Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo's: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

Het algemene doel van dit immunostaining-protocol is het detecteren van eiwitexpressie in bladluisembryo's. Er zijn kritieke condities geïdentificeerd die de weefselpermeabiliteit verhogen en de achtergrondkleuring verminderen, beide langdurige problemen bij het kleuren van embryonale weefsels van bladluizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het specifieke condities biedt voor een effectieve penetratie van antilichamen en een vermindering van de achtergrondkleuring, zaken die gewoonlijk niet worden beschreven in een standaard immunostaining-protocol.

We kregen voor het eerst het idee voor deze meting toen we bestudeerden hoe kiemcellen worden gespecificeerd in een erwtluis, een insectmodel voor genomica en milieuonderzoek. De laboratoriumstam van de erwtluis, A. pisum, werd oorspronkelijk verzameld in centraal Taiwan en wordt al meer dan 300 generaties op waardplanten gekweekt.

Om te kiemen, week de zaden van de waardplanten drie tot vijf dagen in kraanwater bij kamertemperatuur. Ververs het water dagelijks. Kweek tien kiemende zaden in een kleine pot met grond in de groeikamer onder een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker, bij 20 °C.

Ongeveer 10 dagen nadat de groei is begonnen, is de hoogte van de planten gewoonlijk meer dan acht centimeter. Plaats elke pot met planten in een glazen bekerglas van één liter en breng volwassen bladluizen op de planten aan met een penseel. Sluit het bekerglas vervolgens af met een luchtdoorlatende afdekking, zoals gaas, om te voorkomen dat de bladluizen ontsnappen.

Incubeer de bladluizen in een groeikamer onder een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker, bij 20 °C, waarbij elke pot met planten één keer per dag wordt bewaterd. Vul één putje van een spotplaat met ongeveer 500 µL 4% paraformaldehyde. Plaats de plaat onder een stereomicroscoop bij lage vergroting en dompel een volwassen bladluis onder in het paraformaldehyde voor dissectie.

Dissecteer de eierstokken door de kop en het abdomen met één set pincetten vast te houden, de dorsale cuticula van het abdomen open te snijden en de eierstokken uit de abdominale holte te trekken. Fixeer vervolgens drie paren eierstokken in een buisje van 1,5 milliliter met één milliliter paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, onder matig schudden op een mixer. Verwijder de fixatiebuffer met een glazen pipet en was de eierstokken vervolgens drie keer gedurende 10 minuten met PBST, onder matig schudden.

Om de eierstokken te behandelen, worden deze eerst gedurende 10 minuten geïncubeerd met Proteinase K onder mild schudden om de permeabiliteit van de embryonale weefsels te verhogen. Gooi na de incubatie de Proteinase K-oplossing weg en was de eierstokken vervolgens drie keer gedurende vijf minuten met 700 microliters glycine. Was de eierstokken daarna twee keer gedurende 10 minuten met PBST.

Fixeer de eierstokken opnieuw met fixatiebuffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder matig schudden. Om de endogene peroxidase-activiteit te onderdrukken, worden de eierstokken opeenvolgend gedehydrateerd met verschillende percentages methanol in 0,2 procent PBST met volumeverhoudingen van één op drie, één op één en drie op één, waarna de eierstokken verder worden geïncubeerd met 100 procent methanol gedurende één uur bij kamertemperatuur onder matig schudden. Rehydrateer de eierstokken vervolgens opeenvolgend, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voor drie paren eierstokken in een 1,5 milliliter buis is 200 microliters het minimale volume voor het blokkeren van de monsters en de antilichaamkleuring. Incubeer de eierstokken met de 1x DIG-B blokkeringsoplossing gedurende vier uur bij kamertemperatuur, of overnacht bij vier graden Celsius, onder matig schudden. Verwijder na de incubatie het supernatant en vervang dit door verse 1x DIG-B blokkeringsoplossing, waarin het primaire antilichaam in de juiste verdunningsverhouding is opgenomen.

Kleur de eierstokken vier uur lang bij kamertemperatuur, of overnacht bij vier graden Celsius met lichte schudding. Nadat de eierstokken zijn gewassen zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het supernatant weggegooid en vervangen door verse 1x DIG-B blokkeringsoplossing met de secundaire antilichaam in de juiste verdunningsverhouding, waarna de eierstokken opnieuw worden gekleurd. Voer bij immunofluorescente kleuring de kleuring in het donker uit, aangezien het secundaire antilichaam lichtgevoelig is.

De dikte van bladluisembryo's varieert per ontwikkelingsstadium. De montagestrategieën worden daarom aangepast aan vroege, midden en late embryo's. Breng de eierstokken, samen met het montagemedium, met een plastic pipet over naar de celtray en observeer de monsters onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting.

Snijd de callusvorming rondom de laterale eileider door met insectenpinnen en overbreng vervolgens een geïsoleerde ovariole met een pipet naar een lege glazen put. Vul het uiteindelijke volume aan tot tussen 50 en 100 µL met montage medium. Breng daarna een ovariole met een glazen pipet over op hetpreparaatglas.

Disseceer de eikamers met insectenspelden. Voor embryo's ouder dan ontwikkelingsstadium zes wordt het scheiden van de eikamers aangeraden. Voor germaria en de eerste twee eikamers is scheiding optioneel.

Verplaats een gedissecteerde eikammer naar een schoon objectglas met behulp van een glazen pipet. Voor embryo's in de ontwikkelingsstadia 1 tot 10, plaats dan voorzichtig een dekglas over de gedissecteerde germaria of eikammers om luchtbellen te voorkomen. Alternatief, voor embryo's in de ontwikkelingsstadia 11 tot 18, monteer de eikammers op een objectglas met een eenzijdige dekglasbrug en plaats vervolgens een ander dekglas bovenop het monster.

Voor embryo's ouder dan ontwikkelingsstadium 19 worden de eikamers op een objectglas gemonteerd met een dubbelzijdig dekglasbruggetje, waarna een tweede dekglas bovenop het monster wordt geplaatst. Vul vervolgens de ruimte onder het bovenste dekglas met montage medium om uitdroging van het monster te voorkomen. Rol het bovenste dekglas voorzichtig om de juiste oriëntatie voor observatie te verkrijgen.

Smeer ten slotte, vóór het uitvoeren van de beeldanalyse, een rand van nagellak rond de randen van de dekglasjes, inclusief de brug-dekglasjes, zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier wordt een paar eierstokken getoond die zijn gedisseceerd uit een volwassen vrouwtje. Een ovariole bestaat uit één germarium, één tot twee O-sites en vijf tot zeven embryo's, die allemaal in een assemblagelijn-configuratie in eikamers zijn ondergebracht.

Na fixatie met paraformaldehyde wordt digestie van de eierstokken in een Proteinase K-oplossing met een concentratie van 1 µg/mL gedurende 10 minuten sterk aanbevolen. De kleuringsresultaten laten zien dat de signaalintensiteit aanzienlijk is toegenomen in de met Proteinase K gedigesteerde embryo's. Incubatie van embryo's in de blokkeeroplossing van een DIG-gebaseerde bufferset vermindert de achtergrondkleuring sterker dan bij embryo's in normaal geiten serum en runderserumalbumine.

De endogene activiteit van peroxidase kan ook leiden tot een hoge achtergrondkleuring. Deze studies tonen aan dat het onderdompelen van bladluisembryo's in methanol de peroxidaseactiviteit veel efficiënter kan onderdrukken dan het behandelen van embryo's met waterstofperoxide. De kritieke omstandigheden die in deze studie zijn vastgesteld, kunnen worden toegepast voor signaaldetectie in zowel kiemcellen als somatische cellen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid mits correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een succesvolle immunokleuring op bladluisembryo's uitvoert, inclusief het verhogen van de signaalintensiteit en het verminderen van de achtergrondkleuring. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elk embryo voorzichtig te manipuleren om de embryos in een goede vorm te krijgen.

Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde en DAPI extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na deze procedure kunnen andere maatregelen, zoals in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of boodschapper-RNA gelokaliseerd is met zijn eiwitproduct in de embryonale cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de milieubiologie van insecten, zoals hoe kiemcellen worden gespecificeerd en hoe eicellen worden bepaald in verschillende reproductieve fasen bij bladluizen.