Name: Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1 hoog-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer immunomagnetische scheiding van Sca1-hoge vetcel-afgeleide stamcellen uit muizenweefsel met behulp van collageenase-vertering. Deze methode optimaliseert celopbrengst voor regeneratieve geneeskunde-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH DK095137 (THC). Wij danken de huidige en voormalige lab-leden die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling en verfijning van de beschreven methoden.

Ethiek Verklaring: De Universiteit van Michigan Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) heeft alle methoden en protocollen in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council) goedgekeurd. Muizen worden gehandhaafd in een universiteit van Michigan terrarium en krijgen gratis toegang tot voedsel en water en gehouden op een 12 uur donker / licht cyclus. 1. Voorbereidingen <ol><li> Bereid primaire kweek medium met DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G en 1x antibiotica / antimycotica. Dit wordt gebruikt om weefsels vóór vertering houden. Plaats voorraad en hoeveelheid in 37 ° C waterbad. </li><li> Bereid vijf milliliter Type III collagenase oplossing bij 5 mg / ml opgelost in HBSS (+ Ca, Mg +) voor elk van vetkussentje afgezonderd, tot vijf muizen. Wanneer bijvoorbeeld het isoleren en SQ VIS uit één genotype, maakt 10 ml, wanneer wild-type en mutant SQ en VIS, maken 20 ml. De pH instellen op 7,4 en steRILE filter. Aliquot in 50 ml buizen. Zet opzij de buurt van licht. </li><li> Gebruik 70% ethanol om chirurgische veld te desinfecteren. Veeg naar beneden en dek af met een blauwe pad. Spuit wat ethanol op de blauwe pad. </li><li> Gebruik de 22 G naalden vast te pinnen een absorberende pad om de piepschuim bord en trim met een schaar. Spuit de pad met ethanol en stel het bord op de blauwe pad en dek af met een ander blauwe pad tot aan het begin van dissectie. </li><li> Vul twee 50 ml buisjes met ethanol en in een stand nabij het operatiegebied. Leg de schaar en pincet in de ethanol. </li><li> Vul een 50 ml buis met PBS plus 1 x anti-anti te spoelen ethanol uit chirurgische instrumenten. </li><li> In de kap, etiket 60 mm schalen voor elk weefseltype en vul met cultuurmedia verwarmd tot 37 ° C. Plaats de platen naast het operatiegebied. </li></ol> 2. Isolatie van subcutane (SQ) vetkussentjes <ol><li> Euthanaseren muis met een overdosis van isofluraan en pneumothorax. </li><li> Voorzichtigspuiten muis met 70% ethanol en leg liggende. Speld de poten om het schuim bord met 22 G naalden. </li><li> Maak een kleine snede in de huid van de onderbuik. Die de top van de snede met de tang, neem de schaar en scheiden de huid van peritoneum. </li><li> Nadat de huid is gescheiden van het peritoneum van de buik om de thorax, weerspiegelen de huid van het peritoneum naar het hoofd door zijdelingse sneden in de huid aan de zijkant van het lichaam. </li><li> Afspiegeling van de resterende huid die de lies vet weg van het lichaam en het vastpinnen op het bord met 22 G naalden. </li><li> Overschakelen naar fijne schaar en pincet. Pak de lies vet pad met de tang aan de oorsprong in de buurt van het buikvlies en knip weg tussen de huid en lies vet op weg zijn naar de lies te vermijden besmetting van de SQ met de huid. </li><li> Plaats de insolated lies vet pad in de gelabelde 60 mm gerecht. </li></ol> 3. Isolatie van Visceral (VIS) vetkussentjes <ol><li> Op soortgelijke wijze als stap 2,5, snijd het peritoneum open naar de viscerale vetkussentjes en darm bloot. </li><li> Beweeg de darm weg in de richting van de thorax. </li><li> Pak de VIS vet pad aan het uiteinde en voorzichtig omhoog te trekken. Ontleden de VIS vet pad terwijl ze voorzichtig om epididymis uit te sluiten (of de baarmoeder, bij gebruik van vrouwelijke muizen) weefsel. </li><li> Plaats in geëtiketteerde schaal en herhaal stap 3.3 voor de resterende VIS pad. </li></ol> 4. Collagenase vetvertering Pads <ol><li> Verplaats 60 mm schalen in de weefselkweek kap en zuig af media. </li><li> Hak de vetkussentjes met gebogen schaar vervolgens toe te voegen aan collagenase oplossing. Zorg ervoor dat de schaar en pincet in spoel tussen weefseltypes met ethanol en PBS. </li><li> Schudden bij 300 rpm en 37 ° C gedurende 10-20 min tot weefsel verteerd. Het is aanvaardbaar als sommige stukken van SQ zijn nog steeds zichtbaar. Dit zal in een latere stap worden aangepakt. </li><li> Voeg 25 ml kweekmedia de collagenase oplossing voor het stoppen collagENase behandeling en pipet op en neer 10 keer met een 10 ml serologische pipet om de verteerde weefsels verspreiden. </li><li> Stam cellen onder toepassing van een 100 um zeef cel. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. </li><li> decanteer voorzichtig van media niet de pellet te verstoren en voeg 5 ml steriel water om de pellet voorzichtig pipet cellen opschorten. Wacht 2 min aan erytrocyten te lyseren. </li><li> Voeg 25 ml medium met 10% FBS en stam cellen door een nieuw 100 um zeef cel. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Giet media en resuspendeer pellet in 1 ml van de cultuur media. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer gebruikt 1: 1 trypan blue. </li><li> Plaat 1 x 10 6 cellen in één putje op 6-wells plaat. </li></ol> 5. magnetische celscheiding <ol><li> Na ongeveer 4-6 uur van celadhesie Spoel de cellen tweemaal met HBSS (-Ca, Mg). Distantiëren hechtende cellen met behulp 0,05% trypsine. Verdun trypsine cel suspensie in 1 ml scheiding buffer en draaien voor5 min bij 300 x g. </li><li> Zuig supernatant. Resuspendeer cellen in 500 pi buffer. Verwijderen van een 10 pi aliquot en cellen te tellen met een hemocytometer. </li><li> Spin cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. </li><li> Zuig supernatant volledig. Resuspendeer cellen in 90 ul buffer. Voeg 10 ul anti-SCA1-FITC primair antilichaam. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was de cellen met 1 ml buffer en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder supernatant volledig. </li><li> Resuspendeer cellen in 80 ul buffer. Voeg 20 ul anti-FITC microbolletjes. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was de cellen met 1 ml buffer en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 500 ui buffer. </li><li> Plaats de kolom in de magnetische houder en spoel de kolom met 500 pi buffer. </li><li> Voeg celsuspensie naar kolom. Vermijd het bellen tijdens het pipetteren. </li><li> Verzamel de ongelabelde SCA1 - &lt;/ Sup&gt; cellen en waskolom 3 maal met 500 pi buffer. Alleen het toevoegen van nieuwe buffer als het reservoir leeg is. Vermijd het bellen tijdens het pipetteren. </li><li> Kolom verwijderen uit de magneethouder en plaats in een 15 ml conische buis. </li><li> Voeg 1 ml buffer kolom en elueer SCA1 + door op geleverde plunjer de kolom reservoir. </li><li> Spin down cel fracties gedurende 5 min bij 300 x g. Resuspendeer cellen in 1 ml kweekmedium. </li><li> Verwijderen 10 pi aliquot van het gemerkte en ongemerkte fracties en cellen te tellen met een hemocytometer. </li><li> Plate elke fractie cel in 1 put van een 6-wells plaat. </li></ol> 6. Keuring van Immunomagnetische Scheiding van SCA1 hoge ACSS met flowcytometrie <ol><li> Spoel de cellen tweemaal met HBSS (-Ca, Mg) en dissociëren cellen onder toepassing 0,05% trypsine. </li><li> Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min. Resuspendeer cellen in 1 ml kweekmedium en te tellen met een hemocytometer. </li><li> Verkrijgen van&gt; 10 6 </sup&gt; cellen in 1 ml kweekmedium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en herhaal stap 6.3 twee keer. </li><li> Resuspendeer cellen met 1 ml 2% geitenserum + 2% BSA en blokkeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min. </li><li> Verwijderen blokkeeroplossing. </li><li> of anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400): rat IgG2a Alexa Fluor 647 (400 0,25 g, 1) voeg, in 100 gl PBS met 2% geitenserum en 2% BSA + PBS bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker. </li><li> Voeg 1 ml koude PBS aan cellen. Centrifuge 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant en herhaal stap 6.9 twee keer. </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml PBS. Celsuspensies passeren door een 100 um zeef cel ter voorbereiding van flowcytometrische analyse. </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li>
<li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li>
<li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li>
<li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li>
<li>Welm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%28pos%29+cells+in+the+mouse+mammary+gland+represent+an+enriched+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population.</a> Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).</li>
<li>Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+fat%3A+tracking+obesity+to+its+source%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of fat: tracking obesity to its source.</a> Cell. 131 (2), 242-256 (2007).</li>
<li>Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322, 583-586 (2008).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ly-6A+%28Sca-1%29+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin tonen we de isolatie en immunomagnetische celscheiding van murine ASC&#39;s uit verschillende vetkussentjes en hun gebruik voor in vitro experimenten. De onderhavige methode is effectief voor de snelle isolatie van talrijke SCA1-positieve ASC, hetgeen voordelig via technisch complexe en dure FACS gemedieerde isolatie van ASC 9,14. Unlike FACS gaat immunomagnetische celscheiding niet het gebruik van meerdere antigeen voor de identificatie van een doelwit celpopulatie toelaten. Niettemin, als he...

Stamcel antigeen 1 (SCA1 of Ly6A / E) werd voor het eerst geïdentificeerd als een celoppervlak marker door hematopoietische en mesenchymale stamcellen 5,6 uitgedrukt. De stromale vasculaire fractie (SVF) van vetweefsel verkregen uit muizen vetdepots een heterogene populatie van cellen omvattende fibroblasten, macrofagen, vasculaire endotheelcellen, neuronale cellen, adipocyten en progenitorcellen 7. Adipocyten voorlopercellen of adipeus afgeleide stamcellen (ASC) zijn niet lipide beladen cellen die in het collageen-rijke perivasculaire extracellulaire matrix (ECM) 8 bevinden. Ongeveer 50% van de SVF uit ASC, die worden gekenmerkt als lineage-negatieve (Lin -) en CD29 +: CD34 +: SCA1 + 9. De meeste van deze cellen SCA1 +: CD24 - adipocyten stamcellen die in staat adipocytdifferentiatie in vitro; echter slechts een fractie van cellen (0,08% van SVF) vormt SCA1 <sup&gt; +: CD24 + cellen die volledig in staat prolifereren en differentiëren tot adipocyten bij de in vivo omstandigheden 9 zijn. Ondanks het potentieel nadeel van het gebruik SCA1 + SVF zonder discriminatie CD24 + cellen van CD24 - cellen isoleren SCA1 + ASC&#39;s uit vetdepots gebruik immunomagnetische celscheiding is een efficiënte en praktische benadering van de cel-autonome fenotype van primaire adipocyten progenitorcellen te bepalen. Op het gebied van obesitas en diabetes, weefsel fibrose en ontsteking spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en instandhouding van type 2 diabetes 3. Recentelijk Tokunaga et al. toonde aan dat SCA1 hoge cellen geïsoleerd uit de lies (of subcutane, SQ) en perigonadal (of viscerale, VIS) C57BL6 / J vet depots vertonen ander gen handtekeningen en ECM remodeling in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), een prototypisch lid van de membraan-tYpe matrix metalloproteinase (MMP) familie bemiddelt de ontwikkeling van wit vetweefsel (WAT) via haar collagenolytische activiteit 1. Voorbeelden van experimenten die kan worden uitgevoerd met de cellen geïsoleerd en verrijkt door de volgende protocol omvatten drie-dimensionale cultuur, differentiatie studies, collageen degradatie assays, en RNA-sequencing 10,11. Degradatie assays worden uitgevoerd met zuur geëxtraheerd collageen dienen om de telopeptide 11,12 waarborgen. Het volgende protocol zal de methoden aantonen primaire vasculaire stromale cellen te isoleren uit verschillende vetdepots en verrijken adipocyten progenitorcellen via immunomagnetische celscheiding. De geldigheid van de cel sortering zal worden beoordeeld met flowcytometrie en door het gebruik van SCA1-GFP muizen die GFP in SCA1 + cellen uit te drukken, aangedreven door een SCA1 promotor 13.

<table><tbody><tr><td>Type 3 Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004182</td><td>Weefseldigestie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Hoge-glucose kweekmedium</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Media antibioticum</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Media antischimmelmiddel</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-µm cell strainer</td></tr><tr><td>60 mm platen</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Scharen</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Groot</td></tr><tr><td>Scharen</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Fijn, gebogen punt</td></tr><tr><td>Grote pincetten</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Elke verkoper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8&rdquo; naalden</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1,5&rdquo; naalden</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buizen</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS-scheidingskolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 microbead-kit (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm;Ab en anti-FITC microbeads 2&ordm;Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS-loopbuffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS-scheider</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Blue chux-pads</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Absorbtiepads</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam-bord</td><td></td><td></td><td>Gebruik voor 50 ml buizen</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Elke verkoper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-muis Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-muis F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Rondbodembuis</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash;Ca, &ndash;Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Voor collagenase-oplossing</td></tr><tr><td>Type I collageen (2,7 mg/ml in 37mm azijnzuur</td><td>Bereid in huis12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0,34 N NaOH</td><td>Bereid in huis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 carbonzuur, succinimidylester, gemengde isomeren</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0,89 M NaHCO3&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

immunomagnetische scheiding van fat depot-specifieke sca1<sup&gt; hoog</sup&gt;-vetcellen afgeleide stamcellen (asc)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

De isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) is een belangrijke methode op het gebied van de biologie van vetweefsel, adipogenese en remodellering van de extracellulaire matrix (ECM). In vivo, biedt een ECM-rijke omgeving, bestaande uit fibrillaire collagenen, een structurele ondersteuning voor vetweefsel tijdens de progressie en regressie van obesitas. Fysiologische ECM-remodellering, gemedieerd door matrix metalloproteïnasen (MMP's), speelt een belangrijke rol bij het reguleren van de grootte en functie van vetweefsel1,2. Het verlies van fysiologische collagenolytische ECM-remodellering kan leiden tot overmatige collageenaccumulatie (weefselfibrose), macrofaag-infiltratie en uiteindelijk een verlies van metabolische homeostase, inclusief insulineresistentie3,4. Wanneer een fenotypische verandering van het vetweefsel wordt waargenomen in gen-gerichte muismodellen, is het isoleren van primaire ASC's uit vetdepots voor in vitro studies een effectieve aanpak om de rol van het specifieke gen in het reguleren van de functie van ASC's te definiëren. Hieronder definiëren we een immunomagnetische scheiding van Sca1high ASC's.

Verrijking van SCA1 hoge ASC uit verschillende vetkussentjes. De vasculaire stromale cellen geïsoleerd van SQ vet weergave fibroblast-achtige, uitgerekte cel vorm ongeacht SCA1 expressie (Figuur 1A). Aan de andere kant, VIS (eWAT-afgeleide) SCA1 hoog en SCA1 laag cellen aan te tonen duidelijk verschil in hun cel vorm. Net als SQ (iWAT-afgeleide) SCA1 hoge cellen, VIS...

We presenteren de technieken die nodig zijn om de stromale vasculaire fractie (SVF) te isoleren uit de inguinale (subcutane) en perigonale (viscerale) vetweefsel depots van muizen om hun genexpressie en collagenolytische activiteit te beoordelen. Deze methode omvat de verrijking van Sca1high vet-afgeleide stamcellen (ASCs) met behulp van immunomagnetische celscheiding.

Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1<sup&gt; hoog</sup&gt;-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van Sca1-positieve mesenchymale stamcellen uit verschillende vetdepots van de muis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het gebruik van immuunmagnetische beads-gebaseerde cel sortering, uit vetweefsel afgeleide stamcellen uit verschillende vetdepots effectief kunnen worden verrijkt voor opeenvolgende experimenten. Over het algemeen zullen onderzoekers die nieuw zijn met deze methode enige moeite hebben, omdat de sterkte en duur van de collagenase-gemedieerde weefseldigestie moeten worden geoptimaliseerd om een adequaat aantal cellen voor de sortering te verkrijgen.Om de subcutane vetkussentjes te isoleren, begint u met het plaatsen van de muis in rugligging op een schuimrubberen dissectiebord en het besproeien van het dier met 70% ethanol. Nadat de poten aan het bord zijn vastgezet, maakt u een kleine incisie in de huid van de onderbuik. Pak vervolgens de bovenkant van de snede vast met een pincet en gebruik een schaar om de huid en het peritoneum van de buik tot aan de thorax te scheiden.Maak laterale incisies in de huid, langs de zijkant van het lichaam, en klap de huid weg van het peritoneum in de richting van de kop. Trek vervolgens de resterende huid terug, terwijl het inguinale vet van het lichaam wordt weggehouden, en gebruik naalden van 22 gauge om de huid aan de plank vast te pinnen. Gebruik daarna de pincet om één inguinaal vetkussen vast te pakken bij de oorsprong nabij het peritoneum, en gebruik een fijne schaar om tussen de huid en het inguinale vet door te knippen in de richting van de lies, waarbij moet worden voorkomen dat het subcutane vetkussen besmet raakt met huid.Plaats vervolgens het geïsoleerde inguinale vetkussen in een met SQ gelabelde schaal van 60 millimeter met kweekmedium van 37 °C, en oogst op dezelfde wijze het inguinale vetkussen van de andere zijde van het dier. Om de viscerale vetkussens te isoleren, snijdt u het peritoneum open om de viscerale vetkussens en de darmen bloot te leggen. Verschuif vervolgens de darmen opzij, richting de thorax.Pak het viscerale vetkussen bij het distale uiteinde vast, trek het vetweefsel voorzichtig omhoog en dissekeer het weg, waarbij u er zorg voor draagt dat het epididymale weefsel wordt uitgesloten. Plaats het vetkussen vervolgens in een met VIS gelabelde schaal van 60 millimeter met kweekmedium van 37 °C. Wanneer alle vetkussens zijn verzameld, brengt u de schalen over naar een weefselkweekkast en aspireert u het medium.Gebruik gebogen scharen om de vetkussentjes fijn te knippen. Voeg de vetstukjes vervolgens toe aan individuele buisjes van 50 milliliter die vers bereid collagenase bevatten. Schud de buisjes daarna 10 tot 20 minuten bij 300 RPM en 37 graden Celsius, tot de weefsels zijn verteerd.Sommige stukjes subcutaan vetkussenweefsel kunnen nog steeds zichtbaar zijn. Voeg 20 milliliters kweekmedium toe aan de collagenase-oplossing om de digestie te stoppen en gebruik een serologische pipet van 10 milliliter om het weefselsuspensie 10 keer op te zuigen en te dispenseren om de gedigesteerde weefsels volledig te dissociëren. Filtreer de cellen door celzeven van 100 micron en centrifugeer de weefsels.Decanteer vervolgens voorzichtig het medium, waarbij u er op let dat de pellets niet worden verstoord, en resuspendeer beide celgroepen voorzichtig in vijf milliliters steriel water. Wacht twee minuten tot de erytrocyten zijn gelyseerd. Stop vervolgens de reactie in elke buis met 25 milliliters medium aangevuld met FBS.Filtreer beide adipocytpopulaties door nieuwe cellenzeven van 100 micron, centrifugeer ze opnieuw en resuspendeer de pellets vervolgens in één tot drie milliliter medium. Na het tellen middels trypaanblauw-uitsluiting, zaai je apart één keer tien tot de zesde subcutane vetkussencellen en viscerale cellen uit in individuele putjes van een zes-wells celkweekplaat. Verdun na het trypsiniseren van de cellen het trypsine met één milliliter scheidingsbuffer en centrifugeer vervolgens de kweekplaten.We suspenderen de cellen in 500 µL separatiebuffer per buis en centrifugeren de cellen opnieuw. Resuspendeer de cellen nu in 90 µL separatiebuffer per buis en voeg 10 µL anti-Sca1 FITC primair antilichaam toe aan de celsuspensie. Na 10 minuten incubatie bij 4 °C in het donker worden de cellen gewassen met 1 mL separatiebuffer per buis.Na het centrifugeren worden de cellen resuspendeerd in 80 µL scheidingsbuffer per celsuspensie. Meng vervolgens 20 µL Anti-FITC Microbeads in elke put en plaats de platen gedurende 15 minuten bij vier °C, beschermd tegen licht. Was na afloop van de incubatie de cellen in 1 mL scheidingsbuffer en resuspendeer de cellen in 500 µL verse buffer per buis.Plaats nu een kolom in de magnetische houder en spoel de kolom met 500 µL scheidingsbuffer. Breng de cellen vanuit de kweek van het subcutane vetkussenweefsel over op de kolom, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan, en verzamel de ongelabelde Sca1-negatieve cellen in een conische buis van 15 ml. Wanneer alle cellen door de kolom zijn gelopen, spoelt u de kolom drie keer met 500 µL scheidingsbuffer.Breng vervolgens de kolom van de magneet over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter en spoel één milliliter verse scheidingsbuffer door de kolom om de Sca1-positieve cellen te elueren. Centrifugeer tot slot zowel de Sca1-positieve als de Sca1-negatieve cellenfracties en resuspendeer de pellets in één milliliter kweekmedium. Tel vervolgens het aantal cellen in elke fractie en zaai de fracties uit in individuele wells van een nieuwe zes-well celkweekplaat.Vasculaire stromale cellen geïsoleerd uit subcutaan vet vertonen een fibroblast-achtige, uitgerekte celvorm, ongeacht hun niveau van Sca1-expressie. Net als Sca1-hoge cellen afgeleid van subcutaan inguinaal vet, vertonen Sca1-hoge cellen afgeleid van visceraal epididymaal vet een uitgerekte fibroblast-achtige celvorm. Terwijl VIS Sca1-lage cellen een epithelioïde vorm vertonen.Sca1-hoge cellen geïsoleerd uit Sca1-GFP-muizen zijn in weefselkweek eenvoudig te identificeren als GFP-positieve cellen. Wanneer deze cellen worden geanalyseerd via flowcytometrie, blijkt inderdaad dat de meeste GFP-positieve cellen Sca1-eiwitten op hun celoppervlak tot expressie brengen, zoals aangetoond met een anti-Sca1-antilichaam. In combinatie met real-time PCR-analyses kan de differentiële expressie van collagenolytische matrixmetalloproteïnasen tussen Sca1-hoge adipogene stamcellen afkomstig uit liesvet en epididymaal vet worden aangetoond.Verder, wanneer fluoresceïne-gelabelde type I collageengelaten worden gebruikt om de pericellulaire degradatieactiviteit te beoordelen, wordt een duidelijk verhoogde collageen-remodelleringsactiviteit waargenomen die wordt gemedieerd door viscerale Sca1 high adipogene stamcellen. Eenmaal beheerst, kan de isolatie van vetkussencellen in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een schoon en georganiseerd chirurgisch veld te behouden om een efficiënte isolatie van het vetkussen te waarborgen.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals een collageen-degradatieassay, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over weefselremodellering door vetafgeleide stamcellen te beantwoorden. Na de ontwikkeling hiervan maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van obesitas en matrixbiologie om de rol van vetafgeleide stamcellen bij de remodellering en functie van vetweefsel bij muizen en mensen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire Sca1-positieve cellen uit vetweefseldepots kunt verkrijgen en verrijken.

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates a technique for isolating and culturing fluorescently labeled neural crest-derived adipose-derived stem cells (ADSCs) from murine periaortic arch adipose tissue. Following isolation, the NCADSCs are detected, sorted using fluorescence-activated cell sorting, and subsequently cultured on a plate, promoting cell proliferation.

Isolating Adipose-Derived Stem Cells from Murine Periaortic Adipose Tissue

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methodologie voor ADSC-isolatie, wat resulteert in een enorme cellulaire opbrengst met tijdwinst in vergelijking met de literatuur. Deze studie biedt ook een eenvoudige methode voor het verkrijgen van een relatief groot aantal levensvatbare cellen na cryopreservatie op lange termijn.

Techniek voor het verkrijgen van mesenchymale stamcel uit vetweefsel en stromale vasculaire fractiekarakterisering bij cryopreservatie op lange termijn

Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.

Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Dit protocol beschrijft alle procedures, van het kweken van humane, van vet afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's) en het verzamelen van supernatans tot het extra-extracellulaire blaasjes (EV's) met behulp van ultracentrifugatie.

Zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane van vet afgeleide mesenchymale stamcellen

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer immunomagnetische scheiding van Sca1-hoge vetcel-afgeleide stamcellen uit muizenweefsel met behulp van collageenase-vertering. Deze methode optimaliseert celopbrengst voor regeneratieve geneeskunde-onderzoek.

Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1

Meer video's verkennen