Een methode te richten en te isoleren Airway-innerveren sensorische neuronen in Muizen

Het algemene doel van dit experiment is om de luchtweg-innerverende nodose neuronen van de nervus vagus te labelen en te isoleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de perifere neurobiologie, zoals: welke identificerende eigenschappen bezitten luchtweg-innerverende neuronen?

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een robuuste methode met een hoge doorvoercapaciteit biedt voor het targeten en isoleren van specifieke neuronale populaties. Aspireer na het oogsten van de sensorische ganglia 500 µL dissociatieoplossing voor ganglia uit elke buis, zonder de ganglia te verstoren. Voeg vervolgens één milliliter PBS toe aan elk monster en wacht tot de ganglia naar de bodem van de buizen zijn gezakt.

Verwijder vervolgens de PBS en voeg één milliliter ganglia-dissociatieoplossing, aangevuld met het verteringsenzym, toe aan de neuronen, gevolgd door de toevoeging van 20 µL Fast Blue aan de buis met de positieve controle. Incubeer de buizen bij 37 °C gedurende de juiste tijd, afhankelijk van de ouderdom van het verteringsenzym. Schud en tik de buizen elke 15 minuten kort aan om ervoor te zorgen dat de ganglia bedekt zijn door de verteringsoplossing.

Terwijl de zenuwcellen worden gedigesteerd, voegt u langzaam en voorzichtig 400 µL vers bereide 12% dichtheidsoplossing toe bovenop 400 µL 28% dichtheidsoplossing in één 1,5 mL buis per monster. Er moeten twee duidelijke lagen zichtbaar zijn, waarvan één donkerder is dan de andere. Label vervolgens de 1,5 mL opvangkolfjes voor de sortering, inclusief één Fast Blue-positieve en één Fast Blue-negatieve buis per sorteermonster.

Aan het einde van de digestieperiode wordt het digestie-enzym weggegooid en worden de ganglia twee keer gewassen met één milliliter PBS, zoals zojuist gedemonstreerd. Voeg na de tweede wasbeurt 200 µL verse ganglia-dissociatieoplossing toe aan elke buis. Pipetteer vervolgens de ganglia met een 200 µL pipette, ingesteld op een volume van 100 µL, meerdere keren op en neer om de cellen te dissociëren tot een enkelcellige suspensie, waarbij u er goed op let dat er geen bellen ontstaan.

Wanneer er geen intacte weefselstukjes meer zichtbaar zijn, pipetteert u de gedissocieerde celoplossing in het midden van een 70 micron cell strainer die u stevig in één hand vasthoudt. Was vervolgens de dissociatiebuis met 100 microliters verse ganglia-dissociatieoplossing om eventuele extra cellen op te vangen. Filtreer het wasmiddel door de strainer en gebruik een nieuwe pipetpunt om alle resterende celbevattende oplossing aan de onderzijde van de strainer op te zuigen en voeg dit toe aan de celsuspensie.

Breng nu voorzichtig alle 300 µL van de cellen in lagen aan bovenop de eerder bereide dichtheidsgradiënt. Verzamel de ganglioncellen door middel van centrifugatie. Terwijl de cellen centrifugeren, voegt u 300 µL vers bereide lysisbuffer toe aan de opvangbuis voor Fast Blue-positieve cellen en 600 µL lysisbuffer aan de opvangbuis voor negatieve cellen, om te voorkomen dat de sheath-vloeistof van de sortering de lysisbuffer significant verdunt.

Verwijder na afloop van de centrifugatie voorzichtig de bovenste 700 microliters van de oplossing die het grootste deel van het celpuin bevat. Meng vervolgens 700 microliters verse ganglia-dissociatieoplossing met de resterende cellen. Pelleteer de cellen door centrifugatie en verwijder voorzichtig het supernatant.

Resuspendeer de cellen vervolgens in 200 tot 300 µL van de dissociatieoplossing voor het sorteren van ganglia met een 1.000 µL pipette ingesteld op 200 µL. Plaats de cellen op ijs tot ze klaar zijn voor het sorteren. Homogeniseer na het zuiveren van de gangliacellen via FACS de neuronen gedurende één minuut in lysisbuffer met behulp van een vortex.

Meng vervolgens de cellen meerdere keren met één volume 70% ethanol en breng tot 700 µL van de monsterinhoud over naar een spincolumn. Centrifugeer de column 15 seconden bij 8.000 x g in een microcentrifuge en gooi het doorstroomvolume weg. Wanneer het volledige monster door de spincolumn is gelopen, wordt het RNA geëxtraheerd volgens standaard RNA-purificatieprotocollen.

Gebruik vervolgens een microfluïdisch elektroforesesysteem om de RNA-kwaliteit te testen volgens de specificaties van de fabrikant. In deze grafieken worden de negatieve en positieve Fast Blue-controles getoond die zijn gebruikt om de sorteerpoorten in te stellen. De gedissocieerde Fast Blue-gelabelde nodose cellen kunnen vervolgens worden gesorteerd in Fast Blue-positieve en Fast Blue-negatieve populaties.

De sorteerefficiëntie voor deze methode is 73 tot 85%, waarbij gemiddeld ongeveer 1.500 of minder Fast Blue-positieve en bijna 60.000 Fast Blue-negatieve cellen worden verzameld. Zoals waargenomen voor deze representatieve monster, kunnen de 18S- en 28S-pieken die met microfluïdische elektroforese zijn verkregen, vervolgens worden gebruikt om het RNA-integriteitsgetal te berekenen om de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA te bepalen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier en een half uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de stappen snel door te lopen en vers bereide oplossingen te gebruiken voor de RNA-extractie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals neuronale kweek, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke functionele eigenschappen uniek zijn voor neuronen die de luchtwegen innerveren. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers op het gebied van perifere neurobiologie de unieke eigenschappen verkennen van een specifieke populatie luchtweg-innerverende neuronen in de nodose ganglia van de nervus vagus.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u specifieke neuronen van de nodose ganglia kunt labelen en dissocieren, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor RNA-sequencing of kunnen worden uitgeplaat voor functionele studies. Vergeet niet dat werken met 2-mercaptoethanol uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en het werken in een chemische zuurkast bij het gebruik van deze verbinding.