Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Het algemene doel van deze procedure is om de impact van synaptische inputs op neuronale verwerking te manipuleren met behulp van microiontoforetische injecties van neuroactieve stoffen in wakker animals. Deze methode kan helpen om cruciale functionaliteiten binnen sensorische systemen te ontrafelen, zoals de rol van neurotransmitters en hun interactie bij sensorische stimuli en codering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de manipulatie van lokale synaptische inputs naar de tab mogelijk maakt en de studie van neuronale modulerende systemen toestaat zonder dat deze worden beïnvloed door anesthesie.

Hoewel dit protocol hier is uitgevoerd bij gefixeerde muizen, kan het ook worden toegepast bij andere zoogdieren, zoals vleermuizen, ratten of cavia's. Om deze procedure te starten, plaatst u de wolfraamdraden in een speciaal gebouwde uitlijningstool om ze te kunnen knippen. Bevestig de losse uiteinden van de draden voorzichtig met plakband en knip ze op de gewenste lengte.

Trek vervolgens voorzichtig aan de tape om de wolfraamdraden uit het uitlijningsinstrument te verwijderen. Zorg ervoor dat alle draden aan de tape bevestigd blijven. Rol de tape daarna op een gepolijste messing spindel en houd de draden stevig tegen de spindel aan, zodat er een goede elektrische verbinding ontstaat.

Sluit daarna de spindel aan op een motor van 5 RPM in het werkstation. De toegang tot de spindel staat onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het oppervlak van de etsoplossing. Dompel vervolgens één derde van de draden in de oplossing.

Dompel vervolgens een koolstofstafelektrode in het etsbad om het circuit te sluiten. Zet het werkstation aan zodat de spindel begint te roteren en stel de stroom die door de elektroden en de etsoplossing loopt in op 250 milliamps. Stop het etsen van de tips wanneer de stroom daalt tot 200 milliamps om de draadpunten tot zeer fijne punten te etsen.

Plaats nu een draad in een borosilicaatglazen capillair waarvan het onderste uiteinde is afgedicht met boetseerklei. Houd de pipet vast met behulp van een verwarmingsspoel en een opgehangen zuiger. Bevestig de met glas bedekte draad aan een objectglas voordat u deze onder de microscoop plaatst.

Stel de tip in en breng uw boorkraal in focus. Verhit de kraal vervolgens totdat deze licht smelt. Voer daarna ongeveer 10 tot 15 microns van de draadtip in en schakel de verwarmingspotentiometers uit.

Terwijl de kraal afkoelt, verwijdert u het glas van de punt van de elektrode om het wolfraam bloot te leggen. Stel de polar aan de juiste parameters in om een punt van ongeveer 15 millimeter te verkrijgen. Trek de capillair uit om twee pipetten te verkrijgen waarbij de punt is afgeschermd.

Bevestig een pole-pipet op een objectglas met boetseerklei en breek de punt af met een fijne schaar, een pincet of de platte zijde van een scalpel. Pas de hoek tussen de elektrode en de multi-barrel pipet licht aan om een betere hechting en een dunner geheel te verkrijgen. Lijn onder de microscoop de wolfraamelektrode zorgvuldig uit boven de punt van de multi-barrel pipet.

Zodra deze zijn uitgelijnd, wordt de elektrode naar beneden bewogen tot deze contact maakt met de multi-barrel. Plaats deze in de groef tussen de twee bovenste barrels en schuif de tip van de elektrode vervolgens zo ver dat deze 15 tot 20 micrometers uitsteekt voorbij de tip van de multi-barrel. Breng nu een kleine druppel lichtuithardende lijm aan op het ensemble van wolfraam en de multi-barrel, ongeveer 5 millimeters vanaf hun uiteinden.

Voorkom dat de lijm de uiteinden bereikt om verstopping van de kanalen in de multi-barrel te vermijden en hard de lijm uit met een blauwe LED-lamp. Plaats nu het geanestheseerde dier op een warmtedeken om de temperatuur op 38 °C te houden en stabiliseer de kop van het dier in een stereotaxisch frame met twee oorstaven en een beetstaf. Breng vervolgens ooggel aan om de ogen te beschermen. Scheer daarna de hoofdhuid en breng povidonjodium aan om de huid te desinfecteren. Maak met een scalpel een incisie langs de middellijn om de schedel bloot te leggen en retracteer het periosteum dat het pariëtale bot en het meer rostrale deel van de occipitale botten bedekt.

Breng vervolgens een dunne laag lichtuithardende lijm aan op de schedel en de basis van de hoofdpost. Wacht 10 seconden en plaats de hoofdpost over het rostrale gebied van de pariëtale beenderen langs de middellijn. Gebruik een blauwe lichtbron om de lijm 20 seconden lang uit te harden voor een effectieve hechting.

Boor vervolgens met een kleine boor twee gaten rondom en achter de basis van de hoofdpal. Plaats een horlogeschroefje in een geboord gat om als extra contactpunt tussen de schedel en de hoofdhouder te dienen. Draai de schroefjes anderhalve slag aan zodat ze stevig vastzitten en controleer met een pincet of ze niet loszitten.

Steek vervolgens de punt van de zilveren aardedraad in het derde gat en zorg ervoor dat deze contact maakt met de dura. Breng een kleine druppel waterbestendige cyanoacrylaatlijm aan om de draad aan de schedel te hechten. Breng daarna lichtuithardend composiet aan om de verbinding van de hoofdhouder met de schedel te verstevigen door de basis van de hoofdhouder, het onderste deel van de zilverdraad en de schroeven af te dekken.

Zorg ervoor dat u niet voorbij de lambda gaat om toegang te behouden tijdens de opname, en hard het composiet uit met een blauwe lichtbron. Trek vervolgens de spier aan de achterzijde van de nek terug, nabij de aanhechting aan de schedel. Boor met een kleine trepan een rond venster net onder de lambda-naad en lateraal van de middellijn om de colliculus inferior bloot te leggen.

Plaats bij deze procedure het lichaam van het dier in een speciaal vervaardigde, met schuim gevoerde fixatiehouder. Bevestig de hoofdondersteuning aan een houder die is bevestigd aan het stereotaxische frame. Dit is een geschikt moment om het dier een vloeibare beloning te geven.

Bedek vervolgens het lichaam van het dier met een katoenen deken en bevestig deze losjes met een plastic halve cilinder en plakband. Gebruik een spuit met een flexibele tip om de kanalen te vullen met de gekozen geneesmiddelen. Plaats de multi-barrel elektrode met behulp van de micromanipulator op de houder.

Plaats vervolgens in elke huls een niet-gecodeerde zilverdraad, zodat het ene uiteinde de oplossing raakt en het andere uiteinde toegankelijk is. Verbind daarna deze uiteinden met het microiontoforese-apparaat. Verbind vervolgens de positieve pool met het uiteinde van de wolfraamelektrode en de aardpool met de zilverdraad die de dura raakt.

Verplaats vervolgens de multi-barrel elektrode totdat de punt het oppervlak van de hersenen raakt. Breng warme steriele zoutoplossing aan om uitdroging van het hersenweefsel te voorkomen. Pas op dat moment een retentiestroom toe om lekkage van het geneesmiddel uit de punt van de barrel te vermijden terwijl er wordt gezocht naar single unit activity.

Neurale activiteit en iontophoretische toediening van gabazine registreren. Hier wordt het frequentieresponsgebied getoond van vier geregistreerde neuronen in de collliculus inferior vóór en tijdens de micro-iontophoretische injectie van gabazine. De zwarte kruisen geven de frequenties aan die zijn gekozen om te worden gepresenteerd als zeldzame en repetitieve geluiden.

Hier zijn de geaccumuleerde peristimulus-tijdhistogrammen van de neurale respons op alle frequenties en intensiteiten die werden gepresenteerd om het responsgebied te construeren vóór en tijdens de injectie van gabazine. De zwarte balken geven de geluidsduur aan. Hier zijn de dot-rasters van de spiking-respons op een paar frequenties, waarbij de zeldzame stimulus in het rood en de repetitieve stimulus in het blauw is weergegeven, vóór en tijdens de applicatie van gabazine.

De gearceerde achtergrond geeft de duur van de stimulus aan. Deze dot rasters tonen de responsen wanneer de relatieve kansen van de parafrequenties werden omgewisseld. Deze grafiek toont de responsen van een enkel neuron op zeven paren frequenties, gepresenteerd als het zeldzame en het repetitieve geluid vóór en tijdens de toediening van gabazine.

En deze grafiek toont de SSA-indexen van de neurale respons op zeldzame en repetitieve geluiden, gemeten vóór en tijdens de toediening van gabazine. Zodra de beschreven procedure onder de knie is, kunnen de specifieke parameters worden aangepast aan de neurale structuur en het type neuron van belang. Bij het uitvoeren van opnames bij dieren met hoofdfixatie is het cruciaal om te onthouden dat de opnametijd wordt bepaald en beperkt door de mate van habituatie van het dier, maar een belangrijk voordeel is dat meerdere opnamesessies gedurende verschillende dagen bij hetzelfde dier kunnen worden uitgevoerd, waardoor het aantal gebruikte dieren wordt geminimaliseerd.

Door microiontoforese uit te voeren met piggy-back elektroden kunnen andere procedures, zoals injecties van neurale transistoren, worden gecombineerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de bron van input en het projectiedoel van neuronen binnen de registratieplaats. Een kritiek punt bij het werken met wakkerte dieren is hun welzijn; overschrijd daarom nooit de hoeveelheid recall-tijd die in uw protocol is goedgekeurd en monitor constant om elk teken van ongemak te controleren. Indien dit het geval is, dient u de registratie onmiddellijk te stoppen.