Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van uit vet afgeleide stamcellen uit subcutaan wit vetweefsel van varkens om hun vermogen om te differentiëren in mesenchymale adipocyten, osteocyten en chondrocyten te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen obesitasonderzoek. Het is een waardevol instrument om het moleculaire mechanisme te ontrafelen dat betrokken is bij de regulatie van de ontwikkeling van vetweefsel.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een grote hoeveelheid stromovasculaire cellen kan worden geoogst, wat een diepgaande analyse van adipocytdifferentiatie en biologie mogelijk maakt. De implicatie van deze techniek is relevant voor onderzoek naar stamceltherapie, aangezien uit vetweefsel afgeleide stamcellen van varkens multipotentie vertonen voor transdifferentiatie naar meerdere cellijnen. Begin met het plaatsen van het biggetje in buikligging op een schone operatietafel.

Scher all het haar langs de middellijn af van de nek tot de staart en schrob de dorsale huid drie keer met 7,5% Povidonjodium. Laat na de derde beurt het jodium ongeveer 10 minuten op het huidoppervlak inwerken. Spray vervolgens de huid in met 70% ethanol.

Gebruik vervolgens met ethanol doordrenkte gaasjes om de huid in één richting af te vegen om het desinfectiemiddel te verwijderen totdat er geen duidelijke kleur meer zichtbaar is. Maak daarna een incisie vanaf de nekstreek naar beneden richting het poot. Scheid vervolgens, terwijl het vet en de huid met een pincet worden vastgehouden, met een scalpel de porcine dorsale vetlaag van subcutaan adipose weefsels en de aangrenzende huidlaag van de spieren.

Dompel de huid- en vetweefsel direct onder in een gesteriliseerd bekerglas van 200 ml met serumvrij DMEM bij 37 °C en bespuit de buitenkant van het bekerglas met 70% ethanol. Plaats het bekerglas vervolgens in een laminaire flow-celkweekkap en leg een gesteriliseerde, drielaagse folieafdekking van 40 bij 30 cm naast het bekerglas. Draag het weefsel over naar de folie, met de huidzijde naar beneden.

Gebruik een pincet en een schaar om het resterende spierweefsel van het vetweefsel te verwijderen. Snijd het vet in vierkante stukken van 7 bij 7 centimeter en breng de vetstukken vervolgens over in een nieuw gesteriliseerd bekerglas van 200 milliliter met serumvrij DMEM van 37 °C. Plaats nu een aangepaste plakhouder, uitgerust met een snijblad van koolstofstaal, op de afdekfolie en leg een van de vetstukken op de snijder met de vetlaag naar beneden.

Snijd het vet in stukjes van ongeveer 1 millimeter dik, zo dicht mogelijk bij de huid, maar zonder deze door te snijden. Gebruik vervolgens een schaar om de stukjes vetweefsel zo fijn mogelijk te vermalen en voeg de stukjes toe aan een Erlenmeyerkolf van 250 milliliter met gefilterd digestiemedium aangevuld met collagenase. Incubeer de kolf met draaibewegingen gedurende 90 minuten bij 45 RPM in een orbitale schudmachine bij 37 graden Celsius.

Wanneer het digestiemedium een suspensie wordt, zonder significante weefselklonten, wordt de digestie stopgezet met een gelijk volume kweekmedium bestaande uit DMEM F-12 met 10% FBS. Om de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van varkens te verzamelen, wordt de gedigesteerde suspensie van vetweefsel door een enkele laag chiffon in een gesteriliseerde serologische fles van 250 milliliter gefilterd, waarbij een pincet wordt gebruikt om het midden van de chiffon in te drukken om de passage van het digestaat te geleiden en te bevorderen. De chiffon wordt met het pincet leeggedrukt en getordeerd om de passage te voltooien, waarna het medium wordt verdeeld over vier conische centrifugebuizen van 50 milliliter.

Verzamel de stroma-vasculaire cellen door middel van centrifugatie. Schenk vervolgens het supernatant af zonder de pellets te verstoren, om het grootste deel van de bovenste vetlaag met de rijpe adipocyten te verwijderen. Resuspendeer de pellets daarna in 10 milliliters DMEM door middel van pipetteren en voorzichtig schudden.

Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer de pellets in 10 milliliters ACK-lysisbuffer. Stop na zeven minuten bij kamertemperatuur de lysis van de rode bloedcellen door 10 milliliters DMEM aan elke buis toe te voegen en de buizen voorzichtig te schudden om te mengen. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw.

Was de cellen nog twee keer met 10 milliliter DMEM en breng vervolgens de supernatant via een zeef van 100 micron samen in één conische buis van 50 milliliter. Pipetteer de cel-suspensie voorzichtig enkele keren om de cellen gelijkmatig te verdelen en tel de cellen middels Trypan Blue-uitsluiting. Zaai tenslotte de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken in een passende kweekcontainer in celkweekmedium met een dichtheid van 6 × 10⁴ per vierkante centimeter.

Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 om de vorming van een monolaag te faciliteren. De morfologie van de uit de stroma-vasculaire fractie verkregen varkensadipose-afgeleide stamcellen is vergelijkbaar met die van muizen- of menselijke adipose-afgeleide stamcellen, waarbij 24 uur na het uitplaten een uitgebreide glasvezelachtige morfologie wordt waargenomen. De varkensadipose-afgeleide stamcellen worden binnen 72 uur confluent, waarna ze klaar zijn voor differentiatie tot adipocyten of andere mesenchymale typen.

Deze cellen vertonen daarnaast een sterk adipogeen potentieel na chemische inductie en rijpe adipocyten kunnen worden waargenomen na negen dagen differentiatie, waarbij meer dan 90% van de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken adipogene differentiatie vertoont. Oppervlaktemerkers voor mesenchymale stamcellen, waaronder CD 29, CD 44, CD 90 en MHC 1, worden sterk tot expressie gebracht in de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken, terwijl CD 4a, CD 31, CD 45 en MHC II nauwelijks detecteerbaar zijn, wat aantoont dat deze uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken kenmerken van het mesenchymale type vertonen zonder significante contaminatie door endotheelcellen of hematopoëtische stamcellen. Bovendien kunnen de gedifferentieerde uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken worden geïdentificeerd als adipocyten, osteocyten of chondrocyten door middel van specifieke weefselkleuringen, wat bewijst dat deze uit de stroma-vasculaire fractie afgeleide cellen een multipotentie behouden die typisch is voor progenitoren van het mesenchymale type.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een goede aseptische techniek voor celkweek toe te passen en alle stappen zo snel mogelijk uit te voeren om de levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren. Zodra de techniek beheerst is, kunnen de cellen in zes uur uit twee tot drie varkens worden geoogst, mits de techniek correct wordt uitgevoerd.

Deze standaardtechniek baande de weg voor obesitasonderzoekers in het veld van diabetes om moleculaire schakelaars te verkennen, zoals transcriptiefactoren die de differentiatie van adipocyten beheersen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u mesenchymale stamcellen uit varkensvetweefsel kunt isoleren en hoe u het vermogen van deze cellen kunt evalueren om te differentiëren tot adipocyten, osteocyten en chondrocyten.