Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Het algemene doel van deze beeldvormingstechniek is het bewaken van fluctuaties in de luminale calciumgehaltes van het SR in reactie op calciummobiliserende middelen, specifiek in gladde spiercellen van het vaatstelsel. Deze methode kan nuttig zijn bij het op een directere wijze verduidelijken van de cellulaire calciumcyclus. Het is bijvoorbeeld zeer belangrijk om de relatie te kennen tussen ons calciumtransport in het sarcoplasmatisch reticulum en ER-stress.

Het voordeel van deze techniek is dat we het calcium in het lumen van het sarcoplasmatisch reticulum direct kunnen meten, in plaats van dit te moeten extrapoleren uit indirecte metingen van veranderingen in het cytoplasma. Gabriela Ziomek, een promovendus in mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Om deze procedure te starten, bereid een verdunning van 1:25 van het eiwitmengsel in DMEM voor.

Breng vervolgens 200 µL van het eiwitmengsel in DMEM over naar elke glazen bodemplaat van 35 mm om de binnenste glazen cirkel aan de bodem volledig te bedekken. Laat de platen gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur in de veiligheidskabinet staan. Verwarm ondertussen DMEM met 10% NCS tot 37 °C in een waterbad.

Verwijder daarna het DMEM uit de kweekfles met een glazen pipet. Was vervolgens de bodem van de fles met warme steriele PBS om de resterende DMEM-residuen te verwijderen. Om de gekweekte gladde spiercellen van de flesbodem los te maken, wordt de fles snel gewassen met één milliliter trypsine, waarna dit wordt verwijderd.

Voeg vervolgens nog een milliliter trypsine toe. Schud de kolf ongeveer 30 tot 60 seconden om ervoor te zorgen dat het enzym de gehele bodem van de kolf raakt voordat u deze verwijdert. Zodra de cellen met trypsine zijn losgemaakt, voegt u vers DMEM met 10 procent NCS toe aan de kolf om de trypsinereactie te stoppen.

Overbreng de resulterende celoplossing van de kolf naar een schone, gelabelde conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens één milliliter vers DMEM plus 10 procent NCS toe aan elke plaat die wordt voorbereid. Keer daarna de buis met de celoplossing voorzichtig meerdere keren om om eventuele pellets die zich hebben gevormd op te lossen.

Pipetteer het gewenste volume van de voorzichtig gemengde celoplossing in elke plaat. Draai vervolgens elke plaat grondig met de klok mee of tegen de klok in om een gelijkmatige verdeling van de cellen over het glas aan de bodem te garanderen. Het is noodzakelijk om voldoende cellen aan de plaat toe te voegen om ervoor te zorgen dat ze in de loop van de volgende 48 uur een voldoende hoge confluentie bereiken voor effectieve beeldvorming.

Nadat het medium en de celoplossing aan elke plaat zijn toegevoegd, worden de platen gedurende ten minste één uur geïncubeerd bij 37 °C met vijf procent koolstofdioxide om de cellen de gelegenheid te geven zich goed aan de glazen bodem te hechten. Controleer de platen onder een microscoop met intervallen van vijftien minuten totdat de cellen duidelijk zijn gehecht. Haal vervolgens het Adenoviras D1 SR-aliquot uit de opslag bij -80 °C en transporteer dit in een mobiel ijsbad naar de biologische veiligheidskabinet. Daarna.

Pipetteer de gewenste dosis gekoelde D one SR op elke plaat en incubeer de geïnfecteerde cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Voeg de volgende dag één ml vers DMEM plus tien procent NCS toe aan de cellen. Incubeer de platen vervolgens gedurende de nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C met vijf procent CO2.

Verwijder na een incubatie van één nacht het kweekmedium van de plaat. Was de kweekplaat drie keer met één milliliter warme fysiologische HEPES-PSS buffer. Voeg vervolgens direct voorafgaand aan de registratie één milliliter verse warme HEPES-PSS buffer toe.

Voer de initiële beeldvorming uit met de FRET SE-applicatie door de bijbehorende software van de confocale microscoop te openen. Zodra de applicatie is geopend, klikt u op het tabblad 'setup' om de gewenste experimentele instellingen aan te passen. Wijzig handmatig de kanaalinstellingen zodat de cellen opeenvolgend worden geëxciteerd bij 440 nanometer voor donor en FRET en bij 513 nanometer voor acceptor.

Stel vervolgens de emissiegolflengten in op 488 nanometer voor de donor en 535 nanometer voor FRET en de acceptor. Stel daarna de lichtintensiteit in op 15 procent transmissie met een excitatieblootstellingstijd van de cellen van 150 milliseconden en intervallen van 10 seconden tussen de blootstellingen. Stabiliseer vervolgens de plaat op de microscooptafel.

Gebruik de live-knop om de beeldresolutie te controleren. Pas de instellingen verder aan voor de gewenste resolutie. Maak onder het tabblad setup een afbeelding van het monster met de knop voor het vastleggen van afbeeldingen.

Ga nu naar het tabblad evaluatie en kies de geschikte methode om de FRET-efficiënties te berekenen voor de experimenten die worden uitgevoerd. Methode drie, die gebruikmaakt van ratiometrische berekening, wordt aanbevolen voor experimenten met Cameleons, zoals de D1SR-indicator. Schakel daarna over naar het tabblad grafiek om de geregistreerde intensiteitswaarden in een grafiek te bekijken.

Teken indien gewenst een ROI in de beeldviewer om de overeenkomstige gemiddelde intensiteit van dit interessegebied op de grafiek te observeren. Start de opname om gedurende ten minste drie minuten gegevens te verzamelen, zodat een stabiele basissignaalwaarde wordt gegarandeerd voordat het betreffende agens wordt geïntroduceerd. Voeg vervolgens een calcium-mobiliserend agens toe als middel om SR-calcium uit te putten, door dit direct in de plaat aan te brengen nabij het geregistreerde interessegebied.

Zet de opname voort gedurende de gewenste duur na de behandeling. Leg vervolgens de ratiometrische FRET-seriebeelden vast met een confocale geïnverteerde microscoop met behulp van de FRET SE-applicatie. Was in deze stap de kweekplaten met rat aortale gladde spiercellen drie keer met één milliliter warme fysiologische HEPES-PSS-buffer.

Meng vervolgens de indicator met één milliliter warme HEPES-PSS en breng dit aan op de kweekplaten. Incubeer de gladdespiercellen met de indicator gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder na een uur de indicator van de kweekplaat en was deze drie keer met één milliliter warme fysiologische HEPES-PSS buffer.

Voeg vervolgens vlak voor de opname één milliliter vers verwarmde HEPES-PSS-buffer toe. Leg seriële beelden vast met de confocale omgekeerde microscoop. Voeg daarna het calcium-mobiliserend middel toe om het calcium in het SR te putten en zet de opname voort gedurende de gewenste tijd na de behandeling.

Hier worden representatieve momentopnamen getoond van een gladde spiercel die is getransfecteerd met de D one SR-indicator, gebruikmakend van CFP-, FRET- en YFP-banddoorlaatfilters. Deze figuur toont de real-time pseudokleur-momentopnamen van gecultiveerde aortagladde spiercellen van ratten die zijn getransfecteerd met D one SR. Behandeling met 2 µM Thapsigargin vertoonde een afname in signaalintensiteit, wat wees op een significante daling van het calciumgehalte in het SR als gevolg van Thapsigargin-geïnduceerde calciumvrijgave. En deze grafiek toont het representatieve spoor voor de genormaliseerde D one SR-ratio in de gecultiveerde gladde spiercellen behandeld met 2 µM Thapsigargin, wat een significante daling in het SR-calcium bevestigde.

Hier zijn representatieve snapshots van gekweekte gladde spiercellen uit de aorta van ratten, geladen met een cytoplasmatische calciumindicator en behandeld met twee micromolair Thapsigargin. Zoals te zien is, veroorzaakt Thapsigargin een significante toename van de signaalintensiteit in het cytoplasma door de afgifte van calcium uit het SR. En deze grafiek toont een representatief verloop van de genormaliseerde Fluo four AM-ratio in de gekweekte gladde spiercellen die zijn behandeld met twee micromolair Thapsigargin. De weergegeven toename in het calciumsignaal wordt beschouwd als proportioneel aan de hoeveelheid calcium die uit het SR is vrijgekomen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in ongeveer 48 uur van begin tot eind worden voltooid.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de cellen onder de beschreven condities te houden om hun vitaliteit te waarborgen voorafgaand aan de transfectie met de calciumindicator. Na het bekijken van deze video zou u een duidelijk inzicht moeten hebben in hoe gekweekte cellen moeten worden voorbereid om de meting van lumenale SR-calciumniveaus mogelijk te maken met behulp van de D one SR-indicator.