Name: In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Leer hoe je influenza A-virus capsiden demonteert met gradiëntcentrifugatie om de ontmanteling tijdens celinfectie te analyseren. Deze methode biedt kwantitatieve inzichten in virale uncoating-processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Yohei Yamauchi en Roberta Mancini voor het verstrekken van ons met reagentia. De AH laboratorium werd gesteund door de Marie Curie Initial Training Networks (ITN), de European Research Council (ERC), en door de Zwitserse National Science Foundation (Sinergia).

1. Bereiding van Buffers en Voorraadoplossingen <ol><li> Bereid MNT buffer (20 mM MES, 30 mM Tris en 100 mM NaCl) door het oplossen van 470 mg Tris HCl, 390 mg MES-hydraat en 580 mg NaCl in 80 ml ​​DDH 2 O. Stel de buffer op pH 7,4 en brengen tot een eindvolume van 100 ml met DDH 2 O. </li><li> Bereid drie identieke oplossingen van 500 mM MES buffer door het oplossen van 9,76 g MES hydrateren in 80 ml ​​dH 2 O per stuk. Stel de buffers op pH 5,8, 5,4 en 5,0, respectievelijk door titratie met geconcentreerd NaOH. Breng elke buffer tot een eindvolume van 100 ml met dH 2 O. </li><li> Bereid twee identieke oplossingen van 500 mM Tris-buffer door oplossen van 7,88 g Tris HCl in 80 ml ​​dH 2 O en elk op pH 7,4 en 6,4, respectievelijk door titratie met geconcentreerd HCI. Breng de buffer tot een eindvolume van 100 ml met dH 2 O. </li><li> Bereid 50% glycerol oplossing in dH 2 O en roer goed tot de glycErol is homogeen gemengd. Filtreer de oplossing door een Steritop filtereenheid (0,22 urn poriegrootte) in een glazen fles. </li><li> Bereid 10% NP-40 oplossing en 1 M NaCl in dH 2 O. </li><li> Bereid 25x geconcentreerde proteaseremmer door het oplossen van twee tabletten in 4 ml DDH 2 O. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Glycerol Verlopen <ol><li> Bereid 5 ml detergent buffer master mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x geconcentreerd proteaseremmer) oplossing voor elke pH conditie te testen (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 en 5,0). Daartoe meng 9 ml van 1 M NaCl, 6 ml van 10% NP-40, 2,4 ml van 25x proteaseremmer beelden, en 9 ml DDH 2 0. </li><li> Voor elke pH voorwaarde pipet 4,4 ml van de master mix in een 50 ml conische buis. </li><li> Voor pH-waarden boven 5,8 voeg 0,6 ml van de respectieve pH 500 mM Tris voorraadoplossing aan de buis. Voor pH 5,8 en lager voeg 0,6 ml van de respectieve pH 500 mM MES voorraadoplossing. </li><li> maak 5ml bufferoplossing met 300 mM NaCl, 2x proteaseremmer, 60 mM Tris pH 7,4 en DDH 2 O. Dit zal dienen als de detergens-vrije controle gradiëntbuffer. </li><li> Eventueel fijn stel de pH van de oplossing op pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 en 5,0 door toevoeging van geconcentreerd HCI of NaOH oplossingen, respectievelijk. </li><li> Voeg 5 ml van 50% glycerol tot 5 ml van het detergens-bevattende en detergens-vrije buffer mengsels resulterend in zes 25% glycerol oplossingen. Controleer de pH-waarden met behulp van pH-indicator strips. LET OP: In het geval dat de gemeten pH-waarde aanzienlijk verschilt van de gewenste waarde, moet de respectievelijke oplossingen opnieuw worden voorbereid. </li><li> Bereid 15% glycerol oplossing door 50% glycerol voorraad dH 2 O in een 3: 7 verhouding. </li></ol> 3. Ultracentrifugatie van IAV <ol><li> Voeg 3 ml 15% glycerol oplossing in ultra-heldere centrifugeren buizen (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) met behulp van een 5 ml spuit en een neeDLE (21 G, 9 cm lang). Niet druppels reactie op de binnenwand van de buis als deze de integriteit van de gradiënt kunnen verstoren. Herhaal dit tot een totaal van zes centrifugatie buizen, één voor elk van de vijf pH-omstandigheden te testen en een voor het controlemonster. </li><li> Plaats voorzichtig 3,4 ml 25% glycerol oplossing onder de 15% glycerol laag met behulp van een 5 ml spuit en een lange naald. Zorg ervoor dat niet de twee lagen te mengen. Herhaal dit voor alle zes condities test met de respectieve pH glycerol oplossingen. LET OP: Het werk in klasse II bioveiligheid kast voor de volgende stappen. </li><li> Voorzichtig overlay de glycerol gradiënten met 30 pi geklaarde allantoïsvocht dat IAV (X31, H3N2) verdund in 1 ml MNT buffer (komt overeen met ongeveer 20-30 ug totaal viraal eiwit) voor elk verloop. </li><li> Balance tegengestelde buizen en plaats ze in een SW41 ultracentrifugatie rotor. Centrifugeer gedurende 150 min bij 55.000 xg en 12 ° C. </li><li> Na het centrifugeren, zorgvuldigde bovenstaande vloeistof, dat wil zeggen, zowel glycerol lagen met behulp van een schone Pasteur pipet en een afzuiger. Resuspendeer de pellet in 40 pl (1x) niet-reducerende LDS monsterbuffer. Het is belangrijk om op en neer pipetteren meerdere malen de korrel volledig op te lossen. Breng het monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li></ol> 4. SDS-PAGE van Pellet Fracties en Coomassie kleuring <ol><li> Verhit alle monsters bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Op dit punt kunnen monsters worden bewaard bij -20 ° C tot ze worden geanalyseerd door SDS-PAGE. </li><li> Load 20 ul van de opgeloste pellets op een prefab gradiënt (4-12%) Bis-Tris mini gel en laat gedurende 1 uur bij 200 V in 1 x MOPS SDS loopbuffer. </li><li> Maak fixatie-oplossing met 40% methanol en 10% ijsazijn in DDH 2 O. </li><li> Incubeer de gel in fixatie oplossing 1 uur en vlekken overnacht in een 15 cm celkweekschaal met een voldoende hoeveelheid colloïdale Coomassie-oplossing onder zachtschudden bij kamertemperatuur. Opmerking: Het is belangrijk om de schotel sluiten om verdamping van de kleuroplossing voorkomen. </li><li> Destain de gel in DDH 2 O. Vervang de DDH 2 O om de 15-20 min tot het gel achtergrond duidelijk wordt. Bewaar de gel in DDH 2 O bij 4 ° C totdat het wordt gescand op band kwantificering. </li><li> Scan de gel met een hoge resolutie en het gebruik van in de handel verkrijgbare of op maat gemaakte software voor het kwantificeren van eiwit band intensiteiten. Trek het achtergrondsignaal uit een gebied dicht bij de respectievelijke banden en normaliseren deze waarden de detergentvrij controlemonsters (bij pH 7,4). </li></ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li>
<li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+virus+entry+via+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li>
<li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li>
<li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%3A+The+viral+matrix+protein+%28M1%29+promotes+export+and+inhibits+import%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).</li>
<li>Chou, Y. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li>
<li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li>
<li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K%2B+is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li>
<li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+matrix+protein+M1%2FM+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li>
<li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li>
<li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).</li>
<li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li>
<li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li>
<li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li>
<li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+influenza+virus%3A+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+virus+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li>
<li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Influenza+C+Viruses%2C+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Virale capsiden zijn metastabiele macromoleculaire complexen. Tijdens de montage van de virionen inkapseling en condensatie van het virusgenoom vereist begin van de volgende ronde van infectie afhankelijk demontage van deze compacte capside structuur. Virussen zijn geëvolueerd om verschillende cellulaire mechanismen exploiteren om de coating-uncoating cyclus, zoals cellulaire receptoren, chaperones, proteolytische enzymen, fysische krachten door motor eiwitten of helicasen en pH en ionische schakelaars 26,27 ...

Influenza A virus (IAV) is een omhuld virus en behoort tot de familie van Orthomyxoviridae. De genen worden gecodeerd op een gesegmenteerde negatieve-sense en enkelstrengs RNA genoom. Bij de mens, IAV veroorzaakt infecties van de luchtwegen, die voorkomen in seizoensgebonden epidemieën en draagt ​​het potentieel voor wereldwijde pandemieën 1. Bij binding aan siaalzuur residuen van de gastheercel oppervlak 2 wordt IAV geïnternaliseerd door clathrine-afhankelijke endocytose en clathrine-onafhankelijke routes 3-8. De zure milieu (pH &lt;5,5) in de endocytische vacuolen veroorzaakt een grote conformationele verandering in de iav spike glycoproteïne hemagglutinine (HA), waardoor fusie van de virale en endosomale membraan 9 late. Zodra de IAV capside (hier ook aangeduid als virale &quot;kern&quot;) is ontsnapt uit late endosomen (GO) wordt onbekleed in het cytosol gevolgd door transport van de virale ribonucleoproteins (vRNPs) in de kern - de site of virus replicatie en transcriptie 10-13. Vóór zure activatie van het virus HA ervaart een geleidelijke afname in pH in de endocytische systeem, waarbij de kern voor de latere demontage 14-16 priemgetallen. In deze &quot;priming&quot; stap het M2 ionkanalen in het virale membraan bemiddelen de instroom van protonen en K +10,14,16. De verandering in ionische concentratie in het inwendige virus verstoort de interacties opgebouwd uit het virale eiwit matrix M1 en de acht vRNP bundel en vergemakkelijkt IAV ontmanteling in het cytoplasma volgende membraanfusie 10,14-17. Directe en kwantitatieve analyse van de priming stap belemmerd doordat endosomen moeilijk om experimenteel. De vermelding proces is bovendien zeer non-synchrone. Daarnaast hebben eindpunt assays, zoals qRT-PCR van viraal RNA of vrijgegeven besmettelijkheidsmetingen, geen gedetailleerd beeld over de biochemische status van de virale Capsi biedend op elk stap van binnenkomst. Terwijl de verstoring van endosomen door siRNA of behandeling met geneesmiddelen aanzienlijk heeft bijgedragen aan het begrip van IAV binnenkomst 18-20, fine-tuning is moeilijk en gevoelig voor niet-specifieke bijwerkingen in de streng gecontroleerde endosoom rijping programma. Om deze problemen te vermijden, hebben we een eerder ontwikkelde in vitro protocol gebaseerd op het gebruik van snelheidsgradiënt centrifugatie 17 aangepast. In tegenstelling tot andere pogingen 21,22, 23,24, die meestal zijn gebaseerd op combinaties van proteolytische splitsing en detergens behandeling, gevolgd door EM-analyse, deze benadering mogelijk een gemakkelijk meetbaar resultaat. Centrifugatie door verschillende helling lagen kan de sedimenteren deeltjes worden blootgesteld aan en reageren met veranderende condities op een gecontroleerde manier. In de gepresenteerde protocol IAV afgeleid van geklaarde allantoïsvocht of gezuiverde virale deeltjes gesedimenteerd in een tweelaags glycerolgradiënt waarbij de onderlaag bevat de niet-ionische detergens NP-40 (figuur 1). Omdat het virus komt in de tweede, detergent bevattende laag, wordt de virale lipide-envelop en envelop glycoproteïnen langzaam oplosbaar en achtergelaten. De kern, bestaande uit de acht vRNP bundel en wordt omgeven door een matrix laag, sedimenten als een stabiele structuur in de fractie pellet. Virale kerneiwitten zoals M1 en vRNP geassocieerde nucleoproteïne (NP), kunnen worden geïdentificeerd in de pellet door SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Met name te maken van commercieel beschikbare gradiënt gelen en kleuring met de zeer gevoelige colloïdale Coomassie 25, maakt hoge precisie en detectie van zelfs kleine hoeveelheden virale kern geassocieerde eiwitten. Dit stelt de basis voor testen of andere omstandigheden zoals pH, zoutconcentratie, en vermeende ontmanteling factoren hebben invloed op het sedimentatiegedrag van kernonderdelen en kern stabil<html> teit. Hiertoe wordt alleen de onderste, detergent-bevattende laag in de glycerol gradiënt gemodificeerd door introductie van de factor of aandoening van belang. De techniek is bijzonder waardevol bij het ​​onderzoek het effect van verschillende pH en zoutconcentraties op de integriteit van de kern 16 IAV geweest. Tussenstappen van IAV uncoating kan worden gevolgd onder dissociatie van de matrixlaag bij mild zure pH (&lt;6,5), gevolgd door dissociatie vRNP bij pH 5,5 en lager 16,17 (Figuur 1). De laatste stap werd verder versterkt door de aanwezigheid van hoge K + -concentratie in de glycerollaag, als gevolg van een late endocytische omgeving 16. Zoals de virus en de kern gesedimenteerd door de gradiënt ervaren ze een veranderende milieu dat bootst omstandigheden in endosomen. Het resultaat was een stapsgewijze demontage van de virale kern in vitro, als aanvulling op de resultaten afgeleid van celbiologie assays. t &quot;&gt; De hier gepresenteerde methode is snel ingeschakeld en zeer reproduceerbare analyse van IAV (X31 en A / WSN / 33) en IBV (B / Lee / 40) ontmantelingsmechanisme veroorzaakt door zure pH en het verhogen van K +16,17 evenals demontage van paramyxovirus kernen bij alkalische pH blootstelling 17. het is denkbaar dat de benadering kan worden aangepast aan andere omhulde virussen inzichten in de biochemische eigenschappen van het virale capside structuur en capside demontage groeit tijdens celinvoer.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&trade;, EDTA-vrije proteaseremmertabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>De stockoplossing kan worden bewaard bij 2 tot 8 &deg;C gedurende 1 tot 2 weken</td></tr><tr><td>Glazuur azijnzuur</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol anhydrous BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Lange injectienaald (21&nbsp;G, 9 cm, geslepen of stomp uiteinde)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES-hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Nu commercieel verkrijgbaar als IGEPAL&reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10&nbsp;kolven, 1.0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS-monsterbuffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS-loopbuffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>pH-indicatorstroken, pH 4.0-7.0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Colloidal Coomassie Stain</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Steritop-filtereenheid</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, ultracentrifuge rotorset</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige, ultraklare centrifugeerbuizen, 13.2&nbsp;ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris-hydrochloride&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 Influenza A-virus (H3N2), uit ei gekweekt, verduidelijkt allantoische vloeistof</td><td>Virapur</td><td></td><td>Ver vers ontdooid op 4 &deg;C</td></tr></tbody></table>

in vitro demontage van influenza a-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Zuur-getriggerde moleculaire processen controleren nauw de celinvoer van veel virussen die binnenkomen via het endocytische systeem. In het geval van het influenza A-virus (IAV) worden virusfusie met het endosomale membraan en de daaropvolgende ontmanteling van de virale capside, genoemd uncoating, geregeld door de ionische omstandigheden in endocytische vesicles. De vroege stadia in de levenscyclus van het virus zijn moeilijk te bestuderen omdat endosomen niet direct experimenteel toegankelijk zijn, wat de noodzaak creëert voor een in vitro aanpak. Hier beschrijven we een methode gebaseerd op snelheidsgradientcentrifugatie van gezuiverde virionen door een tweelaagse glycerolgradient, die analyse van de IAV-kern en zijn stabiliteit mogelijk maakt. De gradient bevat een niet-ionisch detergent (NP-40) in zijn onderste laag om het virale membraan te verwijderen door solubilisatie terwijl het virus naar de bodem sedimenteert. Bij neutrale pH worden virale kernen gepelleteerd als stabiele structuren. De belangrijkste kerncomponenten, matrixeiwit (M1) en de virale ribonucleoproteïnen (vRNP's), kunnen duidelijk worden geïdentificeerd in de pelletfractie door SDS-PAGE. Het verlagen van de pH tot 6,0 of lager in de onderste laag verwijdert selectief M1 uit de pellet gevolgd door de afgifte van vRNP's onder meer zure omstandigheden. Virale eiwitbanden op Coomassie-gekleurde gels kunnen worden onderworpen aan densitometrische kwantificering om intermediaire stadia van IAV-ontmanteling te monitoren. Naast pH kunnen andere factoren die de stabiliteit van de virale kern beïnvloeden, zoals zoutconcentratie en mogelijke virale uncoating-factoren, eenvoudig worden beoordeeld door de glycerollaag met detergent dienovereenkomstig aan te passen. Samengevat maakt de gepresenteerde techniek zeer reproduceerbare en kwantitatieve analyse van virale uncoating in vitro mogelijk. Het kan worden toegepast op andere omhulde virussen die complexe uncoatingsprocessen ondergaan.

Zoals reeds besproken, priming in endosomen is nodig om de IAV kern uncoating bevoegd te maken. Protonering van de kern verzwakt interactie tussen M1 en vRNPs (uit het virale RNA, NP en de polymerasecomplex PB1 / PB2 / PA). Dit proces begint wanneer binnenkomende virus wordt blootgesteld aan een pH van 6,5 (of lager) begin endosomen (EE) en gaat door tot fuseert het virus bij ongeveer pH 5,0 les. Om de daling van de pH naboots...

De demontage van influenza A-viruskernen tijdens het binnendringen van het virus in gastheercellen is een proces in meerdere stappen. We beschrijven een in vitro methode om de vroege stadia van virale uncoating te analyseren. In deze benadering wordt snelheidsgradientcentrifugering gebruikt om de stappen die het begin van uncoating initiëren onder gedefinieerde omstandigheden biochemisch te ontleden.

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Het algemene doel van deze snelheidsgradiëntcentrifugatie is om influenza A-viruscapsiden te analyseren onder omstandigheden die het endocytische milieu nabootsen dat binnenkomende virussen tegenkomen tijdens de celintrede. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe influenza A-viruscapsiden desintegreren tijdens de celintrede, zoals het specifieke effect van een licht zure pH op de stabiliteit van het capside. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatieve analyse mogelijk maakt van het ontmantelingsproces van het influenza A-virus onder gedefinieerde experimentele omstandigheden.Naast het verschaffen van inzicht in hoe de ontmanteling van het influenza A-virus wordt geïnitieerd, kan deze methode ook worden toegepast op de studie van andere omhulde virussen met verwante ontmantelingsmechanismen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Firat Nebloglu, een voormalig student uit mijn laboratorium. Bereid na het klaarmaken van de voorraadbuffers en reagentia volgens het tekstprotocol, voor elke te testen pH-conditie, een detergentbuffer mastermix door negen milliliter 1 M natriumchloride, zes milliliter 10% NP40, 2,4 milliliter van de 25X protease-remmer voorraad en negen milliliter dubbel gedestilleerd water te mengen.Pipette vervolgens voor elke pH-conditie 4,4 milliliters van de mastermix in een conische buis van 50 milliliters. Voeg voor pH-waarden boven 5,8 0,6 milliliters van de betreffende pH-gecorrigeerde 500 milliMolar Tris-stamsolution toe aan de buis. Voeg voor pH-waarden van 5,8 en lager 0,6 milliliters van de betreffende pH-gecorrigeerde 500 milliMolar MES-stamsolution toe.Maak vijf milliliter bufferoplossing, bestaande uit 300 milliMolar natriumchloride, 2X protease-inhibitor, 60 milliMolar Tris, ingesteld op pH 7.4, en dubbel gedestilleerd water. Dit dient als de detergentvrije controle-gradiëntbuffer. Voeg vervolgens vijf milliliter van de 50%glycerol-stock toe aan vijf milliliter van de detergentbevattende en detergentvrije buffermengsels, wat resulteert in zes verschillende 25%glycerol-oplossingen.Gebruik pH-strips om de pH-waarden te verifiëren. Bereid een 15% glyceroloplossing door een 50% glycerolvoorraad in een verhouding van drie op zeven te mengen met gedestilleerd water. Voeg met een injectiespuit van 5 mL en een naald drie milliliter van de 15% glyceroloplossing toe aan zes ultraclear centrifugatiebuisjes.Spoel de naald na elke stap af met dubbel gedestilleerd water. Gebruik een spuit van vijf milliliter en een lange naald om voorzichtig 3,4 milliliters van een 25% glyceroloplossing onder de 15% glycerollaag te injecteren, waarbij u er zorg voor draagt dat de twee lagen niet mengen. Een interface tussen beide lagen is duidelijk zichtbaar.Herhaal dit voor alle zes de te testen condities met de respectievelijk pH-gecorrigeerde glyceroloplossingen. Gebruik vervolgens, in een Klasse II biosafety cabinet, één milliliter geklaarde, verdunde allantoïsvloeistof die influenzavirus A bevat, om de glycerolgradiënten voorzichtig te overlagen. Plaats de buizen in de rotorbuckets, balanceer de tegenoverliggende buizen en plaats ze voorzichtig in een vooraf gekoelde SW-41 ultracentrifugerotor.Centrifugeer bij 2100 rpm en 12 °C gedurende 150 minuten. Gebruik na de centrifugatie een schone Pasteurpipet en een aspirator om beide glycerollagen voorzichtig te verwijderen. Resuspendeer de pellet vervolgens volledig door met 40 milliliter 1X niet-reducerende LDS-monsterbuffer herhaaldelijk op en neer te pipetteren, alvorens het monster over te brengen naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.Om SDS-PAGE uit te voeren, worden alle monsters 10 minuten verhit bij 95 °C. Breng 20 µL van de opgeloste pellets aan op een precast gradient Bis-Tris mini-gel en laat deze één uur lopen bij 200 V in 1X MOPS SDS-loopbuffer. Incubeer de gel gedurende één uur in fixeeroplossing.Spoel één tot twee keer af met water en kleur de gel gedurende de nacht in een kweekschaal van 15 centimeter met een voldoende volume colloïdaal Coomassie-oplossing, terwijl de schaal bij kamertemperatuur zachtjes wordt geschud. Ontkleur de gel in dubbel gedestilleerd water, waarbij de vloeistof elke 15 tot 20 minuten wordt vervangen totdat de achtergrond van de gel helder is. Bewaar de gel in dubbel gedestilleerd water bij vier graden Celsius totdat deze wordt gescand voor bandkwantificatie.Scan ten slotte de gel met een hoge resolutie en gebruik commercieel verkrijgbare, op maat gemaakte software voor de kwantificering van de intensiteiten van de eiwitbanden. Trek het achtergrondsignaal van een gebied nabij de betreffende banden af en normaliseer de waarden ten opzichte van de waarden van de detergent-vrije controle. In dit experiment werd X31, afgeleid van geklaard allantoïsvloeistof, onderworpen aan velociteitsgradiëntcentrifugatie bij pH-waarden tussen 7,4 en 5,0 en geanalyseerd via SDS-PAGE.Zonder detergent in de gradiënt worden intacte virionen neergeslagen, wat blijkt uit het karakteristieke bandenpatroon van HA, NP en M1 in de met Coomassie-kleuring behandelde gel. Na toevoeging van NP40 aan de onderste glycerollaag werd de virale envelop, inclusief HA, NA en M2, gesolubiliseerd en sedimenteerde alleen de virale kern in het pellet tijdens ultracentrifugatie. Beginnend bij een pH onder 6,5 gaat M1 geleidelijk verloren uit de pelletfractie, waarbij een minimum wordt bereikt tussen pH 5,8 en pH 5,4.Bij een pH lager dan 5,8 divergeerden de vRNP's en gingen deze daardoor verloren uit het pellet. Uit de geanalyseerde proteïnebanden bleken twee verschillende pH-drempelwaarden voor de desassemblage van de M1-laag en de dissociatie van vRNP-bundels, respectievelijk pH 6,5 en pH 5,8. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat, afhankelijk van de specifieke influenza A-virusstam of mutant, verschillende desassemblage-eigenschappen kunnen worden waargenomen.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals elektronenmicroscopie, worden uitgevoerd om aanvullende inzichten te verkrijgen, zoals de structuur van geïsoleerde influenza-viruscapsiden.

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het genoom van het influenza A-virus bestaat uit acht afzonderlijke complexen van RNA en eiwitten, de zogenaamde virale ribonucleoproteïne complexen (vRNPs). Dit document beschrijft de glycerol gradiënt zuivering en transmissie elektronenmicroscopie visualisatie van influenza A vRNPs.

Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

We beschrijven het proces van het isoleren van hoge zuiverheid herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is van de hoge concentratie en zuiverheid, waardoor het bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties om nieuwe virale recombinanten te produceren.

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Uncoating is een essentiële stap in de vroege fase van de HIV-1 levenscyclus en wordt gedefinieerd als de demontage van het capside shell en de vrijlating van de virale ribonucleoproteïne complex (vRNP). Hier tonen we technieken voor het isoleren van intacte kernen van HIV-1 virionen en voor de kwantificering van hun...

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen...

Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Recombinante retrovirale integrase en DNA oligomeren nabootsen van virale DNA uiteinden kunnen een enzymatisch actieve complex bekend als een intasome vormen. Intasomes kan worden gebruikt voor biochemische, structurele en kinetische studies. Dit protocol detailleert hoe te monteren en te zuiveren van prototype schuimend virus intasomes.

Vergadering en zuivering van Prototype schuimend Virus Intasomes

Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.

Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen

Naarmate het gebied van gentherapie zich blijft ontwikkelen, is er een groeiende behoefte aan innovatieve methoden die deze uitdagingen kunnen aangaan. Hier wordt een unieke methode gepresenteerd, die het proces van het genereren van AAV-vectoren met een hoge opbrengst en hoge zuiverheid stroomlijnt met behulp van een celfabrieksplatform, dat voldoet aan de kwaliteitsnormen voor in vivo studies.

Een gestroomlijnde en gestandaardiseerde procedure voor het genereren van adeno-geassocieerde virusvectoren met een hoge titer en hoge kwaliteit met behulp van een Cell Factory-platform

Leer hoe je influenza A-virus capsiden demonteert met gradiëntcentrifugatie om de ontmanteling tijdens celinfectie te analyseren. Deze methode biedt kwantitatieve inzichten in virale uncoating-processen.

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Meer video's verkennen