Toepassingen van de single-probe: massaspectrometrie Imaging en Single Cell Analysis onder omgevingsomstandigheden

Het algemene doel van deze methode is om een microschaalbemonsteringsapparaat te creëren, de Single-probe, om levende enkele cellen te analyseren met behulp van massaspectrometrie onder omgevingscondities. En om massaspectrometriebeelden van biologische weefsels met hoge ruimtelijke resolutie uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in biologische en farmaceutische studies.

Zoals welke moleculen er aanwezig zijn in levende enkele cellen en hoe ze verdeeld zijn in weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de single-probe een multifunctioneel apparaat is dat kan worden gebruikt voor zowel analyse van levende enkele cellen als hoogwaardige massaspectrometriebeelden van weefsels onder omgevingscondities. Hoewel deze methode enkele cellen en weefsels kan analyseren, kan deze ook worden toegepast op andere systemen waar microschaalbemonstering wenselijk is, zoals spar-analyse van chemicaliën en levende microkolonies en biofilms.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Wei Rao, een postdoc uit mijn lab. Plaats een hele muisorgan van belang in het midden van een kleine plastic put. Dompel het orgaan onder in weefselinbeddingscompound tot een hoogte van ongeveer 10 mm.

Plaats de weefsels onmiddellijk in vloeibare stikstof voor flash-bevriezing. Om het muisweefseldeel voor te bereiden, neem het bevroren muisorgaan en ontdooi het tot 15 graden Celsius in een temperatuurgestuurde cryo-microtoom. Bevestig het weefsel op een stalen basis met ongeveer 500 microliter weefselinbeddingscompound en plaats het op een cryo-microtoom-snijbasis zodat de gewenste snijoriëntatie wordt gepresenteerd aan het mes.

Snijd het weefsel tot een dikte van 12 micron. Plaats vervolgens de gesneden weefselsnedes op polycarbonaat microscoopglazen en laat ze 30 minuten drogen bij kamertemperatuur. Verkrijg een celmonster, zoals 1 milliliter HeLa-celsuspensie, en voeg het toe aan 9 mL compleet celkweekmedium in een standaard 10 cm celkweekplaat.

Houd de cellen in cultuur bij 37 graden Celsius, met 5% CO2 gedurende twee tot drie dagen, totdat het groeioppervlak bedekt is met 70-80% op de celkweekplaat. Voer celpassage uit in de celkweekplaat. Om dit te doen, zuigt u het groeimedium af en spoelt u de cellen af met 5 mL van 1x fosfaatgebufferd zoutwater.

Verwijder het PBS met een steriele aspiratietip en incubeer de cellen met 2,5 mL trypsine gedurende ongeveer 5 minuten bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken van de kweekplaat. Stop de trypsine-activiteit door 7,5 mL compleet celkweekmedium toe te voegen en schud de cellen vervolgens gelijkmatig. Om de celmonsters voor te bereiden voor een enkelcel-massaspectrometrie, of SCMS-experiment, plaatst u eerst individuele micro-dekglasjes in de putten van een 12-puttenplaat.

Voeg vervolgens 1,8 mL celkweekmedium en 0,2 mL celsuspensie toe aan de put. Meng de cellen voorzichtig met milde beweging van de plaat voordat u ze in een omgeving van 5% CO2 bij 37 graden Celsius incubeert, gedurende ongeveer 24 uur. Om de behandeling van de gekweekte cellen uit te voeren, voegt u een oplossing van een geneesmiddel toe aan de 12-putten celkweekplaat.

Plaats de dubbele-boorloodsbuis in een lasermicropipet-trekker en trek een dubbele-boorloodstaf. Stel als startpunten de hitte in op 400, de gloeidraad op drie, de snelheid op 80, de vertraging op 150 en de trek op 250. Snijd de trektip zodat er ongeveer 5 mm ongetrokken dubbele-boorlooskapillaris overblijft aan de andere kant.

Snijd een 80 mm sectie van een gesmolten silicakapillaris als oplosmiddelvoorzienende capillair. Plaats vervolgens de capillair in een boor aan het platte uiteinde van de dubbele-boorloodstaf. Gebruik de vlam om een gesmolten silicakapillaris als nanoESI-emitter te trekken, snijd tot 7-10 mm lang en plaats deze in de andere boor aan het platte uiteinde van de dubbele-boorloodstaf.

Breng een minimale hoeveelheid UV-hardende hars aan op het platte uiteinde van de dubbele-boorloodstaf. Laat de hars stollen met behulp van een LED UV-lamp gedurende ongeveer 20 seconden, om de oplosmiddelvoorzienende capillair en de nanoESI-emitter vast te zetten. Snijd vervolgens een standaard microscoopglasplaat doormidden.

Plaats vervolgens de single-probe op een uiteinde van de glasplaat, zodat de nanoESI-emitter naar buiten wijst. Breng de gewone epoxy aan op de behuizing van de single-probe, zodat deze op de glasplaat wordt bevestigd voordat deze overnacht wordt verhard. Dit systeem omvat een aangepaste ionenbron-interfaceflens van de massaspectrometer en een aluminium optische plaat die is bevestigd met een USB-digitaal microscoop, miniatuur handmatige XYZ-translatietrap en het gemotoriseerde XYZ-translatietrap-systeem.

Pas de ionenbron-interfaceflens van de massaspectrometer aan en fabriceer de standaard van de digitale stereomicroscoop zoals beschreven in het tekstprotocol. Bevestig de aangepaste digitale stereomicroscoop, een USB-digitaal microscoop, een miniatuur handmatige XYZ-translatietrap met een flexibele klemmhouder en het gemotoriseerde XYZ-translatietrap-systeem aan de aluminium optische plaat. Gebruik de flexibele klemmhouder om de glasplaat met een single-probe vast te zetten.

Bevestig vervolgens de single-probe-opstelling aan de massaspectrometer. Pas de flexibele klemmhouder en de miniatuur XYZ-trap aan om de emitter van de single-probe voor de inlaat van de massaspectrometer te plaatsen. Ontdooi de monstersnede bij kamertemperatuur en plaats deze op het gemotoriseerde XYZ-translatietrap-systeem onder de single-probe.

Pas de monsterspositie aan door de coördinaten in de besturingssoftware te wijzigen. Gebruik een spuit om het bemonsteringsoplosmiddel met een geschikte snelheid te pompen. En breng vervolgens de ionisatiespanning toe.

Pas de hoogte van de single-probe aan zodat deze net boven het oppervlak