In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Het algemene doel van deze snelheidsgradiëntcentrifugatie is om influenza A-viruscapsiden te analyseren onder omstandigheden die de endocytische omgeving nabootsen die binnenkomende virussen tegenkomen tijdens celinvoer. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe influenza A-viruscapsiden tijdens celinvoer ontmantelen, zoals het specifieke effect van licht zure pH op de stabiliteit van de capsiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatieve analyse van het ontmantelingsproces van het influenza A-virus mogelijk maakt onder gedefinieerde experimentele omstandigheden.

Naast het verschaffen van inzichten in hoe de ontmanteling van het influenza A-virus wordt geïnitieerd, kan deze methode ook worden toegepast op het onderzoek van andere envelopvirussen met verwante ontmantelingsmechanismen. De procedure wordt gedemonstreerd door Firat Nebloglu, een voormalige student uit mijn lab. Na het voorbereiden van stockbuffers en reagentia volgens het tekstprotocol, bereid voor elke pH-conditie om te testen, een detergensbuffer mastermix voor door negen milliliter een Molair natriumchloride, zes milliliter 10%NP40, 2,4 milliliter van de 25X proteaseremmer stock en negen milliliter tweemaal gedestilleerd water te mengen.

Pipet vervolgens voor elke pH-conditie 4,4 milliliter van de mastermix in een 50 milliliter conische buis. Voor pH-waarden boven 5,8, voeg 0,6 milliliter van de respectieve pH-aangepaste 500 milliMolar Tris stockoplossing toe aan de buis. Voor pH-waarden 5,8 en lager, voeg 0,6 milliliter van de respectieve pH-aangepaste 500 milliMolar MES stockoplossing toe.

Maak vijf milliliter bufferoplossing, bestaande uit 300 milliMolar natriumchloride, 2X proteaseremmer, 60 milliMolar Tris, aangepast naar pH 7,4, en tweemaal gedestilleerd water. Dit zal dienen als de detergensvrije controlegradiëntbuffer. Voeg vervolgens vijf milliliter van de 50%glycerol stock toe aan vijf milliliter van de detergensbevattende en detergensvrije buffermengsels, resulterend in zes verschillende 25%glycerol oplossingen.

Gebruik pH-strips om de pH-waarden te verifiëren. Bereid een 15%glyceroloplossing door een drie tot zeven verhouding van 50%glycerol stock met gedistilleerd water te mengen. Gebruik een vijf milliliter spuit en een naald om drie milliliter 15%glyceroloplossing toe te voegen aan zes ultraheldere centrifugatiebuizen.

Was de naald na elke stap in tweemaal gedestilleerd water. Gebruik een vijf milliliter spuit en een lange naald om voorzichtig 3,4 milliliter 25%glyceroloplossing onder de 15%glycerol laag te injecteren, zorg ervoor dat de twee lagen niet worden gemengd. Een interface tussen beide lagen is duidelijk zichtbaar.

Herhaal dit voor alle zes condities om te testen met de respectieve pH-aangepaste glyceroloplossingen. Vervolgens, in een Class II bioveiligheidskast, gebruik een milliliter opgehelderde, verdunde allantoische vloeistof, bevattend influenza A-virus, om de glycerolgradiënten voorzichtig te overleggen. Breng buizen over naar rotorbakken, balanceer tegenoverliggende buizen en plaats ze voorzichtig in een voorgekoelde SW-41 ultracentrifugeerrotor.

Centrifugeer bij 2100 rpm en 12 graden Celsius gedurende 150 minuten. Na de centrifugatie, gebruik een schone Pasteurpijp en een aspirator om voorzichtig beide glycerollagen te verwijderen. Vervolgens, met 40 milliliter 1X niet-reducerende LDS monsterbuffer, resuspendeer de pellet volledig door op en neer te pipetten voordat het monster wordt overgebracht naar een 1,5 milliliter microcentrifugeerbuisje.

Voer SDS-PAGE uit door alle monsters gedurende 10 minuten op 95 graden Celsius te verwarmen. Laad 20 microliter van de opgeloste pellets op een voorgegoten gradient Bis-Tris mini-gel en draai een uur bij 200 Volt in 1X MOPS SDS lopende buffer. Incubeer de gel een uur in fixatieoplossing.

Spoel een tot twee keer met water en kleur de gel overnacht in een 15 centimeter celcultuurschaal met een voldoende volume colloïdaal Coomassie-oplossing terwijl u voorzichtig schudt bij kamertemperatuur. Ontkleur de gel in tweemaal gedestilleerd water, vervang de vloeistof elke 15 tot 20 minuten totdat de gel achtergrond helder wordt. Bewaar de gel in tweemaal gedestilleerd water bij vier graden Celsius totdat deze wordt gescand voor bandkwantificering.

Scan tenslotte de gel met hoge resolutie en gebruik commercieel verkrijgbare, op maat gemaakte software voor kwantificering van de intensiteit van de eiwitbanden. Trek het achtergrondsignaal af van een gebied dicht bij de respectieve banden en normaliseer de waarden naar de detergensvrije controlewaarden. In dit experiment werd X31 afgeleid van opgehelderde allantoische vloeistof onderworpen aan snelheidsgradiëntcentrifugatie bij pH-niveaus tussen 7,4 en 5,0 en geanalyseerd door SDS-PAGE.

Zonder detergens aanwezig in de gradiënt, worden intacte virionen gepelleteerd zoals weerspiegeld door het karakteristieke patroon van banden, vertegenwoordigend HA, NP en M1 in de Coomassie-gekleurde gel. Na toevoeging van NP40 aan de onderste glycerollaag, werd de virale envelop, inclusief HA, NA en M2, gesolubiliseerd en sedimenteerde de virale kern alleen in de pellet tijdens ultracentrifugering. Beginnend bij een pH onder 6,5, gaat M1 geleidelijk verloren uit de pelletfractie, waarbij een minimum wordt bereikt tussen pH 5,8 en pH 5,4.

Onder pH 5,8, werden vRNP's gedissocieerd en dus verloren uit de pellet. Uit de geanalyseerde eiwitbanden, werden twee verschillende pH-drempels voor ontmanteling van de M1-laag en dissociatie van vRNP-bundels onthuld, inclusief pH 6,5 en pH 5,8, respectievelijk. Bij het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat, afhankelijk van de specifieke influenza A-virusstam of mutant, verschillende ontmantelingseigenschappen kunnen worden waargenomen.

Na dit proces kunnen andere methoden zoals elektronenmicroscopie worden uitgevoerd om aanvullende inzichten te verkrijgen, zoals de structuur van geïsoleerde influenzaviruscapsiden.