Name: Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer de isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit varkens voor regeneratieve geneeskunde. Dit protocol toont collagenase-vertering en differentiatie naar adipocyten, osteocyten en chondrocyten met hoge efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag dank uitspreken aan alle lab leden voor de uitgebreide discussie en techniek ondersteunt in dit protocol. Onderzoek uitgevoerd in het lab werd ondersteund door subsidies van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2314-B-002-126 en MOST 102-2313-B-002-026-my3) en door subsidies van Aim for the Top University Plan (104R350144) van de Nationale Universiteit van Taiwan.

Opmerking: deze methode is vastgesteld en gebruikt in het onderzoek meldde eerder 14-17 van dit laboratorium; na verloop van tijd de methodologie werd aangepast. De huidige procedure werd uitgevoerd met een gemiddelde van 60 g varkens onderhuidse vetweefsels van een biggetje (7-9 dagen oud) met zaaien op 6-putjes weefselkweekplaten. Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) bij National Taiwan University. 1. Bereid Spijsvertering Medium <ol><li> Verkrijgen onderhuidse vetweefsel van de nek en rug; 40 tot 80 g per big (7-9 dagen oud), afhankelijk van de grootte van de varkens. Hier, gebruik maken van 60 g van het onderhuidse vetweefsel verkregen uit één varken. </li><li> Bereid spijsvertering medium: weeg collagenase II poeder met een totaal van 54.000 eenheden en oplossen in 90 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM,60 g vet) in een 100 ml fles serologische (900 eenheden collagenase / 1,5 ml DMEM / g vet). </li><li> Schud het digestiemedium op een schudtafel (100 opm) gedurende ten minste 15 min op te lossen en vervolgens de vertering medium door een 0,22 urn filter voor sterilisatie. Bewaar bij 4 ° C voor gebruik. </li></ol> 2. Dissect Onderhuids vetweefsel van varkens <ol><li> Steriliseer alle instrumenten, glas en plastic ware en warm alle media tot 37 ° C voor gebruik. </li><li> Offeren biggetje met elektrische verdoving en leegbloeden of met een werkwijze volgens de plaatselijke IACUC voorschriften. Voer dissectie zorgvuldig en direct na biggen worden opgeofferd. </li><li> Leg de biggen op een schone chirurgische tabel (terug naar boven en de buik naar beneden). Afscheren het haar van de big terug verwijderen van al het haar van de nek tot de staart en aan beide zijden tot aan de middellijn. </li><li> Schrob het varken dorsale huid met 7,5% povidone-jood driemaal (met drie nieuwe onafhankelijke scrubs), waarna het jodium op de oppervlakte van de huid zitten voor ongeveer 10 minuten. </li><li> Verwijder de povidonjood met meerdere sprays van 70% ethanol. Gebruik gaasjes of toiletpapier met 70% ethanol om de huid te reinigen van een richting, herhalen totdat geen duidelijke kleur van povidonjood waargenomen. </li><li> Gebruik een scalpel varkens dorsale vetlaag van onderhuidse vetweefsels scheiden samen met de aangehechte huidlaag van de spieren terwijl het vet en huid behulp van een tang. </li><li> Onmiddellijk dompel de vetlaag van het onderhuidse vetweefsel met aangehechte huid in een gesteriliseerde bekerglas (200 ml) met serumvrij DMEM. </li><li> Spuit de buitenzijde van de beker die de vetlaag met 70% ethanol en in een laminaire stroming kap celkweek. Zet een grote (40 cm x 30 cm) gesteriliseerd drielaagse afdekfolie in de kap. [Een driedubbele laag wordt gebruikt om continue integriteit.] </li><li> Plaats deweefsel met de huid naar beneden op de afdekfolie. </li><li> Snijd de resterende spierweefsel af van het vetweefsel met behulp van pincet en een schaar om besmetting met spierweefsel te voorkomen. </li><li> Snijd het vet in vierkante stukjes (~ 7 cm x 7 cm) met een scalpel of schaar. Deze verdelen van de vetlaag in een nieuwe gesteriliseerde bekerglas (200 ml) met serumvrij DMEM. </li><li> Stel een aangepaste slice houder op de afdekfolie geassembleerd met een koolstofstalen snijmachine mes (figuur 1). Neem een ​​stuk van vet uit de beker en plaats het op de snijmachine (huidlaag bovenop en vetlaag onder). </li><li> Snijd de vetlaag van het onderhuidse vetweefsel in ongeveer 1 mm dikke stukken. Snijd de vetlaag van de huid zo dicht mogelijk, maar voorkomen doorsnijden van de huid. </li><li> Gehakt gesneden vetweefsel met schaar zo fijn mogelijk. </li><li> Voeg gefilterd spijsvertering medium dat collagenase een erlenmeyer van 250 ml of een serologische fles met gehaktvetweefsel (54.000 eenheden van collagenase / 90 ml DMEM / 60 g vet). </li><li> Incubeer en schud de kolf bij 45 rpm in een orbitale schudder gedurende 90 min bij 37 ° C om de collagenase om de weefsels te verteren. Opmerking: Controleer elke 15 tot 30 minuten om te voorkomen dat over-vergisting. Het verteringsproces is afgerond als de spijsvertering medium is een suspensie zonder noemenswaardige weefsel klonten. </li><li> Voeg een gelijk volume (gelijk aan de digestiemedium) of kweekmedium dat DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum (FBS) aan de collagenase digestie stoppen. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig1.jpg" /> Figuur 1. Een aangepast snijmachine gebruikt voor isolatie van pADSC. Ontlede vetweefsel van varkens dorsale subcutane vetweefsel bestaan ​​uit de vetlaag met aangrenzende huidlagen. Een snijmachine is vereist om de vetlaag ongeveer 1 mm dik met vermijden van over- snijdensnijden in de huidlagen. Van links naar rechts: De plak van de houder, snijmachine pad, koolstofstaal snijmachine mes en schroeven. Snijmachine blad wordt tussen slice houder en snijmachine pad als het wordt gemonteerd geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 3. Inning van pADSC uit de stromale-vasculaire Fraction <ol><li> Voorbij de vertering medium dat het gedigereerde vetweefsel door een enkele laag van chiffon in een schone gesteriliseerde 250 ml Erlenmeyer of 250 ml serologische fles. Gebruik een tang om het midden van de chiffon te begeleiden en de passage van de digest te helpen drukken. </li><li> Giet ze af en draai de chiffon met een tang om doorgang te voltooien. </li><li> Verdeel de vertering medium in vier 50 ml conische centrifugebuizen (~ 40 ml medium per buis). </li><li> Centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min naar het pellet van stromale-vasculaire cellen te verzamelen. </li><li&gt; Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder de pellets te verstoren meeste van de bovenste vetlaag die mature adipocyten te verwijderen. Was de pellet door toevoeging van 10 ml DMEM aan elke buis om de pellet door pipetteren en zachtjes schudden van de buis te resuspenderen. </li><li> Centrifugeer bij 700 xg gedurende 6 min. Schenk de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 10 ml ACK lysis buffer en resuspendeer de pellet door pipetteren. Laten staan ​​7 minuten (5-10 min) bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren in de stromale-vasculaire fractie. </li><li> Voeg gelijke hoeveelheden DMEM (10 ml) aan het reactiemengsel onder zachtjes schudden van de buis te stoppen en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min. </li><li> Decanteer het supernatant, voeg 10 ml DMEM aan elke buis, resuspendeer de pellet met herhaalde pipetteren en centrifugeer bij 700 xg gedurende 6 min. Herhaal dit twee keer. </li><li> Verzamelen en passeren de DMEM (totaal 40 ml DMEM vanaf 4 buizen die 60 g vet) met gesuspendeerde cellen door een 100 urn zeef in een nieuwe 50 ml conische buis. </li><li> Voorzichtig pipet medium meerdere malen goed en aliquot meng 20 pl celbevattende medium gemengd met 180 ul 0,4% trypan blauwe oplossing (1:10 verdunning) in een nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer en zaad pADSC bij een dichtheid van 60.000 cellen / cm2 op een gewenste grootte van kweekschaal of platen met kweekmedium dat DMEM / F12, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica penicilline -streptomycin-amfotericine B oplossing (P / S / A). In het algemeen, het zaad van de pADSC op de 6-well weefselkweek platen voor adipocyten of osteocyt differentiatie. Het zaad van de pADSC op 10-cm schalen voor oppervlakte marker kleuring van stamcellen of chondrocyten differentiatie. </li><li> Incubeer de platen of schotels in de 37 ° C incubator in lucht met 5% CO2 tot celhechting aan de platen mogelijk. </li></ol> 4. Identificatie Stem-celoppervlaktemerkers van pADSC door flowcytometrie <ol><li> Na 24 uur, volledig verwijderen van het medium, th wassene 10-cm schaaltje tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en oogsten cellen met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Neutraliseren trypsine-EDTA met gelijke hoeveelheden kweekmedium (1 ml), laat cellen in een nieuwe 15-ml conische buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 7 minuten. </li><li> Schenk de bovenstaande vloeistof. Was de pellet twee keer in 3 ml ijskoude FCS-wasbuffer (PBS dat 10% FBS) middels resuspensie door pipetteren gekoppeld aan centrifugatie bij 400 xg gedurende 7 min. </li><li> Resuspendeer, tellen, en pas pADSC tot 10 6 cellen / ml in ijskoud FCS-wasbuffer. Plaats cellen (100 pl / per buisje) in meerdere nieuwe 15-ml conische buis en incubeer buisjes die pADSC bij 4 ° C gedurende 30 min met antilichamen tegen ofwel phycoerythrine-geconjugeerd CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE of MHC II-PE voor directe kleuring. Stop de reactie door het wassen van de cellen tweemaal in 10 ml FCS-wasbuffer in combinatie met 400 × g centrifugation gedurende 7 min. </li><li> Fix en resuspendeer cellen fixatie buffer (PBS met 0,01% FBS en 1% formaldehyde) voor flowcytometrie volgens de instructies van de fabrikant en onze eerdere publicatie 18. </li></ol> 5. Differentiatie van pADSC tot adipocyten, Osteocyten en chondrocyten <ol><li> Differentiatie van pADSC tot adipocyten <ol><li> Bereid adipocyten inductie medium en adipocyten onderhoud medium <ol><li> Voor adipocyten inductiemedium bereiden 1 L serumvrij DMEM / F12 (met antibiotica van 1% P / S / A) het volgende bevat: 1 ml insuline voorraad (10 mg / ml HEPES buffer, pH 8), eindconc = 10 ug / ml; 1 pl T3 voorraad (3,3 &#39;, 5-trijood-L-thyronine, 1 mM in DMSO), eindconcentratie = 1 nm; 200 pl stock transferrine (50 mg / ml dubbel gedestilleerd H2 O), eindconcentratie = 10 ug / ml; 100 ul dexamethason voorraad (10 mmol in ethanol), eindconcentratie = 1 micrometer; 100 ul rosiglitazon voorraad (10 mM in DMSO), final conc= 1 uM. </li><li> Bereid adipocyten onderhoudsmedium met dezelfde toevoegingen als inductiemedium, maar met weglaten van dexamethason. </li></ol></li><li> Differentiatie proces voor adipocyten Let op: Na het zaaien pADSC op 6-well platen, zal pADSC worden confluent binnen 72 uur. <ol><li> Na 3 dagen Verwijder het medium volledig en voeg 3 ml adipocyten inductie medium in elk putje. Zet de platen in de incubator. Dit is dag nul van differentiatie. </li><li> Na 3 dagen, verwijder de adipocyten inductie medium volledig en te vervangen door 3 ml van adipocyten onderhoud medium om de drie dagen. Volwassen adipocyten zullen terminaal gedifferentieerd worden met ongeveer 9 dagen. Meer dan 90% van de adipocyten zijn goed gedifferentieerd gebruik van dit protocol. Deze adipocyten zijn klaar voor Oil Red O kleuring. </li></ol></li></ol></li><li> Differentiatie van pADSC in osteocyten <ol><li> Bereid osteocyt inductie medium: compleet cultuur medium (DMEM / F12 met 10% FBS en 1% P / S / A) met 1 uM dexamethason, 10 mM β-glycerofosfaat en 50 pg / ml ascorbaat-2-fosfaat. </li><li> Differentiatie proces voor osteocyten Let op: Na het zaaien pADSC op 6-well platen, zal pADSC worden confluent binnen 72 uur. <ol><li> Na 3 dagen, verwijder het medium volledig en voeg 3 ml osteocyt inductie medium in elk putje. Zet de platen om de 37 ° C incubator. Dit is de dag nul van differentiatie. </li><li> Vervang osteocyt inductie medium om de drie dagen. Volwassen osteocyten zal vormen met 14 dagen van differentiatie. Deze osteocyten zijn klaar voor alizarinerood S kleuring. </li></ol></li></ol></li><li> Differentiatie van pADSC tot chondrocyten <ol><li> Bereid chondrocyten inductie medium: aMEM bevattende 1% FBS, 6,25 ug / ml insuline, 50 ug / ml ascorbaat-2-fosfaat en 10 ng / ml transformerende groeifactor-β1. </li><li> Differentiatie proces voor chondrocyten <ol&gt; <li> Na zaaien pADSC op 10-cm kweekschalen gedurende 24 uur, verwijder kweekmedium volledig en afwassen tweemaal met PBS. </li><li> Trypsinize pADSC met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 min, en vervolgens neutraliseren met 1 ml kweekmedium. Verzamelen, tellen pas pADSC in 15 ml conische buizen met een dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen per buis. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. </li><li> Na centrifugatie bij 400 xg gedurende 7 minuten, verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en voeg 1 ml van chondrocyten inductie medium in een 15 ml buis. De buis wordt teruggegeven aan de 37 ° C incubator. Dit is de dag nul van differentiatie. </li><li> Vervang de chondrocyten inductiemedium drie dagen zonder het verwijderen van cellen op de bodem. Rijpe chondrocyten zal vormen ongeveer 14 dagen. Deze chondrocyten zijn klaar voor Toluidine Blue O kleuring. </li></ol></li></ol></li></ol> 6. kleuring van gedifferentieerde adipocyten Osteocytes en chondrocyten <ol><li> Oil Red O kleuring voor gedifferentieerde adipocyten <ol><li> Op dag 9, verwijderen vetcellen onderhoud medium in 6-putjes met gedifferentieerde adipocyten en was daarna de plaat tweemaal met PBS. [In de volgende stappen, voeg genoeg aangewezen reagentia aan elk putje van de 6-well plaat bedekken.] </li><li> Fix adipocyten met 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten. </li><li> Verwijder de 10% formaline oplossing en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. </li><li> Na twee wasbeurten, voeg 100% propyleenglycol in de petrischaal en laat gedurende 1 minuut. </li><li> Verwijder de 100% propyleenglycol en voeg Oil Red O-oplossing (0,5% in propyleenglycol) in de petrischaal. Laat staan ​​gedurende ten minste 10 minuten op een shaker rocker zacht schudden (100 rpm). </li><li> Verwijder de Oil Red O-oplossing en vervolgens te vervangen door 60% propyleenglycol. Laat staan ​​voor 1 min. </li><li> Verwijder de 60% propyleenglycol en was daarna de plaat tweemaal met double gedestilleerd water. </li><li> Vervang met 10% formaline-oplossing. De gebrandschilderde vetdruppels binnenkant van adipocyten zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie. </li><li> Kwantificering van intracellulaire Oil Red O (hieronder optionele stappen): na microscopische observatie, verwijderen 10% formaline-oplossing en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. </li><li> volledig Tap de plaat en voeg 500 ul van isopropanol aan de 6-wells plaat. </li><li> Isopropanol laat staan ​​in de 6-well plaat op een zachte rocker schudapparaat (100 rpm) gedurende ten minste 10 min aan de kleurstof met Oil Red O. oplossen </li><li> Zuig het isopropanol dat Oil Red O en verspreiden op een 96-wells plaat. Kwantificeren van de gewonnen olie rode O met behulp van een spectrofotometrische aflezing bij 510 nm. </li></ol></li><li> Alizarinerood S kleuring voor gedifferentieerde osteocyten <ol><li> Op dag 14, verwijder osteocyten inductiemedium van 6-well platen met gedifferentieerde osteocyten en was de platen tweemaal met PBS. [In de following stap, voeg genoeg aangewezen reagentia aan elk putje van de 6-well plaat bedekken.] </li><li> Fix osteocyten in 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten. </li><li> Verwijder de 10% formaline-oplossing uit elk putje en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. </li><li> Na twee wasbeurten, voeg 2% Alizarin Red S oplossing (pH = 4,1-4,3) bij de 6-well plaat en laat gedurende tenminste 15 minuten op een zachte rocker schudapparaat (100 rpm). </li><li> Verwijder de alizarinerood S oplossing en was daarna de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. </li><li> Vervang met 10% formaline-oplossing. Osteocyten zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie. </li></ol></li><li> Toluïdine blauw O kleuring gedifferentieerde chondrocyten <ol><li> Op dag 14, zuig chondrocyten inductiemedium van de 15 ml conische buis zonder het verwijderen van sedimenten van gedifferentieerde chondrocyten in de bodem van de buis en was het buisje tweemaal met PBS. [In de volgende stappen, voeg genoeg aangewezen reagentia cover chondrocyten in de bodem van de buis of het gedeelte dia.] </li><li> Fix chondrocyten in 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten. </li><li> Verwijder de 10% formaline-oplossing uit elke buis en was het buisje tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. </li><li> Na twee wasbeurten, pellets insluiten in OCT verbinding en gedeelte met een cryostaat met een dikte van 5 urn. </li><li> Vlekken op de schuif van de cryostaat secties met Toluidine Blue O-oplossing (0,1% bij pH 4,1). </li><li> Verwijder toluïdineblauw O-oplossing en was daarna de sectie tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. Opmerking: Chondrocyten op dia&#39;s zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Problem+of+Establishing+Relationships+between+Hepatic+Steatosis+and+Hepatic+Insulin+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance.</a> Cell Metab. 15, 570-573 (2012).</li>
<li>Taubes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+research.+Unraveling+the+obesity-cancer+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection.</a> Science. 335 (28), 30-32 (2012).</li>
<li>Apovian, C. M., Gokce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Obesity and cardiovascular disease.</a> Circulation. 125, 1178-1182 (2012).</li>
<li>Glass, C. K., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+lipid+signaling+in+the+etiology+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance.</a> Cell Metab. 15, 635-645 (2012).</li>
<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+as+regulators+of+energy+balance+and+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis.</a> Nature. 444, 847-853 (2006).</li>
<li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+adipocyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Differentiation+of+Stromal+Vascular+Cells+to+Beige%2FBrite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Hsu, J. M., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+expression+of+transcription+factor+adipocyte+determination+and+differentiation-dependent+factor+1+and+of+lipogenic+and+fatty+acid+oxidation+enzymes+in+porcine+differentiating+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes.</a> Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).</li>
<li>Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+dietary+docosahexaenoic+acid+on+the+expression+of+porcine+lipid+metabolism-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes.</a> J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).</li>
<li>Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+docosahexaenoic+acid+and+arachidonic+acid+on+the+expression+of+adipocyte+determination+and+differentiation-dependent+factor+1+in+differentiating+porcine+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes.</a> J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).</li>
<li>Ou, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsaturated+fatty+acids+inhibit+transcription+of+the+sterol+regulatory+element-binding+protein-1c+%28SREBP-1c%29+gene+by+antagonizing+ligand-dependent+activation+of+the+LXR%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR.</a> P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).</li>
<li>Sekiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+ameliorate+hepatic+steatosis+in+obese+mice+by+SREBP-1+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression.</a> Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).</li>
<li>Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+regulatory+element+binding+protein-1+expression+is+suppressed+by+dietary+polyunsaturated+fatty+acids+-+A+mechanism+for+the+coordinate+suppression+of+lipogenic+genes+by+polyunsaturated+fats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats.</a> J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).</li>
<li>Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugated+linoleic+acid+increases+the+differentiation+of+porcine+adipocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Res%22%5BJournal%5D)">Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro.</a> Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).</li>
<li>Ding, S., Mersmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+modulate+porcine+adipocyte+differentiation+and+transcripts+for+transcription+factors+and+adipocyte-characteristic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins.</a> J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).</li>
<li>Liu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A+induces+lipolysis+by+downregulating+perilipin+through+ERK1%2F2+and+PKA+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways.</a> Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosahexaenoic+acid+suppresses+the+expression+of+FoxO+and+its+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes.</a> J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+glucose+and+lipid+metabolism+by+porcine+adiponectin+receptor+1-transgenic+mesenchymal+stromal+cells+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice.</a> Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).</li>
<li>Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+anatomic+and+age+effects+on+cell+function+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells.</a> Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).</li>
<li>Efimenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+From+Aged+Patients+With+Coronary+Artery+Disease+Keep+Mesenchymal+Stromal+Cell+Properties+but+Exhibit+Characteristics+of+Aging+and+Have+Impaired+Angiogenic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential.</a> Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).</li>
<li>Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+age+on+the+differentiation+of+porcine+adipose+stromal-vascular+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture.</a> J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).</li>
<li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Adipose-Derived+Stem+Cells+as+a+Novel+Tool+for+Future+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine.</a> Stem Cells. 30, 804-810 (2012).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cir+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).</li>
<li>Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+Stem+Cells%3A+Current+Findings+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives.</a> Discov Med. 57, 160-170 (2011).</li>
<li>Baer, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-Derived+Stem+Cells+and+Their+Potential+to+Differentiate+into+the+Epithelial+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage.</a> Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).</li>
<li>Kakudo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+regenerative+cell+%28ADRC%29enriched+fat+grafting%3A+optimal+cell+concentration+and+effects+on+grafted+fat+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics.</a> J Transl Med. 11, (2013).</li>
<li>Lunney, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+swine+biomedical+model+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in swine biomedical model genomics.</a> Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).</li>
<li>Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Pig+Models+for+Human+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anim+Biosci%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases.</a> Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).</li>
<li>Vodicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miniature+pig+as+an+animal+model+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Ny+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The miniature pig as an animal model in biomedical research.</a> Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).</li>
<li>Wolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Potential+of+Adipose+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).</li>
<li>Cignarelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+stem+cells%3A+relevance+in+the+pathophysiology+of+obesity+and+metabolic+diseases+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications.</a> Expert Rev Mol Med. 14, (2012).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells%3A+the+great+WAT+hope%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells: the great WAT hope.</a> Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).</li>
<li>Banas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells+as+a+source+of+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes.</a> Hepatology. 46, 219-228 (2007).</li>
<li>Bruckner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fat+option+for+the+pig%3A+hepatocytic+differentiated+mesenchymal+stem+cells+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research.</a> Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).</li>
<li>Anghileri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Differentiation+Potential+of+Human+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).</li>
<li>Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-like+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells+from+infant+piglets+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Spinal+Cord+Med%22%5BJournal%5D)">Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro.</a> J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van vetweefsel in primaire celcultuur van pADSC bestuderen. Vergeleken met andere geïmmortaliseerde cellijnen, deze methode een handige manier om grote hoeveelheden hoogwaardige volwassen mesenchymale stamcellen die kunnen worden toegepast om differentiatie van adipocyten processen of andere mesenchymale lijnen verband met de ontwikkeling dier in vivo te bestuderen isoleren. De kritische stap in deze gemodificeerde protocol die worden verkregen pADSC met een 7- tot 9 dagen oude biggen omdat het gemakkelijk is om de kleine biggen handgreep ten opzichte van oudere varkens en vergelijkbaar met andere soorten 19,20, de opbrengst en multipotent van pADSC afneemt naarmate het varken leeftijden 21. Potentiële stamcel bronnen zijn embryonale stamcellen (ESC), geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), en postnatale volwassen stamcellen. De beperking van ADSC, geclassificeerd als volwassen multipotente stamcellen, is dat multipotent van volwassen stamcellenin het onderscheiden van uiteenlopende lijnen is relatief beperkt in vergelijking met ESC of iPSC. Echter, ethische kwesties met betrekking tot afleiding van ESC en oncogene eigenschappen van iPSC beperken de toepassing van ESC en iPSC 22,23. Daarom hebben veel onderzoekers gericht op volwassen stamcellen met inspanningen om pluripotentie verbeteren. De meest voorkomende bron van volwassen mesenchymale stamcellen (MSC), die al lange tijd onderzocht, is beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen 24. Echter, het oogsten beenmerg beschouwd als een relatief pijnlijke procedure. Een andere zorg is dat de opbrengst aan stamcellen uit het beenmerg eindig. Beenmergaspiraten verkregen gemiddeld 6 x 10 6 kernhoudende cellen per ml en MSC vertegenwoordigen slechts 0,001-0,01% van alle kernhoudende cellen. Na bestudering van deze nadelen is voorgesteld ADSC als minder opvallend bron multipotente stamcellen 25,26 verkrijgen. Beperkingen op het gebruik van ADSC in regeneratietieve geneesmiddel afhankelijk, grotendeels over de mobiele opbrengst en kwaliteit. Daarom is de betekenis van het gebruik varkens ADSC isoleren dit protocol is een grote hoeveelheid hoge kwaliteit volwassen stamcellen verkregen. Het varken is een nuttig dier model die de mens als gevolg van de vergelijkbare orgel grootte en de vele fysiologische en biochemische overeenkomsten tussen de soorten 27-30. HADSC verwerven van commerciële bedrijven is duur en in veel gevallen zijn de cellen gemanipuleerd, passage of gecryopreserveerd. Het verwerven van menselijke klinische monsters is relatief moeilijk als gevolg van ethische kwesties en de productie van ADSC is beperkt. We leiden ongeveer 6 x 10 5 hADSC per g vet na collagenase spijsvertering. Met 100 g vrouwelijke borst vetweefsel (gemiddeld bemonstering), kan een totaal van 6 x 10 7 cellen worden geoogst. Met een individuele muis, de opbrengst nog beperkter. Een totaal van 1 x 10 6 cellen kunnen worden geoogst uit 0,4 g subcutane muis inguinal vetweefsel uit beide benen van een volwassene FVB muizen (6-8 weken oud). Echter in een individueel varken (7-9 dagen oud), een totaal van 2 x 10 8 cellen kunnen gemakkelijk worden geoogst uit 60 g onderhuidse vetweefsel verkregen uit het dorsale vet depot. De pADSC afgeleid in dit protocol hebben volledige mesenchymale-type multipotentie en passende mesenchymale stamcellen markers. Daarom pADSC een gunstig bron van grote hoeveelheden volwassen stamcellen te verkrijgen zonder verlies stamcel kwaliteit. De toepassing van pADSC is niet beperkt tot het ontcijferen adipocytdifferentiatie waaronder adipogenese en lipogenese. Onlangs hebben ADSC een populaire bron van stamcellen in het gebied van regeneratieve geneeskunde 22,31,32 worden. Vergeleken met andere stamcellen bronnen ADSC behouden een unieke voordeel dat gemakkelijk toegankelijk en overvloedig, en hun robuuste multipotent is aangetoond een veelbelovende bron voor celtherapie en weefsels zijn engineering 22,33,34. De goede bereikbaarheid van vetweefsel maakt ADSC één van de minst ingrijpende manieren om multipotente voorlopercellen te krijgen. Onlangs hebben we gedifferentieerd pADSC in glucose reagerende insuline uitscheidende clusters aangeeft dat pADSC niet beperkt tot mesenchymale differentiatie (ongepubliceerde gegevens). Anderen hebben ook aangetoond dat ADSC kan worden onderverdeeld in verschillende celtypen afkomstig uit andere kiemen lagen zoals endodermale hepatocyten (van hADSC 35 of pADSC 36) of ectodermale neuronen (van hADSC 37 of pADSC 38). Aldus zou pADSC worden gebruikt voor high-throughput screening van geneesmiddelen of biomateriaal door het richten cellen uiteenlopende differentiatieprocessen gewenste lineages verkregen. Daarom pADSC afgeleid in dit protocol hebben potentiële toepassing in stamceltherapie en weefseltransplantatie regeneratieve geneeskunde onderzoek.

Obesitas, aanwezig in ongeveer 30% van de bevolking in de Verenigde Staten, met een body mass index van meer dan 30, is uitgegroeid tot een overwegende wereldwijd fenomeen 1. Obesitas heeft de neiging te leiden tot complicaties zoals hart- en vaatziekten, diabetes type 2 en kanker 2-4. Daarom is het omgaan met obesitas is een belangrijke prioriteit. Obesitas manifesteert zich door enorme expansie van vetweefsel, en wordt toegeschreven aan overmatig eten en een sedentaire levensstijl in de moderne samenleving. Vandaar dat het ontcijferen van de transcriptionele regulatie van adipogenese en lipogenese kon houden beloven om de behandeling van obesitas of diabetes 5. De 3T3-L1, 3T3-F442A en andere muis adipogene cellijnen toegepast op adipogenese of lipogenese bestuderen bij de ontwikkeling van vetweefsel. Er zijn echter enkele verschillen in regulerende mechanismen tussen cellijnen in vitro en in vivo 6 dieren. Primaire vet-Derived stamcellen (ADSC) in de stromale-vasculaire cel fractie kan direct worden geïsoleerd van wit vetweefsel en geïnduceerd om te differentiëren. Differentiatie van ADSC tot adipocyten waarschijnlijk recapituleert het proces van adipogenese en lipogenese in vetweefsel ontwikkelen in vivo 7. Varkens zijn een geschikt diermodel voor het bestuderen van adipogenese en lipogenese in de ontwikkeling van vetweefsel. Onze eerdere studies varkens 8-10 tonen aan dat expressie van sterol-regulerende element bindende transcriptiefactor 1c (SREBP1c), een belangrijke transcriptiefactor bekend lipogene transcriptie van vetzuursynthese te moduleren, wordt geremd door polyonverzadigde vetzuren (PUFA) in de varkenslever en vetweefsel. De expressie van varkens SREBP1c daalde PUFA in vivo en in vitro is vergelijkbaar met andere soorten, zoals mensen en muizen 11-13. Deze varkens studies in vitro zijn voornamelijk in differentiated adipocyten afgeleid van varkens ADSC (pADSC). Daarom kan deze primaire celkweek van pADSC worden gebruikt als betrouwbare cellulair systeem vetweefsel ontwikkeling worden stamceltoepassingen bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-033-1</td><td>Voor antibiotica en antischimmelmiddelen</td></tr><tr><td>&alpha;MEM, no nucleosides&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>CD4a-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700063</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700398</td><td></td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700467</td><td></td></tr><tr><td>CD44-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700183</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700483</td><td></td></tr><tr><td>CD90-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700686</td><td></td></tr><tr><td>HLA Class I-PE (MHC I)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700640</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR-PE (MHC II)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700662</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2036</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman</td><td>71740</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>2-Phospho-L-ascorbic acid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 Recombinant Human Protein&nbsp;</td><td>R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>240-B-002</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel Blades</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C18</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 &micro;m cell strainer</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-well plate</td><td>Corning&nbsp;</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm&nbsp; dish</td><td>Corning&nbsp;</td><td>353003</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit porcine onderhuids vetweefsel

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesitas is een ongebreidelde wereldwijde epidemie. Het ontrafelen van moleculaire controles in de ontwikkeling van vetweefsel biedt belofte voor de behandeling van obesitas of diabetes. Hoewel er talrijke geïmmortaliseerde adipogeene cellijnen zijn opgesteld, bieden vetafgeleide stamcellen uit de stromale vasculaire fractie van subcutaan wit vetweefsel een betrouwbaar cellulair systeem ex vivo dat veel dichter bij de ontwikkeling van vetweefsel in vivo ligt. Varkens-vetafgeleide stamcellen (pADSC) worden geïsoleerd uit 7- tot 9-daagse biggen. Het dorsale witte vetdepot van porciene subcutane vetweefsels wordt gesneden, gehakt en gedigesteerd met collagenase. Deze pADSC vertonen een sterk potentieel om zich te differentiëren in adipocyten. Bovendien bezitten de pADSC ook multipotentie, beoordeeld door selectieve stamcelmarkers, om zich te differentiëren in verschillende mesotheliële celtypen, inclusief adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Deze pADSC kunnen worden gebruikt voor de verduidelijking van moleculaire schakelaars bij het reguleren van klassieke adipocytendifferentiatie of in de richting van andere mesotheliële celtypen van mesodermale oorsprong. Bovendien zijn recent uitgebreide lijnen naar cellen van ectoderm en endoderm bereikt. Daarom bieden pADSC, afgeleid in dit protocol, een overvloedige en evalueerbare bron van volwassen mesotheliële stamcellen met volledige multipotentie voor het bestuderen van vetweefsontwikkeling en toepassing in weefsel engineering van regeneratieve geneeskunde.

De pADSC afgeleid van varken dorsale subcutane vet werden gezaaid op de kweekplaten of schotels en figuur 2. De morfologie van de pADSC afgeleid van de stromale-vasculaire fractie vergelijkbare muizen- of menselijke ADSC. Vierentwintig uur na het zaaien worden subconfluente pADSC gehecht en een uitgebreide fibroblastachtige morfologie (figuur 2A). De pADSC zal confluent worden binnen 72 uur en zijn klaar voor adipocyten of andere mesenchymale-type differentiatie (figuur 2B). pADSC sterke adipogenic potentieel vertonen na chemische inductie en mature adipocyten kunnen worden waargenomen na 9 dagen van differentiatie meer dan 90% van de pADSCs tonen adipogene differentiatie (figuur 2C). De kenmerken van pADSC verkregen in dit protocol te pakken, werden oppervlaktemerkers van pADSC beoordeeld door flowcytometrie analetion. Zoals getoond in figuur 3, oppervlaktemerkers van mesenchymale stamcellen, waaronder CD29, CD44, CD90 en MHC I (of HLA I) werden sterk tot expressie. Negatieve oppervlaktemerkers, zoals CD4a, CD31, CD45 en MHC II (of HLA II) waren nauwelijks detecteerbaar in pADSC verkregen in het protocol (figuur 3). Deze resultaten demonstreren dat deze pADSC vertonen mesenchymale stamcel-type eigenschappen zonder significante endotheliale of hematopoëtische stamcellen verontreiniging, waaronder myeloïde of lymfoïde progenitorcellen. Om verder te bevestigen dat pADSC vertegenwoordigen mesenchymale stamcellen, de multipotent van pADSC werd onderzocht door differentiatie in adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Deze adipocyten, chondrocyten en osteocyten werden gekleurd met specifieke kleurstoffen, Oil Red O, alizarine rood S en Toluidine Blue O, respectievelijk (figuur 4). Deze gegevens geven aan dat dit protocol gegenereerd pADSC dat mu behoudenltipotency met volledige kenmerken lijken op mesenchymale-type voorlopers. <img alt="figuur 2" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig2.jpg" /> Figuur 2. Morfologie van pADSC van varkens terug vet regio. (A) Subconfluente pADSC aangehouden en uitgebreid na 24-h zaaien op een 6-well cultuur plaat. (B) pADSC werd confluent 72e-h zaaien op een 6-well cultuur plaat. (C) mature adipocyten werden na 9 dagen van adipogene differentiatie van pADSC. Beelden werden genomen op 100 x vergroting met behulp van fase contrast microscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig3.jpg" /> Figuur 3. Identificatie van stamcellenoppervlaktemerkers voor pADSC. 1 x 10 5 van pADSC werden gereageerd met specifieke antilichamen en geanalyseerd op stamcel markers door flowcytometrie analyse. De getallen geven het percentage gekleurde cellen in de populatie (rood) ten opzichte van de ongekleurde control. De x-as geeft de relatieve fluorescentie-intensiteit. De y-as geeft de populatie van cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig4.jpg" /> Figuur 4. Multipotent differentiatie van pADSC. Multipotent van pADSC werd bepaald door differentiëren pADSC in (A) adipocyten, (B) osteocyten (C) en gekleurd door chondrocyten representatieve kleurstoffen, Oil Red O, alizarine rood S en Toluidine Blue O respectievelijk . ImaGES werden genomen bij (A) 100 x (B) x 200, en (C) 100 x vergroting met behulp van fase-contrast microscopie, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft de isolatie van varkens-vetafkomstige stamcellen (pADSC) uit subcutaan vetweefsel met onderzoek van multipotentie. De multipotente pADSC worden gebruikt om processen van adipocytendifferentiatie te bepalen en transdifferentiatie in meerdere cellijnen van mesodermaal mesenchym of verdere lijnen van ectoderm en endoderm te bestuderen voor regeneratieve onderzoeken.

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van uit vet afgeleide stamcellen uit subcutaan wit vetweefsel van varkens om hun vermogen om te differentiëren in mesenchymale adipocyten, osteocyten en chondrocyten te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen obesitasonderzoek. Het is een waardevol instrument om het moleculaire mechanisme te ontrafelen dat betrokken is bij de regulatie van de ontwikkeling van vetweefsel.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een grote hoeveelheid stromovasculaire cellen kan worden geoogst, wat een diepgaande analyse van adipocytdifferentiatie en biologie mogelijk maakt. De implicatie van deze techniek is relevant voor onderzoek naar stamceltherapie, aangezien uit vetweefsel afgeleide stamcellen van varkens multipotentie vertonen voor transdifferentiatie naar meerdere cellijnen. Begin met het plaatsen van het biggetje in buikligging op een schone operatietafel.Scher all het haar langs de middellijn af van de nek tot de staart en schrob de dorsale huid drie keer met 7,5% Povidonjodium. Laat na de derde beurt het jodium ongeveer 10 minuten op het huidoppervlak inwerken. Spray vervolgens de huid in met 70% ethanol.Gebruik vervolgens met ethanol doordrenkte gaasjes om de huid in één richting af te vegen om het desinfectiemiddel te verwijderen totdat er geen duidelijke kleur meer zichtbaar is. Maak daarna een incisie vanaf de nekstreek naar beneden richting het poot. Scheid vervolgens, terwijl het vet en de huid met een pincet worden vastgehouden, met een scalpel de porcine dorsale vetlaag van subcutaan adipose weefsels en de aangrenzende huidlaag van de spieren.Dompel de huid- en vetweefsel direct onder in een gesteriliseerd bekerglas van 200 ml met serumvrij DMEM bij 37 °C en bespuit de buitenkant van het bekerglas met 70% ethanol. Plaats het bekerglas vervolgens in een laminaire flow-celkweekkap en leg een gesteriliseerde, drielaagse folieafdekking van 40 bij 30 cm naast het bekerglas. Draag het weefsel over naar de folie, met de huidzijde naar beneden.Gebruik een pincet en een schaar om het resterende spierweefsel van het vetweefsel te verwijderen. Snijd het vet in vierkante stukken van 7 bij 7 centimeter en breng de vetstukken vervolgens over in een nieuw gesteriliseerd bekerglas van 200 milliliter met serumvrij DMEM van 37 °C. Plaats nu een aangepaste plakhouder, uitgerust met een snijblad van koolstofstaal, op de afdekfolie en leg een van de vetstukken op de snijder met de vetlaag naar beneden.Snijd het vet in stukjes van ongeveer 1 millimeter dik, zo dicht mogelijk bij de huid, maar zonder deze door te snijden. Gebruik vervolgens een schaar om de stukjes vetweefsel zo fijn mogelijk te vermalen en voeg de stukjes toe aan een Erlenmeyerkolf van 250 milliliter met gefilterd digestiemedium aangevuld met collagenase. Incubeer de kolf met draaibewegingen gedurende 90 minuten bij 45 RPM in een orbitale schudmachine bij 37 graden Celsius.Wanneer het digestiemedium een suspensie wordt, zonder significante weefselklonten, wordt de digestie stopgezet met een gelijk volume kweekmedium bestaande uit DMEM F-12 met 10% FBS. Om de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van varkens te verzamelen, wordt de gedigesteerde suspensie van vetweefsel door een enkele laag chiffon in een gesteriliseerde serologische fles van 250 milliliter gefilterd, waarbij een pincet wordt gebruikt om het midden van de chiffon in te drukken om de passage van het digestaat te geleiden en te bevorderen. De chiffon wordt met het pincet leeggedrukt en getordeerd om de passage te voltooien, waarna het medium wordt verdeeld over vier conische centrifugebuizen van 50 milliliter.Verzamel de stroma-vasculaire cellen door middel van centrifugatie. Schenk vervolgens het supernatant af zonder de pellets te verstoren, om het grootste deel van de bovenste vetlaag met de rijpe adipocyten te verwijderen. Resuspendeer de pellets daarna in 10 milliliters DMEM door middel van pipetteren en voorzichtig schudden.Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer de pellets in 10 milliliters ACK-lysisbuffer. Stop na zeven minuten bij kamertemperatuur de lysis van de rode bloedcellen door 10 milliliters DMEM aan elke buis toe te voegen en de buizen voorzichtig te schudden om te mengen. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw.Was de cellen nog twee keer met 10 milliliter DMEM en breng vervolgens de supernatant via een zeef van 100 micron samen in één conische buis van 50 milliliter. Pipetteer de cel-suspensie voorzichtig enkele keren om de cellen gelijkmatig te verdelen en tel de cellen middels Trypan Blue-uitsluiting. Zaai tenslotte de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken in een passende kweekcontainer in celkweekmedium met een dichtheid van 6 × 10⁴ per vierkante centimeter.Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 om de vorming van een monolaag te faciliteren. De morfologie van de uit de stroma-vasculaire fractie verkregen varkensadipose-afgeleide stamcellen is vergelijkbaar met die van muizen- of menselijke adipose-afgeleide stamcellen, waarbij 24 uur na het uitplaten een uitgebreide glasvezelachtige morfologie wordt waargenomen. De varkensadipose-afgeleide stamcellen worden binnen 72 uur confluent, waarna ze klaar zijn voor differentiatie tot adipocyten of andere mesenchymale typen.Deze cellen vertonen daarnaast een sterk adipogeen potentieel na chemische inductie en rijpe adipocyten kunnen worden waargenomen na negen dagen differentiatie, waarbij meer dan 90% van de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken adipogene differentiatie vertoont. Oppervlaktemerkers voor mesenchymale stamcellen, waaronder CD 29, CD 44, CD 90 en MHC 1, worden sterk tot expressie gebracht in de uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken, terwijl CD 4a, CD 31, CD 45 en MHC II nauwelijks detecteerbaar zijn, wat aantoont dat deze uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken kenmerken van het mesenchymale type vertonen zonder significante contaminatie door endotheelcellen of hematopoëtische stamcellen. Bovendien kunnen de gedifferentieerde uit vetweefsel afgeleide stamcellen van het varken worden geïdentificeerd als adipocyten, osteocyten of chondrocyten door middel van specifieke weefselkleuringen, wat bewijst dat deze uit de stroma-vasculaire fractie afgeleide cellen een multipotentie behouden die typisch is voor progenitoren van het mesenchymale type.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een goede aseptische techniek voor celkweek toe te passen en alle stappen zo snel mogelijk uit te voeren om de levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren. Zodra de techniek beheerst is, kunnen de cellen in zes uur uit twee tot drie varkens worden geoogst, mits de techniek correct wordt uitgevoerd.Deze standaardtechniek baande de weg voor obesitasonderzoekers in het veld van diabetes om moleculaire schakelaars te verkennen, zoals transcriptiefactoren die de differentiatie van adipocyten beheersen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u mesenchymale stamcellen uit varkensvetweefsel kunt isoleren en hoe u het vermogen van deze cellen kunt evalueren om te differentiëren tot adipocyten, osteocyten en chondrocyten.

isolation-differentiation-adipose-derived-stem-cells-from-porcine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates a technique for isolating and culturing fluorescently labeled neural crest-derived adipose-derived stem cells (ADSCs) from murine periaortic arch adipose tissue. Following isolation, the NCADSCs are detected, sorted using fluorescence-activated cell sorting, and subsequently cultured on a plate, promoting cell proliferation.

Isolating Adipose-Derived Stem Cells from Murine Periaortic Adipose Tissue

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

In dit artikel beschrijven we isolatie van van resusapen afgeleide vetweefsel-afgeleide stamcellen (ADSC's) met behulp van een enzymatisch weefselverteringsprotocol. Vervolgens beschrijven we ADSC-proliferatie, waaronder celonthechting, tellen en plating. Ten slotte wordt ADSC-differentiatie beschreven met behulp van specifieke adipogene inducerende middelen. Daarnaast beschrijven we kleuringstechnieken om differentiatie te bevestigen.

Isolatie, proliferatie en differentiatie van rhesus makaken vet-afgeleide stamcellen

We presenteren een methode van celinjectie via naaldvrije waterstraaltechnologie in combinatie met een vervolg op onderzoeken na toediening in termen van cellulaire levensvatbaarheid, proliferatie en elasticiteitsmetingen.

Injectie van van varkensweefsel afgeleide stromacellen via waterstraaltechnologie

Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen een potentiële bron zijn van MSC's die differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's). In dit protocol bieden we gedetailleerde stappen voor de isolatie en karakterisering van epididymale Ad-MSC's bij ratten, gevolgd door een eenvoudig, kort protocol voor het genereren van IPC's van dezelfde rat Ad-MSC's.

Isolatie van rat vetweefsel Mesenchymale stamcellen voor differentiatie in insulineproducerende cellen

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier beschrijven we de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, waardoor de perivasculaire vetweefselfunctie en de relatie met vasculaire cellen kunnen worden bestudeerd.

Isolatie, kweek en adipogene inductie van van stromale vasculaire fractie afgeleide preadipocyten uit periiaorta-vetweefsel van muizen

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer de isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit varkens voor regeneratieve geneeskunde. Dit protocol toont collagenase-vertering en differentiatie naar adipocyten, osteocyten en chondrocyten met hoge efficiëntie.

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Meer video's verkennen