Gelijktijdige detectie van c-Fos Activering van mesolimbic en mesocorticale Dopamine Beloning Sites Na Naive suiker en vet inname bij ratten

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om te bepalen of de VTA, en zijn belangrijkste mesotelencefalische DA-projectiezones, coördinatie en gelijktijdige c-Fos-activering vertonen na nieuwe inname van maïsolie-, glucose-, fructose- of saccharineoplossingen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de neurobiologie te beantwoorden, zoals motivatie, en om vast te stellen of meerdere hersengebieden op een gecoördineerde manier worden geactiveerd als reactie op smakelijk stimuli. Het grote voordeel van deze techniek is dat het gevestigde gedragsmetingen, cellulaire activeringstechnieken en statistische analyses combineert.

Om het apparaat op te zetten, gebruik een gekalibreerd centrifugeerbuisje met een rubberen stop, en een 45-graden hoekige metalen drinkbuis om een nauwkeurige meting van de aan de rat gepresenteerde oplossing te geven. Bevestig het aan de thuiskooi met een strakke metalen veer, en laat de zichtbaarheid van de kalibratie toe. Beperk drie tot vijf dagen voorafgaand aan de training het voerrantsoen van de rat om het lichaamsgewicht te verminderen tot 85% van het oorspronkelijke gewicht, om de motivatie om de oplossing te consumeren te verhogen.

Geef in de tussentijd gedurende vier dagen, gedurende een sessie van een uur, 10 milliliter voorafgaande oplossing met 0,2% saccharine aan het dier, om de waarschijnlijkheid te maximaliseren dat de rat de volgende testoplossing met een korte latentie zal bemonsteren. Weeg de buis voor en na elke sessie om de innamemeting te verkrijgen. Voer vervolgens op de vijfde dag een innametest uit op subgroepen die een van de zes oplossingen ontvangen.

Zorg ervoor dat de ratten de oplossing met een korte latentie bemonsteren, en sluit de proefpersonen uit van het onderzoek als aan deze vereiste niet wordt voldaan. Om het weefsel voor te bereiden, verwijder na het doden van het dier snel de hersenen uit de schedel. Gebruik de rongeurs om voorzichtig het bot van de hersenen te kraken en te verwijderen, beginnend van achter naar voren.

Werk in het gebied onder het cerebellum en zorg ervoor dat de rongeurs zich tussen het bot en de meningeale pia mater bevinden. Zodra de bovenkant en de zijkanten van de schedel zijn verwijderd, gebruik een kleine spatel om de hersenen vanaf de basis te tillen en snijd de hersenzenuwen met kleine schaartjes door. Bevestig vervolgens de hersenen in 4% paraformaldehyde-oplossing overnacht bij vier graden Celsius.

Plaats de volgende dag de hersenen in de sucrose-oplossing bij kamertemperatuur, totdat deze zich op de bodem van de container nestelt. Verwijder daarna de reukbol. Verwijder vervolgens het cerebellum en de pons.

Monteer vervolgens de hersenen coronaal, met het caudale deel bevestigd aan de trap van de microtoom, en snij coronale secties van 40 micrometer. Behandel de secties in deze procedure met vijf milliliter 5% normaal geitenserum en 0,2% Triton x-100 in PBS gedurende één uur. Incubeer vervolgens de behandelde secties met primaire antilichamen bij vier graden Celsius gedurende 36 uur in de putjes die een milliliter PBS bevatten.

Na 36 uur spoelt u de secties drie keer met vijf milliliter PBS gedurende 10 minuten per keer. Incubeer vervolgens de secties met secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende twee uur in de putjes die een milliliter PBS bevatten. Spoel daarna de secties drie keer in vijf milliliter PBS gedurende 10 minuten per keer.

Incubeer vervolgens de gespoelde secties gedurende twee uur in een commercieel verkrijgbaar Avidine-paardenradenzym-mengsel. Spoel de secties na twee uur drie keer in vijf milliliter PBS, gedurende tien minuten per keer. Reageer vervolgens de secties met DAB in aanwezigheid van waterstofperoxide gedurende vijf tot tien minuten.

Label vervolgens de VTA-secties dubbel door ze overnacht bij vier graden Celsius in te bedden met een tyrosinehydroxylase-antilichaam in vijf milliliter PBS. Was de volgende dag de secties drie keer in vijf milliliter PBS, gedurende tien minuten per keer. Incubeer vervolgens de secties met secundair antilichaam in vijf milliliter PBS, bij kamertemperatuur, gedurende twee uur.

Spoel na twee uur de secties drie keer in vijf milliliter PBS, gedurende tien minuten per keer. Om het antilichaam met behulp van een secundair antilichaamperoxidase-complex te visualiseren, reageer het met een combinatie van DAB en een 0,3% nikkelsulfaatoplossing gedurende vijf tot tien minuten. Tel de cellen door te dubbelklikken op het softwarepictogram.

Ga naar de menubalk, klik op Acquisitie en vervolgens op Live beeld. Breng vervolgens het gebied van belang in focus en klik op het scherm om een referentiepunt vast te stellen. Ga vervolgens naar de rasterwerkbalk en klik op Raster weergeven en Rasterlabels gebruiken.

Schets het gebied van belang met een vooraf bepaald tracé. Tel vervolgens alle cellen in elk gebied van belang en selecteer Plus in de linkerzijbalk om de tellingen van de c-Fos-cellen te registreren. Beschouw een cel als positief voor c-Fos wanneer een gedefinieerde donkerrode cirkel wordt waargenomen.

Herhaal dit proces voor elke site en zorg ervoor dat de inter-rater betrouwbaarheid van de twee ongeïnformeerde beoordelaars voor elke sectie in elk gebied van belang altijd hoger is dan 0,8. Tel vervolgens de c-Fos-positieve neuronen in de gebieden van belang. Bepaal of c-Fos-immunoreactiviteit aanwezig is in de TH-positieve en TH-negatieve cellen in de VTA.

Deze afbeelding toont dat de vet- of suikerinname differentieel de c-Fos-activering in de gehele amygdala verhoogt, evenals in de basolaterale en centrale cortico-mediale amygdala-subgebieden. In deze afbeelding werd actuele amygdala c-Fos-activering waargenomen bij dieren die werden blootgesteld aan inname van maïsolie, glucose en fructose. C-Fos-activering in de VTA werd ook waargenomen bij dieren die werden blootgesteld aan maïsolie en water.

Zwarte pijlen geven de representatieve, dubbelgelabelde, TH c-Fos-positieve cellen aan, terwijl grijze pijlen de representatieve c-Fos-alleen cellen aangeven. Eenmaal onder de knie, kan deze