Name: Een methode te richten en te isoleren Airway-innerveren sensorische neuronen in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer een methode om luchtweg-innervatie nodose neuronen van de nervus vagus te labelen en isoleren bij muizen. Deze techniek biedt een robuuste en hoogdoorvoetsmethode voor het bestuderen van perifere neurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door NIH-subsidie ​​R01HL105635 te SEJ. De auteurs willen graag bedanken Diego V. Bohórquez voor technisch advies. We danken ook R. Ian Cumming voor technische bijstand en het uitvoeren van de flowcytometrie in het Duke Human Vaccin Instituut Onderzoek flowcytometrie Shared Resource Facility (Durham, NC). Flowcytometrie werd uitgevoerd in het Regionaal Biocontainment Laboratory van Duke, die gedeeltelijke ondersteuning voor de bouw van de National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) ontvangen.

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Duke University. 1. intranasale toediening van Fast Blue Voor Fast Blue, het beheer van de kleurstof ten minste 2 dagen voor euthanasie de muis. De kleurstof zal aanhouden tot acht weken. <ol><li> Verdoven van de muis met licht inhalatie-anesthesie (2,5% sevofluraan) tot ademhaling begint te vertragen. </li><li> Gebruik een 200 ul pipet met gefilterd tips langzaam druppelen 40 pl kleurstofoplossing (0,4 mM Fast Blue, 1% dimethylsulfoxide, DMSO, in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) in het neusgat, pauzeren soms de muis waarborgen wordt aanzuigen de oplossing (Figuur 1A). </li><li> Houd de muis verticaal, hoofd omhoog, en zachtjes masseren van de borst te zorgen voor de kleurstof verspreidt door de longen. </li></ol> 2. Voorbereidingen op Dissection and Analysis Day <ol><li> Bereid 10 ml0; Ganglia Dissociatie Solution (GADS) door het combineren van de bestanddelen zoals gespecificeerd in Tabel 1. </li><li> RNA-extractie uit te voeren in een speciale lab omgeving. Voor het begin van het experiment te reinigen oppervlakken met 70% ethanol, 10% bleekmiddel en RNase decontaminatie reagens. Dit omvat de RNA-centrifuge, elke tube racks, en pipetten. Zorg ervoor dat er speciale filter tip dozen voor slechts RNA gebruik. Gebruik deze apparatuur en het gebied niet voor DNA voorbereiding, omdat dit de monsters verontreinigen. </li><li> Meng verse 70%, en 80% ethanol met RNase-vrij water. Bereid 1 ml per monster voor gebruik in RNA-extractie. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediënt </td><td> Bedrag </td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM / f12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutamine </td><td> 100 gl </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 gl </td></tr><tr><td> N2 supplement </td><td> 100 gl </td></tr><tr><td> B27 (geen vitamine A) </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 gl </td></tr></tbody></table> Tabel 1. mengsel van reagentia voor ganglia Dissociatie Solution (GADS). 3. Dissection Procedure <ol><li> Vul 1,5 ml buizen met 500 ul GADS, een voor elke experimentele monster, een voor een positieve sorterend controlesignaal en een voor een negatieve sorterend controlesignaal. Store buizen op ijs gedurende dissectie. </li><li> Ontleden de knobbelige ganglion en maak twee gedeeltelijke bezuinigingen op dissociatie te vergemakkelijken, zet het dan in de experimentele monsterbuis. Raadpleeg de volgende Jove protocol voor dissectie van de nodose ganglia 16 en DRG 17. </li><li> Ontleden en gedeeltelijk ongelabelde ganglia, zoals de dorsale wortel ganglia (DRG) gesneden, het sorteren controles. Gebruik twee ganglia voor de positieve controle en twee Ganglieen voor de negatieve controle. </li><li> Om voldoende nodose neuronen voor een succesvolle sortering te verkrijgen, te combineren ganglia van 5 muizen in een experimentele monster buis met gads. </li></ol> 4. Sensorische ganglia Dissociatie <ol><li> Pipet uit 500 ul Gads, waardoor ganglia in de buis. Was ganglia eens door toevoeging van 1 ml PBS, wacht ganglia om zich te vestigen op de bodem van de buis, dan pipet uit PBS. </li><li> Voeg 1 ml GADS en 22 ul enzym digestie (collagenase I / II en protease mix, 2,5 mg / ml in H2O) aan elke buis. </li><li> Voeg 20 ul Fast Blue (5,26 mM) aan de positieve controle buis. </li><li> Zet de buizen in een waterbad of verwarmingsblok reeds bij 37 ° C. Opmerking: De tijd van ganglia digestie afhankelijk van de leeftijd van de spijsvertering enzym. Binnen 1 maand na oplossen van het enzym digestie, verteren 30 min, binnen 2-6 maanden verteren 45 min. Als het enzym dan 6 maanden oud, verteren ganglia fof 60 min. </li><li> Elke 15 min schudden buizen kort en flick ze ganglia zorgen, worden gedekt door de oplossing. </li><li> Terwijl ganglia worden verteerd, bereid dichtheidsgradiënten met een deeltjes- oplossing (colloïdale silicadeeltjes bekleed met polyvinylpyrrolidon). <ol><li> Meng 12% deeltje oplossing Gads, 500 ul per monster. </li><li> Meng 28% deeltje oplossing Gads, 500 ul per monster. </li><li> Langzaam en voorzichtig voeg 400 ul 12% geconcentreerde oplossing boven 400 ul 28% &#39;s oplossing dichtheid in een nieuwe 1,5 ml buis voor elk monster. Sta niet toe dat de twee lagen te mengen. Twee verschillende lagen moet zichtbaar zijn in de buis; een donkerder dan de andere. </li></ol></li><li> Terwijl ganglia worden verteerd, labelen nieuwe 1,5 ml collectie buizen voor het sorteren van (een Fast Blue positieve en één Fast Blue negatief buis per sorteren monster). Afhankelijk van de sorteerinrichting eisen moeten deze buizen afneembare deksels zodat niet interferE met de cel sorter. </li><li> Na de juiste spijsvertering tijd, verwijder gads bij de spijsvertering enzym en wassen ganglia tweemaal met 1 ml PBS. Voeg 200 ul vers GADS aan elke buis. </li><li> Gebruik een pipet 200 ul, ingesteld op 100 gl volume en ganglia pipet op en neer meerdere malen cellen splitsen. Herhaal dit totdat er geen intact stukje weefsel wordt gezien. Vermijd het creëren van bubbels in de oplossing. </li><li> Pass gescheiden cellen door een 70 um cel zeef. </li><li> Voeg nog een 100 ul gads naar de originele dissociatie buis te halen eventuele resterende verdwaalde cellen links en laat de extra oplossing door de cel zeef. Met behulp van een nieuwe pipet tip, het verzamelen van alle resterende-cel met vloeistof die door de zeef is gepasseerd en klampte zich vast aan het gaas. Het eindvolume van de cellen gesuspendeerd in 300 pl GADS. </li><li> laag voorzichtig 300 ul van cellen bovenop de eerder dichtheidsgradiënt. Vermijd bubbels en mengen van cells met de dichtheid lagen. </li><li> Centrifugeer 10 minuten bij 2900 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Terwijl cellen in de centrifuge, meng lysis buffer (1 ml per experimentele monster) als volgt: 10 pl 2-mercaptoethanol in 1 ml buffer RLT (van RNA extractie kit). <ol><li> Voeg 300 ul lysisbuffer naar Fast Blue positieve verzameling buis en 600 pi naar Fast Blue negatieve collectie buis (buizen label uit stap 4.7). Dit volume hangt af van het aantal cellen verwachting te ontvangen. Voor &lt;2.000 cellen, voeg 300 ul, voor&gt; 7000 cellen toe te voegen 600 ul. Dit zal de sortering sheath vloeistof niet significant Verdun de lysisbuffer. </li></ol></li><li> Zodra centrifugeren is voltooid, verwijder voorzichtig en gooi de top 700 ul laag. Deze laag bevat de meeste celresten die anderszins verstoren celsortering. </li><li> Voeg 700 ul vers gads om de resterende cel bevattende oplossing en pipette boven en beneden een paar keer om te mengen. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2900 xg om de cellen te pelleteren. </li><li> Terwijl cellen in de centrifuge, meng sorteren GADS (500 ul per monster) door het toevoegen van 5 gl DNase (10 mg / ml) tot 1 ml GADS. </li><li> Zodra centrifugeren wordt gedaan, verwijder voorzichtig en gooi supernatant, waardoor de cel pellet. </li><li> Resuspendeer celpellet in 200-300 gl sorteren gads door op en neer pipetteren met een pipet 1000 ul ingesteld op 200 gl meerdere malen. Leg monsters op het ijs. De cellen zijn nu klaar om te worden gesorteerd. </li></ol> 5. Fluorescentie Activated Cell (FAC) sorteren Opmerking: Dit gedeelte vereist operationele kennis van een FACS sorter of de hulp van geschoold personeel. <ol><li> Voeg 1 ul propidiumjodide (PI) voorraadoplossing (50 ug / ml) aan elk monster te testen voor cellevensvatbaarheid. Split negatieve controle in 2 tubes, één met PI en één zonder. PI bindt DNA alleen in dode cellen. Alsna de eerste soort is er geen dode cellen label, het gebruik van PI is niet noodzakelijk. </li><li> Transport cellen om flowcytometrie instrument, bijv., BD FACS AriaII loopt Diva 8-software, op ijs. </li><li> Omdat de cel grootte is variabel in deze populatie, gebruik maken van een groot mondstuk (100 pm) voor het sorteren. Om de hoeveelheid stress de cellen ervaring verlagen en de levensvatbaarheid van de cellen te gebruiken lage druk (20 psi). </li><li> Gebruik de FACS sorter software om de analyse percelen, voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing (SSC), Fast Blue en PI, indien nodig. </li><li> Om opnieuw te schorten cellen, zachtjes vortex het monster kort voordat deze in de sorter. </li><li> Begin met de negatieve controle, geen Fast Blauw of PI, de gate drempel (Figuur 2A) ingesteld. Dit zal de hoeveelheid autofluorescentie in de celpopulatie te bepalen. Optioneel: Voer het negatieve monster met PI vast te stellen of er sprake is van een populatie van dode cellen. </li><li> Sorteer de positieve controle monster (incubated met Fast Blue), een vergoeding parameters in te stellen. </li><li> Zodra de poorten en parameters zijn ingesteld, begint het sorteren van de proefmonsters. Monsters worden gesorteerd in de voorbereide verzamelbuizen bevattende RNA lysisbuffer. </li><li> Blijf gesorteerde monsters op ijs tot de celsortering voltooid. </li><li> Begin RNA-extractie stap onmiddellijk na de cellen worden gesorteerd. </li></ol> 6. RNA-extractie <ol><li> Vortex gesorteerd cellen in lysisbuffer gedurende 1 min gehomogeniseerd. </li><li> Voeg 1 volume van 70% ethanol en mix door en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> Transfer tot 700 ul van het monster op een spinkolom. Centrifugeer gedurende 15 seconden bij 8000 x g. Gooi het doorstroomkanaal. <ol><li> Herhaal dit tot het totale volume van het monster gecentrifugeerd kolom gevoerd. </li></ol></li><li> Voeg 350 ul Buffer RW1 verderspelen RNA zuiveringsproces, waaronder DNase behandelingsstap volgens protoco de fabrikantl voor cellen. </li><li> Zodra RNA werd geëxtraheerd, test de RNA kwaliteit met een microfluïdische elektroforese volgens specificaties van de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li>
<li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).</li>
<li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li>
<li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li>
<li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li>
<li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li>
<li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li>
<li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li>
<li>Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li>
<li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li>
<li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li>
<li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li>
<li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+of+cold+receptors+%28TRPM8+and+TRPA1%29+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li>
<li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li>
<li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus%3A+A+comparison+of+Fast+Blue%2C+Fluoro-ruby%2C+Fluoro-emerald%2C+Fluoro-Gold+and+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li>
<li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782(2013).</li>
<li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+-+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li>
<li>Kwong, K., Lee, L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE%282%29+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li>
<li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2%2F3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li>
<li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor luchtweg-zenuwcellen gericht in de nodose ganglia van de nervus vagus. Eenmaal gelabeld, worden de ganglia voorzichtig los om optimaal te behouden cel aantallen en de levensvatbaarheid. Deze neuronen zijn dan FAC gesorteerd direct in lysis buffer en RNA geëxtraheerd. De betekenis van dit protocol is de mogelijkheid te richten, isoleren en bewaren van de kwaliteit van een organoleptische celpopulatie. Genexpressie wordt in dit kleine populatie van neuronen en orgaan-specifieke f...

Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cellichamen van deze afferente neuronen zijn in sensorische ganglia, zoals de dorsale wortel, trigeminale of knobbelige ganglia. Elke sensorische ganglion innerveert specifieke gebieden van het lichaam en bevat cellen die afzonderlijke organen en weefsels innerveren binnen dat gebied. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen, terwijl de trigeminale ganglia liggen in de schedel, bevattende neuronen dat het gezicht, ogen, meninges of bovenste luchtwegen 1 innerveren, 2. De nodose ganglia van de vagus zenuw in de hals onder de schedel en bevat cellichamen die zenuwvezels uitstrekken door het gehele maagdarmkanaal, hart en onderste luchtwegen en longen 3. Bij mensen staat de knobbelige ganglion alleen is echter in de muis is gefuseerdde jugularis ganglion, die ook innerveert de longen 4. Deze gefuseerde ganglion wordt vaak de jugulaire / nodose complex vagale ganglion of gewoon knobbelige ganglion 5. Hier wordt aangeduid als de knobbelige ganglion. Afferente vezels van de nodose gegevens doorgeven van de ingewanden naar de kern van de solitaire zenuwvezelstreng (NTS) in de hersenstam. Zintuiglijke dit unieke ganglion stuurt een verscheidenheid aan functies, zoals darmmotiliteit 6, 7 hartslag, ademhaling 8,9 en irriterend geactiveerde respiratoire respons 10,11. Met deze verscheidenheid aan functies en geïnnerveerde organen, is het essentieel te richten en te isoleren orgaan-specifieke subpopulaties van de knobbelige ganglion om afzonderlijke zenuwbanen bestuderen. Echter, gezien de geringe omvang van de nodose en het beperkte aantal neuronen die het bevat dit is geen sinecure. Elke muis knobbelige ganglion bevat ongeveer 5.000 neuronen 12naast een uitgebreide populatie ondersteunen satellietcellen. Van de 5000 nodose neuronen, slechts 3-5% innervate de luchtwegen. Daarom is elke functionele, morfologische of moleculaire veranderingen binnen de luchtweg-zenuwcellen, als gevolg van respiratoire stimulatie of pathologieën, gaan verloren in de dicht op elkaar gepakte knobbelige ganglion. Om dit probleem op te lossen, werd een werkwijze ontwikkeld voor het identificeren en isoleren van neuronen die de luchtwegen innerveren. De luchtwegen werden blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof de volgende innerverende nodose neuronen te identificeren. Fast Blue werd opgepikt door neuronen en reist snel hun cellichamen waar het wordt bewaard tot acht weken 13-15. Eenmaal geïdentificeerd, een zachte, maar efficiënte, dissociatie protocol werd gebruikt om kleurstof etikettering en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden voor fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sorteren. Gesorteerde cellen worden gebruikt om hoge kwaliteit ribonucleïnezuur (RNA) extract genexpressie of f bepalenof andere stroomafwaartse moleculaire analyse. Dit protocol biedt een nuttige en robuuste techniek voor het isoleren van sensorische neuronen die een weefsel van belang innerveren.

<table><tbody><tr><td>Fast Blue</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>voorraad 2 mg/ml in water</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca en Mg vrij</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamine (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (geen vitamine A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>voorraad 50 &micro;g/ml in PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>digestie-enzym, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>voorraad 2,5 mg/ml in water</td></tr><tr><td>deeltjesoplossing (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsblok</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m celzeef</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrij water</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase decontaminatiereagens, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>RNA-extractiekit, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>DNase-kit, RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>voorraad 10 mg/ml in 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Jodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>voorraad 10 &micro;g/ml in PBS</td></tr><tr><td>Microfluidic elektroforesesysteem (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een methode te richten en te isoleren airway-innerveren sensorische neuronen in muizen

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cel lichamen van deze afferente neuronen bevinden zich in de sensorische ganglia. Sensorische ganglia innerveren een specifiek orgaan of deel van het lichaam. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen. De nervus ganglia bevinden zich in de schedel en innerveren het gezicht, en de bovenste luchtwegen. Vagale afferente vezels van de nodose ganglia zich over de gehele darmen, hart en longen. De nodose neuronen onder controle van een divers scala aan functies, zoals: ademhaling, irritatie van luchtwegen en hoest reflexen. Zo begrijpen en hun functie te manipuleren, is het essentieel om de luchtwegen specifieke neuronale subpopulaties identificeren en te isoleren. Bij de muis, worden de luchtwegen blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof, Fast Blue voor retrograde traceren van luchtweg-specifieke nodosus neurons. De nodose ganglia worden gescheiden en fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sortering wordt gebruikt om kleurstof positieve cellen te verzamelen. Vervolgens wordt hoogwaardige ribonucleïnezuur (RNA) geëxtraheerd uit kleurstof positieve cellen voor de volgende generatie sequencing. Deze methode luchtwegen specifieke neuronale genexpressie bepaald.

Met deze methode wordt luchtweg-zenuwcellen gemerkt door intranasaal indruppelen Fast Blue (Figuur 1A). Na twee dagen, Fast Blue gemerkte cellen blijken in het nodose ganglia (Figuur 1C). Deze cellen maken op een 3 - 5% van de totale bevolking van de neuronale nodose ganglia. Andere retrograde kleurstoffen die zijn gebruikt voor dit doel omvatten Dil (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchloraat) en Fluorogold. Lung bl...

Organspecifieke sensorische neuronen zijn moeilijk te identificeren. Fast Blue tracing wordt gebruikt om nodose neuronen die de luchtwegen innerveren te identificeren voor celsortering. Gesorteerde nodose neuronen worden gebruikt om hoogwaardig ribonucleïnezuur (RNA) te extraheren voor sequencing. Met behulp van dit protocol wordt de genexpressie van specifieke luchtwegneuronen bepaald.

Een methode te richten en te isoleren Airway-innerveren sensorische neuronen in Muizen

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

Het algemene doel van dit experiment is om de luchtweg-innerverende nodose neuronen van de nervus vagus te labelen en te isoleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de perifere neurobiologie, zoals: welke identificerende eigenschappen bezitten luchtweg-innerverende neuronen?Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een robuuste methode met een hoge doorvoercapaciteit biedt voor het targeten en isoleren van specifieke neuronale populaties. Aspireer na het oogsten van de sensorische ganglia 500 µL dissociatieoplossing voor ganglia uit elke buis, zonder de ganglia te verstoren. Voeg vervolgens één milliliter PBS toe aan elk monster en wacht tot de ganglia naar de bodem van de buizen zijn gezakt.Verwijder vervolgens de PBS en voeg één milliliter ganglia-dissociatieoplossing, aangevuld met het verteringsenzym, toe aan de neuronen, gevolgd door de toevoeging van 20 µL Fast Blue aan de buis met de positieve controle. Incubeer de buizen bij 37 °C gedurende de juiste tijd, afhankelijk van de ouderdom van het verteringsenzym. Schud en tik de buizen elke 15 minuten kort aan om ervoor te zorgen dat de ganglia bedekt zijn door de verteringsoplossing.Terwijl de zenuwcellen worden gedigesteerd, voegt u langzaam en voorzichtig 400 µL vers bereide 12% dichtheidsoplossing toe bovenop 400 µL 28% dichtheidsoplossing in één 1,5 mL buis per monster. Er moeten twee duidelijke lagen zichtbaar zijn, waarvan één donkerder is dan de andere. Label vervolgens de 1,5 mL opvangkolfjes voor de sortering, inclusief één Fast Blue-positieve en één Fast Blue-negatieve buis per sorteermonster.Aan het einde van de digestieperiode wordt het digestie-enzym weggegooid en worden de ganglia twee keer gewassen met één milliliter PBS, zoals zojuist gedemonstreerd. Voeg na de tweede wasbeurt 200 µL verse ganglia-dissociatieoplossing toe aan elke buis. Pipetteer vervolgens de ganglia met een 200 µL pipette, ingesteld op een volume van 100 µL, meerdere keren op en neer om de cellen te dissociëren tot een enkelcellige suspensie, waarbij u er goed op let dat er geen bellen ontstaan.Wanneer er geen intacte weefselstukjes meer zichtbaar zijn, pipetteert u de gedissocieerde celoplossing in het midden van een 70 micron cell strainer die u stevig in één hand vasthoudt. Was vervolgens de dissociatiebuis met 100 microliters verse ganglia-dissociatieoplossing om eventuele extra cellen op te vangen. Filtreer het wasmiddel door de strainer en gebruik een nieuwe pipetpunt om alle resterende celbevattende oplossing aan de onderzijde van de strainer op te zuigen en voeg dit toe aan de celsuspensie.Breng nu voorzichtig alle 300 µL van de cellen in lagen aan bovenop de eerder bereide dichtheidsgradiënt. Verzamel de ganglioncellen door middel van centrifugatie. Terwijl de cellen centrifugeren, voegt u 300 µL vers bereide lysisbuffer toe aan de opvangbuis voor Fast Blue-positieve cellen en 600 µL lysisbuffer aan de opvangbuis voor negatieve cellen, om te voorkomen dat de sheath-vloeistof van de sortering de lysisbuffer significant verdunt.Verwijder na afloop van de centrifugatie voorzichtig de bovenste 700 microliters van de oplossing die het grootste deel van het celpuin bevat. Meng vervolgens 700 microliters verse ganglia-dissociatieoplossing met de resterende cellen. Pelleteer de cellen door centrifugatie en verwijder voorzichtig het supernatant.Resuspendeer de cellen vervolgens in 200 tot 300 µL van de dissociatieoplossing voor het sorteren van ganglia met een 1.000 µL pipette ingesteld op 200 µL. Plaats de cellen op ijs tot ze klaar zijn voor het sorteren. Homogeniseer na het zuiveren van de gangliacellen via FACS de neuronen gedurende één minuut in lysisbuffer met behulp van een vortex.Meng vervolgens de cellen meerdere keren met één volume 70% ethanol en breng tot 700 µL van de monsterinhoud over naar een spincolumn. Centrifugeer de column 15 seconden bij 8.000 x g in een microcentrifuge en gooi het doorstroomvolume weg. Wanneer het volledige monster door de spincolumn is gelopen, wordt het RNA geëxtraheerd volgens standaard RNA-purificatieprotocollen.Gebruik vervolgens een microfluïdisch elektroforesesysteem om de RNA-kwaliteit te testen volgens de specificaties van de fabrikant. In deze grafieken worden de negatieve en positieve Fast Blue-controles getoond die zijn gebruikt om de sorteerpoorten in te stellen. De gedissocieerde Fast Blue-gelabelde nodose cellen kunnen vervolgens worden gesorteerd in Fast Blue-positieve en Fast Blue-negatieve populaties.De sorteerefficiëntie voor deze methode is 73 tot 85%, waarbij gemiddeld ongeveer 1.500 of minder Fast Blue-positieve en bijna 60.000 Fast Blue-negatieve cellen worden verzameld. Zoals waargenomen voor deze representatieve monster, kunnen de 18S- en 28S-pieken die met microfluïdische elektroforese zijn verkregen, vervolgens worden gebruikt om het RNA-integriteitsgetal te berekenen om de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA te bepalen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier en een half uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de stappen snel door te lopen en vers bereide oplossingen te gebruiken voor de RNA-extractie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals neuronale kweek, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke functionele eigenschappen uniek zijn voor neuronen die de luchtwegen innerveren. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers op het gebied van perifere neurobiologie de unieke eigenschappen verkennen van een specifieke populatie luchtweg-innerverende neuronen in de nodose ganglia van de nervus vagus.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u specifieke neuronen van de nodose ganglia kunt labelen en dissocieren, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor RNA-sequencing of kunnen worden uitgeplaat voor functionele studies. Vergeet niet dat werken met 2-mercaptoethanol uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en het werken in een chemische zuurkast bij het gebruik van deze verbinding.

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Herhaalde metingen van knaagdieren respiratoire fysiologie en bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen wenselijk zijn, maar over het algemeen niet haalbaar. Hier beschrijven we een herhaalbare methode voor het mondeling intuberen muizen dat herhaalde metingen van de luchtwegen hyperreactiviteit en de bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen vergunningen.

Een reversibele, niet-invasieve methode voor Airway Resistance Metingen en bronchoalveolaire lavage Fluid Sampling in Muizen

We beschrijven de procedures voor de herhaalde toediening van remmers van muscarine-signalering naar de levator Auris longus (LAL) spier van jong volwassen muizen en voor de daaropvolgende immunokleuring van de neuromusculaire verbindingen (NMJs) in wholemounts. De LAL spier heeft unieke voordelen voor het openbaren...

Subcutane toediening van muscarine antagonisten en Triple-Immunokleuring van de Levator Auris longus in Muizen

This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

This video demonstrates electrophysiological recording of olfactory sensory neurons (OSNs) in mice using a perforated patch-clamp technique. The olfactory epithelium, containing OSNs with fluorophore-tagged odor receptors, is isolated from a mouse and secured in a recording chamber. A recording pipette is clamped to the dendritic knob of an OSN, and nystatin within the pipette perforates the membrane to form electrical connectivity with the cell. Finally, another pipette is used to deliver an...

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

We hebben een eenvoudige, betrouwbare en relatief goedkope methode voor endotracheale intubatie bij muizen via directe laryngoscopie behulp van een otoscoop met een 2,0 mm speculum ontwikkeld. Deze techniek is atraumatische en kan worden gebruikt voor herhaalde metingen in chronische experimenten. We vinden het superieur aan tracheostomie of eerder gerapporteerde niet-chirurgische technieken.

Luchtpijpintubatie in Muizen<em&gt; Via</em&gt; Directe laryngoscopie behulp van een otoscoop

We presenteren een chirurgisch protocol dat beschrijft hoe een snij- of verpletteringsaxotomie op de aangezichtszenuw bij de muis moet worden uitgevoerd. De axotomie van de aangezichtszenuw kan worden gebruikt om de fysiologische reactie op zenuwbeschadiging te bestuderen en therapeutische technieken te testen.

Facial Nerve axotomie in Muizen: een model om motoneuron Response to Injury Study

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Het doel van dit artikel is het beschrijven van een verfijnde methode van intubatie van de laboratoriummuis. De methode is niet-invasief en daarom ideaal voor studies die seriële controle van de ademhalingsfunctie en/of instillatie van behandelingen in de long vereisen.

Herhaalde Orotracheale intubatie bij muizen

Dit manuscript presenteert een protocol voor het chirurgisch verwijderen van de postganglionische lumbale sympathische neuronen van een muis. Deze procedure zal een groot aantal onderzoeken mogelijk maken die gericht zijn op het onderzoeken van de rol van sympathische innervatie in distale weefseldoelen.

Chirurgische lumbale sympathectomie bij muizen

Deze studie presenteert een chirurgische manipulatie om de T-DRG bloot te leggen bij verdoofde muizen voor in vivo calciumbeeldvorming, samen met synchrone ECG-opnames. Deze methode is een geavanceerd hulpmiddel voor het bestuderen van perifere elektrische zenuwstimulatie en thoracale viscerale orgaaninputs, evenals hun interacties op het primaire sensorische niveau.

In vivo thoracale dorsale wortelganglia (DRG) calciumbeeldvorming en ECG-registratie voor het bestuderen van perifere zenuwstimulatie

Deze studie stelde hoest- en niesmodellen bij muizen vast door specifieke stimuli toe te passen op de luchtpijp en de neusholte, en ontwikkelde een op audio gebaseerde methode om onderscheid te maken tussen hoesten en niezen van muizen door verschillen in hun akoestische signalen te analyseren.<br...

Precisie-inductie en onderscheid van hoest- en niesreflexen bij muizen

Leer een methode om luchtweg-innervatie nodose neuronen van de nervus vagus te labelen en isoleren bij muizen. Deze techniek biedt een robuuste en hoogdoorvoetsmethode voor het bestuderen van perifere neurobiologie.

Een methode te richten en te isoleren Airway-innerveren sensorische neuronen in Muizen

Meer video's verkennen