar eierstokken getoond die zijn gedisseceerd uit een volwassen vrouwtje. Een ovariole bestaat uit één germarium, één tot twee O-sites en vijf tot zeven embryo's, die allemaal in een assemblagelijn-configuratie in eikamers zijn ondergebracht.Na fixatie met paraformaldehyde wordt digestie van de eierstokken in een Proteinase K-oplossing met een concentratie van 1 µg/mL gedurende 10 minuten sterk aanbevolen. De kleuringsresultaten laten zien dat de signaalintensiteit aanzienlijk is toegenomen in de met Proteinase K gedigesteerde embryo's. Incubatie van embryo's in de blokkeeroplossing van een DIG-gebaseerde bufferset vermindert de achtergrondkleuring sterker dan bij embryo's in normaal geiten serum en runderserumalbumine.De endogene activiteit van peroxidase kan ook leiden tot een hoge achtergrondkleuring. Deze studies tonen aan dat het onderdompelen van bladluisembryo's in methanol de peroxidaseactiviteit veel efficiënter kan onderdrukken dan het behandelen van embryo's met waterstofperoxide. De kritieke omstandigheden die in deze studie zijn vastgesteld, kunnen worden toegepast voor signaaldetectie in zowel kiemcellen als somatische cellen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid mits correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een succesvolle immunokleuring op bladluisembryo's uitvoert, inclusief het verhogen van de signaalintensiteit en het verminderen van de achtergrondkleuring. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elk embryo voorzichtig te manipuleren om de embryos in een goede vorm te krijgen.Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde en DAPI extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na deze procedure kunnen andere maatregelen, zoals in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of boodschapper-RNA gelokaliseerd is met zijn eiwitproduct in de embryonale cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de milieubiologie van insecten, zoals hoe kiemcellen worden gespecificeerd en hoe eicellen worden bepaald in verschillende reproductieve fasen bij bladluizen.

identification-critical-conditions-for-immunostaining-pea-aphid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont ganse berg immunohistochemie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressiepatroon van een antigeen kan worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Jane Dodd en Tom Jessell.

Methode voor Whole Mount antilichaam kleuring in Chick

Het Xenopus laevis-embryo blijft uiterst nuttig in de studie van vroege ontwikkeling vanwege zijn grote omvang en gemakkelijke manipulatie.   Er wordt een vereenvoudigd protocol voor volledige montage in situ hybridisatie gegeven dat kan worden gebruikt bij de identificatie van specifieke organen in dit modelsysteem.

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Introductie van kleine moleculen de ontwikkeling Drosophila embryo grote mogelijkheden voor het karakteriseren van biologische activiteit van nieuwe verbindingen, geneesmiddelen en toxinen en het tasten fundamentele ontwikkelingspaden. Werkwijzen hierin beschreven schetsen stappen natuurlijke barrières deze benadering overwonnen, het uitbreiden van de bruikbaarheid van de Drosophila embryo model.

Een methode van permeabilisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s voor Testen van Small Molecule Activiteit

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

De interrenal klier in de zebravis is de teleostean tegenhanger van de zoogdieren bijnier. Dit protocol wordt beschreven hoe de 3-β-hydroxysteroïdedehydrogenase (Δ 5-4 isomerase, 3β-Hsd) verricht enzymatische activiteit test, die gedifferentieerde steroïdogene cellen in zebravisembryo detecteert.

Het visualiseren van de Interrenal steroïdogene Tissue en haar Vasculaire Microenvironment in zebravis

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Visualisatie van de expressie van genen in embryonale Astyanax cavefish kunnen dit protocol. Deze aanpak is ontwikkeld met als doel het maximaliseren van gen expressie signaal, terwijl het minimaliseren van aspecifieke achtergrondkleuring.

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer een geoptimaliseerd immunokleuringprotocol voor erwtenbladluisembryo's dat weefseldoorlaatbaarheid verhoogt en achtergrondkleuring vermindert. Deze methode verbetert de detectie van eiwitexpressie in Acyrthosiphon pisum embryonale weefsels aanzienlijk.

Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryos: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring (Video) | JoVE Journal

Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo's: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

Meer video's verkennen