Name: Oprichting van Cancer Stem Cell Cultures van Human Conventionele Osteosarcoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer hoe je kankerstamcellen isoleert uit menselijk osteosarcoom met behulp van de sarcosfeer-assay. Deze methode toont visueel de isolatiestappen voor onderzoek naar gerichte therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door ITT (Istituto Toscano Tumori) Subsidievoorstel 2010.

<ol><li>Reddick, R. L., Michelitch, H. J., Levine, A. M., Triche, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+sarcoma%3A+a+study+of+the+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteogenic sarcoma: a study of the ultrastructure.</a> Cancer. 45 (1), 64-71 (1980).</li>
<li>Gatta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+cancer+survival+trends+in+Europe%3A+a+EUROCARE+Working+Group+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood cancer survival trends in Europe: a EUROCARE Working Group study.</a> J. Clin. Oncol. 23 (16), 3742-3751 (2005).</li>
<li>Olstad, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+in+human+osteosarcoma+demonstrated+by+enriched+mRNAs+isolated+by+directional+tag+PCR+subtraction+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity in human osteosarcoma demonstrated by enriched mRNAs isolated by directional tag PCR subtraction cloning.</a> Anticancer. Res. 23 (3B), 2201-2216 (2003).</li>
<li>Geller, D. S., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+review+of+diagnosis%2C+management%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Adv+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a review of diagnosis, management, and treatment strategies.</a> Clin Adv Hematol Oncol. 8 (10), 705-718 (2010).</li>
<li>Tang, N., Song, W. X., Luo, J., Haydon, R. C., He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+development+and+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma development and stem cell differentiation.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 466 (9), 2114-2130 (2008).</li>
<li>Kempf-Bielack, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+relapse+after+combined+modality+therapy%3A+an+analysis+of+unselected+patients+in+the+Cooperative+Osteosarcoma+Study+Group+%28COSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma relapse after combined modality therapy: an analysis of unselected patients in the Cooperative Osteosarcoma Study Group (COSS).</a> J. Clin. Oncol. 23 (3), 559-568 (2005).</li>
<li>Meyers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+randomized%2C+prospective+trial+of+the+addition+of+ifosfamide+and%2For+muramyl+tripeptide+to+cisplatin%2C+doxorubicin%2C+and+high-dose+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a randomized, prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin, doxorubicin, and high-dose methotrexate.</a> J. Clin. Oncol. 23 (9), 2004-2011 (2005).</li>
<li>Gorlick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+childhood+osteogenic+sarcoma+and+potential+targets+for+therapeutic+development%3A+meeting+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biology of childhood osteogenic sarcoma and potential targets for therapeutic development: meeting summary.</a> Clin. Cancer Res. 9 (15), 5442-5453 (2003).</li>
<li>Hayden, J. B., Hoang, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+basic+science+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: basic science and clinical implications.</a> Orthop. Clin. North Am. 37 (1), 1-7 (2006).</li>
<li>Thomas, D., Kansara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+in+osteogenic+differentiation+and+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications in osteogenic differentiation and transformation.</a> J. Cell. Biochem. 98 (4), 757-769 (2006).</li>
<li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+retinoblastoma+gene+in+primary+osteosarcomas+and+other+bone+and+soft-tissue+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of the retinoblastoma gene in primary osteosarcomas and other bone and soft-tissue tumors.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 270 (270), 271-277 (1991).</li>
<li>Chou, A. J., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+resistance+in+osteosarcoma%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy resistance in osteosarcoma: current challenges and future directions.</a> Expert. Rev. Anticancer Ther. 6 (7), 1075-1085 (2006).</li>
<li>Arndt, C. A. S., Crist, W. M. Common musculoskeletal tumorsof childhood and adolescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArndt%2C+CAS+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 341 (5), 342-352 (1999).</li>
<li>Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bone+osteosarcoma+in+the+pediatric+age%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Treat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: state of the art.</a> Cancer. Treat. Rev. 32 (6), 423-436 (2006).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcome+for+patients+with+nonmetastatic+osteosarcoma+of+the+extremity+treated+at+the+istituto+ortopedico+rizzoli+according+to+the+istituto+ortopedico+rizzoli%2Fosteosarcoma-2+protocol%3A+an+updated+report%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcome for patients with nonmetastatic osteosarcoma of the extremity treated at the istituto ortopedico rizzoli according to the istituto ortopedico rizzoli/osteosarcoma-2 protocol: an updated report.</a> J. Clin. Oncol. 18 (24), 4016-4027 (2000).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells-perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR workshop on cancer stem cells.</a> Cancer. Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat. Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+accumulating+evidence+and+unresolved+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: accumulating evidence and unresolved questions.</a> Nat. Rev. Cancer. 8 (10), 755-768 (2008).</li>
<li>Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of cancer stem cells.</a> Semin. Cancer Biol. 17 (3), 204-213 (2007).</li>
<li>Rubio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+human+adult+stem+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Spontaneous human adult stem cell transformation.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3035-3039 (2005).</li>
<li>Burns, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenic+heterogeneity+in+cancer+stem+cells+evolved+from+long-term+cultures+of+telomerase-immortalized+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumorigenic heterogeneity in cancer stem cells evolved from long-term cultures of telomerase-immortalized human mesenchymal stem cells.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3126-3135 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+etiology+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the etiology and treatment of cancer.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16 (1), 60-64 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+transgenes+encoding+components+of+the+Wnt+signaling+pathway+preferentially+induce+mammary+cancers+from+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence that transgenes encoding components of the Wnt signaling pathway preferentially induce mammary cancers from progenitor cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 100 (26), 15853-15858 (2003).</li>
<li>Sell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+cancer%3A+dedifferentiation+or+stem+cell+maturation+arrest%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of cancer: dedifferentiation or stem cell maturation arrest?</a> Environ Health Perspect. 101 (Suppl 5), 15-26 (1993).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24 (4), 372-376 (2000).</li>
<li>Hochedlinger, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+reprogramming+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear reprogramming and pluripotency.</a> Nature. 441 (7097), 1061-1067 (2006).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells and drug resistance.</a> Nat. Rev. Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Ma, S., Lee, T. K., Zheng, B. J., Chan, K. W., Guan, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+HCC+cancer+stem+cells+confer+chemoresistance+by+preferential+expression+of+the+Akt%2FPKB+survival+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway.</a> Oncogene. 27 (12), 1749-1758 (2008).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+isolated+from+mesenchymal+neoplasms+have+tumor+initiating+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential.</a> Cancer. Res. 67 (17), 8216-8222 (2007).</li>
<li>Ma, I., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem. Cell. Rev. 7 (2), 292-306 (2011).</li>
<li>Awad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+ALDH+activity+identifies+chemotherapy-resistant+Ewing%27s+sarcoma+stem+cells+that+retain+sensitivity+to+EWS-FLI1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High ALDH activity identifies chemotherapy-resistant Ewing's sarcoma stem cells that retain sensitivity to EWS-FLI1 inhibition.</a> PLoS One. 5 (11), e13943(2010).</li>
<li>Fujii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+stem-like+cell+populations+with+drug+resistance+in+human+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming stem-like cell populations with drug resistance in human sarcoma cell lines.</a> Int. J. Oncol. 34 (5), 1381-1386 (2009).</li>
<li>Di Fiore, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+characterization+of+the+human+osteosarcoma+3AB-OS+cancer+stem+cell+line%3A+a+possible+model+for+studying+osteosarcoma+origin+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular characterization of the human osteosarcoma 3AB-OS cancer stem cell line: a possible model for studying osteosarcoma origin and stemness.</a> J. Cell. Physiol. 228 (6), 1189-1201 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonicprogenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonicprogenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gibbs, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+cells+in+bone+sarcomas%3A+implications+for+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis.</a> Neoplasia. 7 (11), 967-976 (2005).</li>
<li>Beccari, N., Mazzi, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeccari%2C+N+%22Manuale+di+tecnica+microscopic.+Casa+Editrice+Dr.+Francesco+Vallardi+Societ%C3%A0+Editrice+Libraria%22">Manuale di tecnica microscopic. Casa Editrice Dr. Francesco Vallardi Società Editrice Libraria</a>. , 99-100 (1966).</li>
<li>Majumdar, M. K., Thiede, M. A., Mosca, J. D., Moorman, M., Gerson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+of+cultures+of+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.</a> J. Cell. Physiol. 176 (1), 57-66 (1998).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+bone+sarcomas+contain+CD133%2B+cancer+stem+cells+displaying+high+tumorigenicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Human primary bone sarcomas contain CD133+ cancer stem cells displaying high tumorigenicity in vivo.</a> FASEB J. 25 (6), 2022-2030 (2011).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Martins-Neves, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+an+enriched+cancer+stem-like+cell+population+in+a+human+osteosarcoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of an enriched cancer stem-like cell population in a human osteosarcoma cell line.</a> BMC Cancer. 12 (1), 139(2012).</li>
<li>Tang, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+osteosarcoma+stem+cells+by+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enrichment of osteosarcoma stem cells by chemotherapy.</a> Chin. J. Cancer. 30 (6), 426-432 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

CSCs hebben verschillende eigenschappen die de identificatie van deze specifieke cellulaire set in de tumorbulk mogelijk. Op basis van deze kenmerken, zoals verworven resistentie tegen chemotherapeutische middelen cytotoxische de overexpressie van ATP-bindende cassette multidrug transporters 28, 32, 33, of de opwaartse regulatie van de expressie van detoxificatie enzymen zoals ALDH 32, voor de expressie van een bepaald oppervlak merker, zoals CD133, CD44, CD34, CD90, en andere 30, 34, 35, 41, verschillende methoden om CSCs isoleren ontwikkeld 42-44. Een van deze technieken is de bol vorming assay die is gebaseerd op het vermogen van CSCs groeien onder niet-klevende omstandigheden. Het vermogen van weefsels stamcellen en CSC tot bolletjes gevormd werd eerst beschreven in studies naar de identificatie van neurale stamcellen door Reynolds et al. 37. Vervolgens, Gibbs et al. 38 onsed deze studies beginnen isoleren CSCs van vaste tumoren, met name uit bot sarcomen. We hebben besloten om de sfeer formatie assay methode toegelicht door Gibbs et al gebruiken. CSCs om te isoleren van OSA verkregen cellijnen conventionele OS biopsies. We pasten de oorspronkelijke methode om de resultaten van deze test verhogen en de reproduceerbaarheid van andere kankercellijnen vergemakkelijken. Met oog op de uitwerking van de bol vorming assay, we vastgesteld dat uitplaten 40.000 cellen / putje is een goede praktijk handhaven cellen afzonderlijk aan het begin van de test. Deze truc is zeer belangrijk om de mogelijkheid dat de bolvormige kolonies afkomstig van cellulaire aggregatie en niet van de bijzondere en exclusieve capaciteit van een enkele CSC groeien onder niet-klevende omstandigheden en vormen een bolvormige kolonie voorkomen. Dit vermogen is bijzonder kritisch punt van deze assay. We hebben ook verklaard dat om een ​​goede prijs van de bol formatie te verkrijgenVolstaat om aliquots van groeifactoren verversen elke 3 d en niet dagelijks zoals aangegeven in de oorspronkelijke methode. In deze studie hebben we ook vast en uitgebreid beschreven een goede methode voor het isoleren van de bolvormige kolonies die gevormd wordt wanneer gekweekt onder niet-klevende omstandigheden. Deze stap is essentieel in deze test omdat het zeer belangrijk om te proberen zoveel mogelijk van de bollen mogelijk die worden gevormd in elk isolaat vormt zonder ze te beschadigen. Het is ook belangrijk om alleen de bollen, en niet de cellen, die in suspensie voor de duur van de test zouden kunnen blijven isoleren. Om deze kritische punten te overwinnen, hebben wij een bijzondere isolatiewerkwijze, die, zoals hierboven getoond, gaf goede resultaten voor CSC isolatie ontwikkeld. Uiteraard bestaat de mogelijkheid dat niet alle gebieden die gevormd kunnen worden teruggewonnen, maar het verlies percentage is zeer laag. Sterker nog, we hebben ook de mogelijkheid om een ​​filter te gebruiken met 40 urn poriën om bollen te isoleren nadat ze groot worden (vormed ongeveer 100-200 cellen). Deze isolatie stopt bol vorming maar laat de afzonderlijke cellen, deel van het residu methylcellulose, en de kleinste gebieden te filteren. Deze verwijdering wordt uitgevoerd door een grondige filtratie zoals beschreven in het protocol. Bovendien is de keuze van het grootste bolvormige kolonies door 40 urn mesh met als gevolg dat de kleinste bolvormige kolonies kan men de CSCs met de hoogste capaciteit bolvormig kolonies vormen en met meer stemness selecteren. Al deze aanpassingen werden uitgevoerd om de assay verbeteren en onderzoekers bestuderen CSCs te begrijpen en te reproduceren de meest kritische fase van de oorspronkelijke methode van de bol vorming assay helpen. Onder de studies met betrekking tot in vitro werkwijzen voor het isoleren CSCs, deze studie gericht om te laten zien hoe dit aangepast bol formatie assay een goede methode zou kunnen zijn voor het isoleren van CSCsOSA cellijnen. De aanpassingen van de oorspronkelijke methode en de gedetailleerde isolatie techniek beschreven verbetering van de doeltreffendheid ervan. In een korte tijd, kan goed aantal CSCs worden verkregen en gebruikt voor verschillende experimenten. Daarom is het mogelijk om snel bevestigen de steel-achtige fenotypen en met name de dubbele steel fenotype dat OS-CSCs kenmerkt bestuderen. Aldus zou deze gewijzigde assay een goede techniek voor het isoleren CSCs en de studie biologie. In de toekomst, deze methode extra aanpassingen kunnen ook worden gebruikt om de andere CSCs eindige kankercellijnen verkregen biopten van zeldzame solide tumoren te isoleren. De mogelijkheid van het isoleren CSCs zeldzame vaste tumoren, zoals OS, niet alleen maakt de verbetering van studies over deze specifieke kanker maar ook voor studies van verschillende soorten kanker betere werkwijzen voor de isolatie ontwikkelen en toekomstige studies van de biologie van deze belangrijke cellulaire subgroep. Daarom, zoals wegedaan in deze studie, is het belangrijk om de werkwijzen van CSC isolatie te verbeteren door de studie van CSC biologie, met het uiteindelijke doel van het vinden van moleculaire doelen en de ontwikkeling van een specifieke anti-kanker therapie tegen deze specifieke cellulaire deelverzameling, die waarschijnlijk verantwoordelijk voor het handhaven van de primaire tumor, de ontwikkeling van de herhaling, en het ontstaan ​​van uitzaaiingen in verschillende organen. De studie van de biologie CSC is ook belangrijk voor het vinden van therapieën die scherpe in de behandeling van kankers, zoals OS, waarvan de overleving na neoadjuvante behandeling nog zeer gering zijn.

Sarcomen zijn een heterogene groep van zeldzame kwaadaardige bindweefsel tumoren afkomstig voornamelijk uit de embryonale mesoderm 1. De verschillende typen zijn bot sarcomen en weke delen sarcomen. Bot sarcomen, een groep relatief weinig primaire tumoren, uit meerdere subtypen, waaronder osteosarcoom (OS). OS, een van de meest voorkomende primaire tumoren van het bot, is een mesenchymale maligniteit die uitgebreide klinische, histologische en moleculaire heterogeniteit 2, 3 vertoont. Helaas OS voornamelijk voorkomt bij kinderen en jongvolwassenen 4, 5 en vertegenwoordigt 60% van de de gemeenschappelijke histologische subtypes been sarcoom bij kinderen 6, 7. OS tast gewoonlijk de skelet gebieden, die worden gekenmerkt door snelle botgroei (bijvoorbeeld de metafyse van lange botten). Onder de histologisch verschillende subtypes van OS, conventionele OS, ook wel medullaire of centrale OS, heeft een hoge graad van maligniteit en een quotum share van 80% 8. Deze 80% is samengesteld uit 60% conventionele osteoblastische OS, 10% chondroblastair OS en 10% fibroblastische OS 6, 8-10. Andere OS subtypen behoren anaplastisch, telangiectatic, giant cell-rijk en kleincellige OS. Ondanks de vooruitgang in de gecombineerde operatie en chemotherapie in OS beheer, de uitkomst blijft slecht, met een lange-termijn overleving van 65-70% bij patiënten zonder metastase 11, 12. Distant recidieven vaak voorkomen als longmetastasen of, minder vaak, zoals metastasen naar verre botten en lokaal recidief 13. Metastasen vaak resistent tegen conventionele behandelingen. Deze weerstand is de reden waarom de 10-jaar ziektevrije overleving is ongeveer 30% bij patiënten met metastasen bij diagnose 14, 15. Zoals bij normale weefsel wordt kankerweefsel uit een heterogene verzameling van celsoorten. Cellen in de tumor lijkt overeen te komen met de verschillende stadia van ontwikkeling. Binnen elke normale weefsel bevindt een subpopulatie van cellen met het vermogen om selfrenew, waardoor voorlopercellen en rijpe cellen voor weefsel homeostase. Evenzo wordt kanker uit een soortgelijke heterogene populatie van cellen in verschillende stadia van ontwikkeling, met een verschillende mate van proliferatie en tumorigene potentieel. Een subset van deze kankercellen, genoemd Kanker stamcellen (CSC), vormt een reservoir van selfsustaining cellen met de exclusieve mogelijkheid selfrenew en onderhouden van de maligne potentie van tumoren, waardoor het genereren van de verschillende cellijnen die de tumorbulk 16 vormen. In de jaren 1990, studies over acute myeloïde leukemie op voorwaarde dat de eerste overtuigend bewijs voor het bestaan van CSC subpopulaties 17, 18. CSCs zijn inmiddels geïsoleerd uit een groot aantal vaste tumoren 19, waardoor steeds een van de meest onderzochte onderwerpen in het kankeronderzoek. CSCs inderdaad het gevolg zijn van normale stamcellen door mutaties in genen die normaal makenstamcellen kankerachtige 20-23. Meerdere transformeren mutaties en interacties met de micro-omgeving kan ook bijdragen tot een gezonde voorlopers en volgroeide cellen verwerven van de selfrenewal capaciteit en onsterfelijkheid die CSCs typeren. Er zijn verschillende hypothesen over deze transformatie. Gezond voorlopers, gezonde volwassen cellen en kankercellen, kan dedifferentiate naar stamcellen, het verkrijgen van een stam-achtige fenotype door het activeren-selfrenewal geassocieerde genen 24-28. Ondanks verscheidene recente studies, de oorsprong van CSCs nog om ontdekt te worden. Een bijzonder kenmerk van CSC is dat hun vermogen om de multi-therapie benadering waarbij Gecombineerd chirurgie en chemotherapie met verschillende drugs weerstaan. Recente studies hebben aangetoond dat CSCs ook resistentie kan verwerven om chemotherapie cytotoxische. Mogelijke verklaringen voor deze weerstand onder de overexpressie van ATP-bindende cassette (ABC) multidrug transporter (dat wil zeggen,MDR1 en BCRP1), overexpressie van chemotherapie metaboliserende enzymen zoals aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) en / of veranderingen in celcycluskinetiek 30-33. Het directe gevolg van al deze concepten die tot nu toe zijn beschreven, is dat een kankertherapie efficiënt zou zijn alleen als de CSC subpopulatie volledig werden uitgeschakeld, terwijl de lokale recidief of metastasen op afstand kunnen optreden als zelfs een enkel CSC overleefd. De ontdekking van CSCs in menselijke sarcomen 34, met name besturingssysteem 35, of anderszins bot en zacht weefsel kanker, heeft groot klinisch belang omdat het een mogelijke verklaring waarom veel behandelingen lijken aanvankelijk effectief, maar de patiënten later terugval. Daarom is de hoop voor de toekomst bestrijding conventionele OS is nieuwe en specifieke gerichte therapieën te vinden gebaseerd op de ontwikkeling van innovatieve geneesmiddelen gericht op OS-CSCs dankzij de moleculaire karakterisering van deze subbevolking en de studie van CSC biologie. In 1992, Reynolds en collega&#39;s, die zijn onderzocht of een subset van stamcellen in de hersenen aanwezig volwassen zoogdieren was, ontwikkelde een methode om cellen vermoedelijk stamcellen-achtige cellen 36, 37 te isoleren. Deze methode is gebaseerd op het specifieke vermogen van deze cellen bolvormige kolonies vormen wanneer gekweekt onder omstandigheden hechtende. Soortgelijke technieken in dienst waren van Gibbs en zijn collega&#39;s in 2005 tot een subpopulatie van stamcellen-achtige cellen in het bot sarcomen 38 bestuderen. Isoleren en karakteriseren OS-CSCs uit primaire celkweken van verschillende soorten conventionele OS, besloten we om deze techniek OS cellijnen passen. We beschrijven hier de aangepaste methode van de bol vorming assay, aangeduid als &quot;sarcosphere assay&quot;, die kan worden gebruikt voor het isoleren OS-CSCs van eindige primaire cellijnen afgeleid uit humane biopten van conventionele OS. We beschrijven ook alle technieken die used de steel-achtige CSC fenotype van cellijnen geïsoleerd door deze te valideren: 1) evaluatie van de expressie van genen die pluripotente embryonale stamcellen (SER detecteren) en de CD133-gen, dat een merker van CSCs; 2) kolonievormende eenheid (CFU) test; 3) evaluatie van het vermogen van deze cellen om te differentiëren tot osteoblasten en differentiatie adipocyten onder geschikte omstandigheden; 4) studie van het oppervlak markers van mesenchymale stamcellen (MSC) (dat wil zeggen, CD44, CD105 en Stro-1) door immunofluorescentie kleuring en door flowcytometrische analyse; 5) evaluatie van de ALDH activiteit van deze cellen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline&nbsp; without Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>Porcine Trypsin 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td>Solvent: Buffer Solution, pH 7.4. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>BDH Chemicals-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>Nutrient Mixture F-12 Ham</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: 5 mg/mL</td></tr><tr><td>&beta;-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: 1 M</td></tr><tr><td>Insulin. Human Recombinant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td><td>Solvent: NaOH 0.1 M. Stock concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Solvent: DMSO. Stock concentration: 500 mM</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>Solvent: DMSO. Stock concentration: 200 mM</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>Solvent: DMSO. Stock concentration:&nbsp; 1 mM / 100 &micro;M. Store in liquid nitrogen to maintain the biological activity</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum South America&nbsp;</td><td>EUROCLONE</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (PEN-STREP) 10,000 U/mL</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: 2%</td></tr><tr><td>Putresceine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>apo-Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: 25 mg/mL</td></tr><tr><td>Human Epidermal Growth Factor (EFGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>Solvent: DPBS pH 7.4. Stock concentration: 10 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor-Basic Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Solvent: DPBS + 0.2% BSA. Stock concentration: 25 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Selenous Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211176</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: 30 mM</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Solvent: ETOH. Stock concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>ICN Biochemicals</td><td>155984</td><td>Solvent: 2-Propanol. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Naphtol AS-MX Phosphate Disodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>Solvent: DMSO. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Fast Blue BB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3378</td><td>Solvent: Tris HCL, pH 9.0. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td>Solvent: Tris HCL, pH 9.1. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Fraction V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: 2%</td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>ICN Biochemicals</td><td>100375</td><td>Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder</td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton-100X</td><td>MERCK</td><td>11869</td><td>Solvent: DPBS. Stock concentration: 0.2%. Gevaar - Alleen gebruiken onder chemische kap</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>MERCK</td><td>2315</td><td>Solvent: DPBS . Stock concentration: 200 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>MERCK</td><td>109634</td><td>Gevaar - Alleen gebruiken onder chemische kap</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; (Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td><td>Abcam</td><td>ab11415</td><td>Liquid. Application:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Flow Cytometry (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; (Mouse monoclonal&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; [F10-44-2] to CD44 (PE/Cy7

oprichting van cancer stem cell cultures van human conventionele osteosarcoom

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

De huidige verbeteringen in de therapie tegen osteosarcoom (OS) hebben het leven van kankerpatiënten verlengd, maar de overlevingskans van vijf jaar nog steeds slecht toen metastase heeft plaatsgevonden. De Stem Cancer Cell (CSC) theorie stelt dat er een subset van tumorcellen binnen de tumor die stam-achtige eigenschappen, waaronder het vermogen om de tumor te handhaven en multidrug chemotherapie weerstaan. Daarom is een beter begrip van OS biologie en pathogenese nodig om vooraf de ontwikkeling van therapieën gericht deze bepaalde subset roeien en morbiditeit en mortaliteit bij patiënten. Isoleren CSCs, tot oprichting van celculturen van CSCs, en de studie van de biologie zijn belangrijke stappen gezet om het verbeteren van onze kennis van OS biologie en pathogenese. De oprichting van mensen afgeleide OS-CSCs van biopten van OS wordt mogelijk gemaakt met behulp van verschillende methoden, waaronder het vermogen om 3-dimensionale stamcelkweken onder nonadhere creërennt omstandigheden. Onder deze omstandigheden, CSC kunnen sferische drijvende kolonies gevormd door de dochter stamcellen; deze kolonies worden &quot;cellulaire sferen &#39;. We beschrijven een werkwijze om CSC culturen van primaire celculturen conventionele OS OS verkregen uit biopsieën stellen. We hebben duidelijk een beschrijving van de verschillende passages die nodig is om te isoleren en te karakteriseren CSCs.

De aanwezigheid van kanker stamcellen (CSC) in bot sarcomen Onlangs is gekoppeld aan de pathogenese. In dit artikel presenteren we de isolatie van CSCs van primaire celculturen verkregen uit humane biopten van conventionele osteosarcoom (OS) met de mogelijkheid van CSCs groeien onder hechtende omstandigheden.

Oprichting van Cancer Stem Cell Cultures van Human Conventionele Osteosarcoom

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Het algemene doel van dit essay is om kankerstamcellen te isoleren uit een eindige cellijn afkomstig van menselijke osteosarcomen. Het belangrijkste voordeel van dit werk is om anderen in het vakgebied van de oncologie duidelijk te tonen hoe kankerstamcellen in vitro kunnen worden geïsoleerd. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor onderzoek naar therapieën tegen osteosarcoma en andere solide tumoren.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze materie moeite hebben als ze niet weten hoe ze de sarcoomkolonies moeten isoleren. Een visuele demonstratie hiervan is cruciaal, aangezien de isolatiestap moeilijk te realiseren en te begrijpen is. We kregen voor het eerst het idee voor deze techniek toen we hadden gelezen over de sphere-formatie-assay.Beschreven door Gypsum en medewerkers. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Gaia Palmini, een promovendus, en Dr. Roberto Zonefrati, een technicus uit mijn laboratorium. Begin met het klaarmaken van alle benodigde kweekmedia.Verteringsbuffers en andere oplossingen die nodig zullen zijn voor de procedure. Stel vervolgens een eindige cellijn van osteosarcoom vast door osteosarcoom te isoleren uit een bevestigde naald- of chirurgische biopsie, en cultiveer de verkregen cellen verder zoals beschreven in het bijbehorende tekstartikel.Zodra de osteosarcoomcelkweek is gevestigd en de plaat bijna confluent is, wordt het medium door aspiratie verwijderd en worden de cellen getrypsineerd om ze los te maken van de plaat. De cellen worden overgebracht naar een nieuwe buis en de celsuspensie wordt voorzichtig op en neer gepipetteerd om eventuele celklonten te verspreiden.Verzamel vervolgens tien µL van de celsuspensie en breng deze over naar een hemocytometerkamer. Plaats de hemocytometerkamer onder een fasecontrastmicroscoop en bereken de concentratie cellen in de suspensie. Voeg vervolgens 280.000 cellen toe aan 35 milliliters sarcosfeer-groeimedium, dat methocellulose bevat, en meng de oplossing voorzichtig met een pipet om eventuele klontjes te verspreiden.Breng vijf milliliter van het cellenmengsel over naar elke put van zes-puts ultra low attachment platen. Nadat de cellen zijn uitgeplaat, wordt een omgekeerde microscoop gebruikt om te observeren hoe de cellen eruitzien en of ze goed geïsoleerd zijn. Incubeer de cellen in een incubator bij 37 °C en vijf procent koolstofdioxide.Voeg elke drie dagen verse alcoholaten van beta FGF en EGF toe aan elke put om de concentratie van de groeifactoren te vernieuwen. Controleer de voortgang van de sarcosfeer-assay door de cellen onder de microscoop te bestuderen op dag 7, 14, 20, 21 en 28. Wanneer u de aanwezigheid waarneemt van grote zwarte sarcosferen die geconcentreerd zijn in het midden van de put, stop dan met het cultiveren en begin met het dissociatieproces.Wanneer het tijd is om de sarcosfeer te isoleren, gebruik dan een steriele pipet van 1 000 microliter om het medium met de sarcosferen over te brengen naar een spuit met een steriele membraanfilterhouder. Nadat het medium met de sarcosferen volledig is verwijderd, voegt u vijf milliliter groeimedium toe aan de put en spoelt u deze om zeker te weten dat alle resterende sferen zijn verzameld.Gebruik vervolgens een microscoop om te bevestigen of alle sarcosferen zijn teruggewonnen. Is dat niet het geval, was de put opnieuw totdat de collectie van de sferen voltooid is. Filter daarna de suspensie door zwaartekracht via de membraanfilterhouder om beschadiging van de sferen te voorkomen en zorg ervoor dat er geen sarcosferen door het filter gaan.Verwijder tijdens dit proces eventuele luchtbellen door voorzichtig een steriele glazen Pasteurpipet te gebruiken. Zodra alle sarcosferen zijn gefiltreerd, wordt de filtereenheid gewassen door tien milliliter groeimedium rechtstreeks in de spuit aan te brengen en dit zonder druk te laten filteren om er zeker van te zijn dat individuele cellen worden geëlimineerd. Nadat de suspensie van sarcosferen is gefiltreerd, dient het filter van de vloeistof te worden weggegooid, waarbij nauwkeurige aandacht moet worden besteed aan het terugwinnen van sarcosferen die in het netfilter verstrikt zijn geraakt.Haal op dit punt de filtereenheid van de spuit af. Plaats deze in een petrischaal van 100 millimeter. Verwijder het netfilter uit de houder van het membraanfilter met een steriele pincet.En breng het filter over naar een nieuwe petrischaal van 60 millimeter. Was vervolgens het netfilter door het voorzichtig te schudden, terwijl er vijf milliliter groeimedium wordt toegevoegd om de sarcosferen uit de kluwen van het membraan te laten ontsnappen.Plaats vervolgens het membraan in een putje en bevestig via microscopische observatie dat er geen sferen meer in het membraan verstrikt zitten. Was het membraan opnieuw en controleer het membraan vervolgens opnieuw onder de microscoop om te zien of er nog steeds sferen in het membraan verstrikt zitten. Wanneer er geen sferen meer in het membraan achterblijven, worden deze geïncubeerd in groeimedium om de sarcosferen uit te laten groeien tot een monolaag.Monitor de groei van de osteosarcoom-kankerstamcellen, die zijn verkregen uit de sarcosferen. Laat de cellen groeien tot een confluentie van ongeveer 90% in een petrischaal van 60 millimeter. Naast de talrijke standaardprotocollen in dit artikel, worden methoden om het differentiatievermogen, de ALDH-activiteit, flowcytometrie, immunofluorescentie en RTPCR-analyse te evalueren, gedetailleerd beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Osteosarcoommonsters worden verkregen via naaldaspiratie of chirurgische resectie. Indien correct behandeld, duurt het ongeveer één maand voordat de primaire culturen confluentie bereiken in een petrischaal van 100 millimeter. Na expansie worden de cellen uitgeplaat in six-well ultra-low attachment platen om de sarcosfeer-assay te starten.Deze plaat houdt de cellen in een gesuspendeerde toestand en voorkomt aanhechting aan het substraat. Na zeven dagen worden verschillende kleine sferische kolonies waargenomen, omringd door enkelvoudige cellen. Na 28 dagen worden verschillende grote sarcosferen waargenomen.Zodra de sferische koloniën zijn geïsoleerd, kunnen stamcelachtige kankercellen worden uitgebreid vanuit de enkelvoudige sarcosferen door deze op normale adhesieplaten te plaatsen. De immunofluorescentiekleuringen hebben het mesenchymale stamcelachtige fenotype aangetoond, aangezien de uitgebreide cellen positief waren voor CD44 en CD105, en matig positief voor Stro-1. RT-PCR toonde eveneens het embryonale stamcelfenotype aan door de expressie van drie embryonale stamcelmarkergenen.Nanog, Oct 3/4 en Sox2. En het CD133-gen, een marker voor kankerstamcellen bij osteosarcoom. De gedetailleerde isolatietechniek die we in deze video hebben laten zien, zal de weg vrijmaken voor andere onderzoekers om kankerstamcellen te bestuderen door hen te laten zien hoe ze de meest kritische stappen van de sphere-formatie-assay kunnen begrijpen en reproduceren.Deze gemodificeerde assay is een goede techniek voor het isoleren van kankerstamcellen en het bestuderen van hun biologie. Deze methode kan, met aanvullende aanpassingen, ook worden gebruikt om kankerstamcellen te isoleren uit andere eindige kankercellijnen, verkregen uit biopsieën van solide tumoren.Concluderend zal de isolatie van kankerstamcellen uit verschillende typen tumoren het mogelijk maken om hun biologie te bestuderen, met als uiteindelijke doel het vinden van moleculaire targets en het ontwikkelen van zeer specifieke antikankertherapieën die gericht zijn tegen specifieke cellulaire subsets.

establishment-cancer-stem-cell-cultures-from-human-conventional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

De isolatie van kankerstamcellen (KSC) rechtstreeks van menselijke weefsels is voorwaarde voor hun biologische karakterisering. Dit manuscript beschrijft een methode voor de isolatie van prostaat CSC van menselijk weefsel, terwijl ook het verstrekken van tips over het oplossen van moeilijke stappen.

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

Kanker stamcellen (CSC) betrokken zijn bij tumor recidief vanwege chemoresistentie. Wij hebben een protocol voor selectie en uitbreiding van CSC van eierstokkanker cellijnen geoptimaliseerd. Door het behandelen van cellen met het chemotherapeutische cisplatine en kweken in een stamcel bevorderen media we verrijken voor niet-hechtende CSC kweken.

Verrijking voor chemoresistent eierstokkanker stamcellen uit menselijke cellijnen

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Het volgende protocol is gericht op de oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom (STS). Dit model kan ons helpen om beter inzicht in de moleculaire achtergrond en farmacologisch profiel van deze zeldzame maligniteiten en kon vertegenwoordigen een startpunt voor verder onderzoek ter verbetering van het beheer van de St.

Oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de isolatie van tumor-initiërende cellen van humaan Sarcoom patiënt-afgeleide xenotransplantaten door fluorescentie-geactiveerde celsortering, waarbij gebruik wordt gemaakt van humaan leukocyten antigeen-1 (HLA-1) als een negatieve marker, en voor de verdere validering en karakterisering van deze HLA-1-negatieve tumor initiërende cellen.

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

Slapende en actieve kanker cel fenotypen werden gekenmerkt met behulp van kwantitatieve fase imaging. Cel proliferatie, migratie en morfologie assays werden geïntegreerd en geanalyseerd in één eenvoudige methode.

Een Time-lapse, Label-vrije, kwantitatieve fase Imaging studie van slapende en actieve menselijke kankercellen

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van Li-Fraumeni syndroom (LFS) patiënt afgeleide fibroblasten, differentiatie van iPSCs via mesenchymale stamcellen (MSCs) botcellen te modelleren in vivo tumorigenesis met behulp van LFS patiënt afkomstige botcellen.

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Het doel van deze methodologie is om kankercellen (CSC) te identificeren in kankercellijnen en primaire menselijke tumormonsters met het bolvormende protocol, op een robuuste manier, met behulp van functionele testen en fenotypische karakterisering met stroomcytometrie en westerse Vlek.

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Het huidige protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een patiënt-afgeleid xenotransplantaat (PDX) muismodel met behulp van humaan osteosarcoomweefsel.

Oprichting van een van de patiënt afgeleid xenotransplantaatmuismodel met humaan osteosarcoomweefsel

Leer hoe je kankerstamcellen isoleert uit menselijk osteosarcoom met behulp van de sarcosfeer-assay. Deze methode toont visueel de isolatiestappen voor onderzoek naar gerichte therapieën.

Oprichting van Cancer Stem Cell Cultures van Human Conventionele Osteosarcoom

Meer video's verkennen