In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Het algemene doel van deze snelheidsgradiëntcentrifugatie is om influenza A-viruscapsiden te analyseren onder omstandigheden die het endocytische milieu nabootsen dat binnenkomende virussen tegenkomen tijdens de celintrede. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe influenza A-viruscapsiden desintegreren tijdens de celintrede, zoals het specifieke effect van een licht zure pH op de stabiliteit van het capside. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatieve analyse mogelijk maakt van het ontmantelingsproces van het influenza A-virus onder gedefinieerde experimentele omstandigheden.

Naast het verschaffen van inzicht in hoe de ontmanteling van het influenza A-virus wordt geïnitieerd, kan deze methode ook worden toegepast op de studie van andere omhulde virussen met verwante ontmantelingsmechanismen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Firat Nebloglu, een voormalig student uit mijn laboratorium. Bereid na het klaarmaken van de voorraadbuffers en reagentia volgens het tekstprotocol, voor elke te testen pH-conditie, een detergentbuffer mastermix door negen milliliter 1 M natriumchloride, zes milliliter 10% NP40, 2,4 milliliter van de 25X protease-remmer voorraad en negen milliliter dubbel gedestilleerd water te mengen.

Pipette vervolgens voor elke pH-conditie 4,4 milliliters van de mastermix in een conische buis van 50 milliliters. Voeg voor pH-waarden boven 5,8 0,6 milliliters van de betreffende pH-gecorrigeerde 500 milliMolar Tris-stamsolution toe aan de buis. Voeg voor pH-waarden van 5,8 en lager 0,6 milliliters van de betreffende pH-gecorrigeerde 500 milliMolar MES-stamsolution toe.

Maak vijf milliliter bufferoplossing, bestaande uit 300 milliMolar natriumchloride, 2X protease-inhibitor, 60 milliMolar Tris, ingesteld op pH 7.4, en dubbel gedestilleerd water. Dit dient als de detergentvrije controle-gradiëntbuffer. Voeg vervolgens vijf milliliter van de 50%glycerol-stock toe aan vijf milliliter van de detergentbevattende en detergentvrije buffermengsels, wat resulteert in zes verschillende 25%glycerol-oplossingen.

Gebruik pH-strips om de pH-waarden te verifiëren. Bereid een 15% glyceroloplossing door een 50% glycerolvoorraad in een verhouding van drie op zeven te mengen met gedestilleerd water. Voeg met een injectiespuit van 5 mL en een naald drie milliliter van de 15% glyceroloplossing toe aan zes ultraclear centrifugatiebuisjes.

Spoel de naald na elke stap af met dubbel gedestilleerd water. Gebruik een spuit van vijf milliliter en een lange naald om voorzichtig 3,4 milliliters van een 25% glyceroloplossing onder de 15% glycerollaag te injecteren, waarbij u er zorg voor draagt dat de twee lagen niet mengen. Een interface tussen beide lagen is duidelijk zichtbaar.

Herhaal dit voor alle zes de te testen condities met de respectievelijk pH-gecorrigeerde glyceroloplossingen. Gebruik vervolgens, in een Klasse II biosafety cabinet, één milliliter geklaarde, verdunde allantoïsvloeistof die influenzavirus A bevat, om de glycerolgradiënten voorzichtig te overlagen. Plaats de buizen in de rotorbuckets, balanceer de tegenoverliggende buizen en plaats ze voorzichtig in een vooraf gekoelde SW-41 ultracentrifugerotor.

Centrifugeer bij 2100 rpm en 12 °C gedurende 150 minuten. Gebruik na de centrifugatie een schone Pasteurpipet en een aspirator om beide glycerollagen voorzichtig te verwijderen. Resuspendeer de pellet vervolgens volledig door met 40 milliliter 1X niet-reducerende LDS-monsterbuffer herhaaldelijk op en neer te pipetteren, alvorens het monster over te brengen naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Om SDS-PAGE uit te voeren, worden alle monsters 10 minuten verhit bij 95 °C. Breng 20 µL van de opgeloste pellets aan op een precast gradient Bis-Tris mini-gel en laat deze één uur lopen bij 200 V in 1X MOPS SDS-loopbuffer. Incubeer de gel gedurende één uur in fixeeroplossing.

Spoel één tot twee keer af met water en kleur de gel gedurende de nacht in een kweekschaal van 15 centimeter met een voldoende volume colloïdaal Coomassie-oplossing, terwijl de schaal bij kamertemperatuur zachtjes wordt geschud. Ontkleur de gel in dubbel gedestilleerd water, waarbij de vloeistof elke 15 tot 20 minuten wordt vervangen totdat de achtergrond van de gel helder is. Bewaar de gel in dubbel gedestilleerd water bij vier graden Celsius totdat deze wordt gescand voor bandkwantificatie.

Scan ten slotte de gel met een hoge resolutie en gebruik commercieel verkrijgbare, op maat gemaakte software voor de kwantificering van de intensiteiten van de eiwitbanden. Trek het achtergrondsignaal van een gebied nabij de betreffende banden af en normaliseer de waarden ten opzichte van de waarden van de detergent-vrije controle. In dit experiment werd X31, afgeleid van geklaard allantoïsvloeistof, onderworpen aan velociteitsgradiëntcentrifugatie bij pH-waarden tussen 7,4 en 5,0 en geanalyseerd via SDS-PAGE.

Zonder detergent in de gradiënt worden intacte virionen neergeslagen, wat blijkt uit het karakteristieke bandenpatroon van HA, NP en M1 in de met Coomassie-kleuring behandelde gel. Na toevoeging van NP40 aan de onderste glycerollaag werd de virale envelop, inclusief HA, NA en M2, gesolubiliseerd en sedimenteerde alleen de virale kern in het pellet tijdens ultracentrifugatie. Beginnend bij een pH onder 6,5 gaat M1 geleidelijk verloren uit de pelletfractie, waarbij een minimum wordt bereikt tussen pH 5,8 en pH 5,4.

Bij een pH lager dan 5,8 divergeerden de vRNP's en gingen deze daardoor verloren uit het pellet. Uit de geanalyseerde proteïnebanden bleken twee verschillende pH-drempelwaarden voor de desassemblage van de M1-laag en de dissociatie van vRNP-bundels, respectievelijk pH 6,5 en pH 5,8. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat, afhankelijk van de specifieke influenza A-virusstam of mutant, verschillende desassemblage-eigenschappen kunnen worden waargenomen.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals elektronenmicroscopie, worden uitgevoerd om aanvullende inzichten te verkrijgen, zoals de structuur van geïsoleerde influenza-viruscapsiden.