Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van Sca1-positieve mesenchymale stamcellen uit verschillende vetdepots van de muis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het gebruik van immuunmagnetische beads-gebaseerde cel sortering, uit vetweefsel afgeleide stamcellen uit verschillende vetdepots effectief kunnen worden verrijkt voor opeenvolgende experimenten. Over het algemeen zullen onderzoekers die nieuw zijn met deze methode enige moeite hebben, omdat de sterkte en duur van de collagenase-gemedieerde weefseldigestie moeten worden geoptimaliseerd om een adequaat aantal cellen voor de sortering te verkrijgen.

Om de subcutane vetkussentjes te isoleren, begint u met het plaatsen van de muis in rugligging op een schuimrubberen dissectiebord en het besproeien van het dier met 70% ethanol. Nadat de poten aan het bord zijn vastgezet, maakt u een kleine incisie in de huid van de onderbuik. Pak vervolgens de bovenkant van de snede vast met een pincet en gebruik een schaar om de huid en het peritoneum van de buik tot aan de thorax te scheiden.

Maak laterale incisies in de huid, langs de zijkant van het lichaam, en klap de huid weg van het peritoneum in de richting van de kop. Trek vervolgens de resterende huid terug, terwijl het inguinale vet van het lichaam wordt weggehouden, en gebruik naalden van 22 gauge om de huid aan de plank vast te pinnen. Gebruik daarna de pincet om één inguinaal vetkussen vast te pakken bij de oorsprong nabij het peritoneum, en gebruik een fijne schaar om tussen de huid en het inguinale vet door te knippen in de richting van de lies, waarbij moet worden voorkomen dat het subcutane vetkussen besmet raakt met huid.

Plaats vervolgens het geïsoleerde inguinale vetkussen in een met SQ gelabelde schaal van 60 millimeter met kweekmedium van 37 °C, en oogst op dezelfde wijze het inguinale vetkussen van de andere zijde van het dier. Om de viscerale vetkussens te isoleren, snijdt u het peritoneum open om de viscerale vetkussens en de darmen bloot te leggen. Verschuif vervolgens de darmen opzij, richting de thorax.

Pak het viscerale vetkussen bij het distale uiteinde vast, trek het vetweefsel voorzichtig omhoog en dissekeer het weg, waarbij u er zorg voor draagt dat het epididymale weefsel wordt uitgesloten. Plaats het vetkussen vervolgens in een met VIS gelabelde schaal van 60 millimeter met kweekmedium van 37 °C. Wanneer alle vetkussens zijn verzameld, brengt u de schalen over naar een weefselkweekkast en aspireert u het medium.

Gebruik gebogen scharen om de vetkussentjes fijn te knippen. Voeg de vetstukjes vervolgens toe aan individuele buisjes van 50 milliliter die vers bereid collagenase bevatten. Schud de buisjes daarna 10 tot 20 minuten bij 300 RPM en 37 graden Celsius, tot de weefsels zijn verteerd.

Sommige stukjes subcutaan vetkussenweefsel kunnen nog steeds zichtbaar zijn. Voeg 20 milliliters kweekmedium toe aan de collagenase-oplossing om de digestie te stoppen en gebruik een serologische pipet van 10 milliliter om het weefselsuspensie 10 keer op te zuigen en te dispenseren om de gedigesteerde weefsels volledig te dissociëren. Filtreer de cellen door celzeven van 100 micron en centrifugeer de weefsels.

Decanteer vervolgens voorzichtig het medium, waarbij u er op let dat de pellets niet worden verstoord, en resuspendeer beide celgroepen voorzichtig in vijf milliliters steriel water. Wacht twee minuten tot de erytrocyten zijn gelyseerd. Stop vervolgens de reactie in elke buis met 25 milliliters medium aangevuld met FBS.

Filtreer beide adipocytpopulaties door nieuwe cellenzeven van 100 micron, centrifugeer ze opnieuw en resuspendeer de pellets vervolgens in één tot drie milliliter medium. Na het tellen middels trypaanblauw-uitsluiting, zaai je apart één keer tien tot de zesde subcutane vetkussencellen en viscerale cellen uit in individuele putjes van een zes-wells celkweekplaat. Verdun na het trypsiniseren van de cellen het trypsine met één milliliter scheidingsbuffer en centrifugeer vervolgens de kweekplaten.

We suspenderen de cellen in 500 µL separatiebuffer per buis en centrifugeren de cellen opnieuw. Resuspendeer de cellen nu in 90 µL separatiebuffer per buis en voeg 10 µL anti-Sca1 FITC primair antilichaam toe aan de celsuspensie. Na 10 minuten incubatie bij 4 °C in het donker worden de cellen gewassen met 1 mL separatiebuffer per buis.

Na het centrifugeren worden de cellen resuspendeerd in 80 µL scheidingsbuffer per celsuspensie. Meng vervolgens 20 µL Anti-FITC Microbeads in elke put en plaats de platen gedurende 15 minuten bij vier °C, beschermd tegen licht. Was na afloop van de incubatie de cellen in 1 mL scheidingsbuffer en resuspendeer de cellen in 500 µL verse buffer per buis.

Plaats nu een kolom in de magnetische houder en spoel de kolom met 500 µL scheidingsbuffer. Breng de cellen vanuit de kweek van het subcutane vetkussenweefsel over op de kolom, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan, en verzamel de ongelabelde Sca1-negatieve cellen in een conische buis van 15 ml. Wanneer alle cellen door de kolom zijn gelopen, spoelt u de kolom drie keer met 500 µL scheidingsbuffer.

Breng vervolgens de kolom van de magneet over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter en spoel één milliliter verse scheidingsbuffer door de kolom om de Sca1-positieve cellen te elueren. Centrifugeer tot slot zowel de Sca1-positieve als de Sca1-negatieve cellenfracties en resuspendeer de pellets in één milliliter kweekmedium. Tel vervolgens het aantal cellen in elke fractie en zaai de fracties uit in individuele wells van een nieuwe zes-well celkweekplaat.

Vasculaire stromale cellen geïsoleerd uit subcutaan vet vertonen een fibroblast-achtige, uitgerekte celvorm, ongeacht hun niveau van Sca1-expressie. Net als Sca1-hoge cellen afgeleid van subcutaan inguinaal vet, vertonen Sca1-hoge cellen afgeleid van visceraal epididymaal vet een uitgerekte fibroblast-achtige celvorm. Terwijl VIS Sca1-lage cellen een epithelioïde vorm vertonen.

Sca1-hoge cellen geïsoleerd uit Sca1-GFP-muizen zijn in weefselkweek eenvoudig te identificeren als GFP-positieve cellen. Wanneer deze cellen worden geanalyseerd via flowcytometrie, blijkt inderdaad dat de meeste GFP-positieve cellen Sca1-eiwitten op hun celoppervlak tot expressie brengen, zoals aangetoond met een anti-Sca1-antilichaam. In combinatie met real-time PCR-analyses kan de differentiële expressie van collagenolytische matrixmetalloproteïnasen tussen Sca1-hoge adipogene stamcellen afkomstig uit liesvet en epididymaal vet worden aangetoond.

Verder, wanneer fluoresceïne-gelabelde type I collageengelaten worden gebruikt om de pericellulaire degradatieactiviteit te beoordelen, wordt een duidelijk verhoogde collageen-remodelleringsactiviteit waargenomen die wordt gemedieerd door viscerale Sca1 high adipogene stamcellen. Eenmaal beheerst, kan de isolatie van vetkussencellen in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een schoon en georganiseerd chirurgisch veld te behouden om een efficiënte isolatie van het vetkussen te waarborgen.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals een collageen-degradatieassay, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over weefselremodellering door vetafgeleide stamcellen te beantwoorden. Na de ontwikkeling hiervan maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van obesitas en matrixbiologie om de rol van vetafgeleide stamcellen bij de remodellering en functie van vetweefsel bij muizen en mensen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire Sca1-positieve cellen uit vetweefseldepots kunt verkrijgen en verrijken.