Name: Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer een methode voor selectief oogsten van marginating-hepatische leukocyten uit ratten- of muizenlevers via geforceerde perfusie. Deze techniek levert zuivere cellen uit de lever sinusoïden voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs en dit werk werden ondersteund door NIH/NCI-subsidie # R01CA172138 (aan SBE).

Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd bij Tel Aviv University. 1. Ratten Protocol <ol><li> voorbereidingen <ol><li> Bereid gehepariniseerde oplossing PBS (30 eenheden / ml) bij kamertemperatuur (KT) te gebruiken door toevoeging van 30 eenheden conserveermiddel heparine per ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x oplossing. Bereken 35 ml per dier. </li><li> Pass gehepariniseerde PBS door de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te verwijderen. </li><li> Steriliseren chirurgische instrumenten - 2 scharen, forceps afgestompte randen, 2 hemostats en tand-weefsel tang (autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling). </li></ol></li><li> Perfusie van de lever en de collectie van MH-leukocyten <ol><li> Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Uit voorzorg, plaats een 50 ml buis met een isofluraan-soaked pad rond de rat hoofd tot het openen van de borstholte. </li><li> Open de peritoneale en borstholte naar de lever en het hart-complex onmiddellijk bloot te leggen na het stoppen van de ademhaling. Vermijd bloeden door dit proces. <ol><li> In het bijzonder, beginnen de incisie in de onderbuik middellijn punt, zonder deze te beschadigen interne organen, en de vooruitgang naar beide zijden schuin in de richting van de ribben, snijden via hen borst holte levels. </li></ol></li><li> Binnen ongeveer een minuut, verzamel zoveel mogelijk bloed (~ 6 ml van een 250 g dier) vanaf het rechter ventrikel in een injectiespuit. </li><li> Klem de caudale vena cava met een hemostaat zo dicht mogelijk bij het hart, aan de collectie van het perfusaat mogelijk te maken. </li><li> Trek de darmen en buiten het dier het recht van de experimentator, om de poortader bloot te leggen. </li><li> Plaats een 25 G IV katheter, verbonden met een peristaltische pomp, in de poortader, zo staartvin mogelijk,maar rostraal van de milt ader. </li><li> Plaats een 25 G vlindernaald, verbonden met een 5 ml spuit, in de inferior vena cava, caudaal van de hemostaat. </li><li> Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 3 ml / min en voorzichtig laat de eerste ml perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed in de injectiespuit. Ga door tot het perfusaat kleur bochten bleke rode (ongeveer 5/3 ml). Merk op dat de kleur van de lever veranderen en ze lichtbruin. </li><li> Zonder stoppen van de peristaltische pomp, vervangt de 5 ml oogsten spuit met een 20 ml spuit oogsten en laat minstens 20 ml lever perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 4 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, en vacuüm dat is te sterk (die de naald kunnen verstoppen door middel van het instorten van de vena cava muren) te vermijden. </li><li> Perfusie beëindigen wanneer de kleur van de lever wordt lichtbruin. </li></ol></li><li> leukocyten Extraction <ol&gt; <li> Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg, 24 ° C. </li><li> Zuig het supernatant </li><li> Voeg 10 ml PBS, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de supernatant. Op basis van de studie doelen gebruiken voorbereiding zoals is, of extra zuiveringen (bv dichtheid-gradiënt scheiding) uit te voeren. <ol><li> In het bijzonder laag 4 ml perfusaat meer dan 4 ml van de dichtheid-gradiënt scheiding massa in een 50 cc polypropyleen centrifugebuis. Spin de buizen bij 754 xg, kamertemperatuur, gedurende 30 minuten met afbreken. </li><li> Het verkrijgen van de mononucleaire lagen aan de dichtheid-gradiënt scheiding-supernatant interface van door handmatige pipetteren, wassen in PBS, en invoegen in een 5 ml buis. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mouse Protocol <ol><li> voorbereidingen <ol><li> Bereid gehepariniseerde oplossing PBS (30 eenheden / ml) voor gebruik op kamertemperatuur (KT) door toevoeging van 30 eenheden conserveermiddel heparine per ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x solution. Bereken 20 ml per dier. </li><li> Pass gehepariniseerde PBS door de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te verwijderen. </li><li> Steriliseren chirurgische instrumenten - 2 scharen, forceps afgestompte randen, 2 hemostats en tand-weefsel tang (autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling). </li></ol></li><li> Perfusie van de lever en de collectie van MH-leukocyten <ol><li> Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Uit voorzorg, plaats een 15 ml buis met daarin een-isofluraan gedrenkte pad rond de muis hoofd tot het openen van de borstholte. </li><li> Bevestig de ledematen van de muis om een ​​bed. </li><li> Open de peritoneale en borstholte naar de lever en het hart-complex onmiddellijk na het stoppen van de ademhaling bloot te leggen, waardoor de lagere aspect van het membraan intact (het creëren van een drainerende borstholte zwembad). Vermijd bloeden door dit proces. <ol><li> Specifiek start de snede in de ondersteabdominale middellijn point, zonder deze te beschadigen interne organen, en de vooruitgang naar beide zijden schuin in de richting van de ribben, snijden via hen borst holte levels. </li></ol></li><li> Pullout de darmen en buiten het dier het recht van de experimentator, om de poortader bloot te leggen. </li><li> Plaats een 30 g naald, verbonden met een peristaltische pomp in de poortader rostraal van de milt ader. </li><li> Snijd de onderste vena cava boven het membraan afvoer en verzameling van het perfusaat uit de borstholte mogelijk. </li><li> Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 3 ml / min en voorzichtig laat de eerste 3 ml perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed uit de borstholte zwembad. </li><li> Gooi dit perfusaat. Herhaal dergelijke wassen opnieuw als nodig, met zoutoplossing en daarna pas het verzamelen van perfusaat lever. </li><li> Begint opnieuw perfusie aan een snelheid van 4 ml / min en 10 ml verzamelen van perfusaat uit de borstholte viaeen vlinder verbonden met een injectiespuit. </li><li> Perfusie beëindigen wanneer de kleur van de lever wordt lichtbruin. </li></ol></li><li> leukocyten Extraction <ol><li> Centrifugeer het perfusaat gedurende 10 min bij 400 x g. </li><li> Zuig het supernatant. </li><li> Voeg 10 ml PBS, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de supernatant basis studiedoelen Gebruik preparaat zoals is, of extra reinigingen (bijvoorbeeld dichtheidsgradiënt scheiding) voeren. <ol><li> In het bijzonder laag om de 4 ml perfusaat meer dan 4 ml van de dichtheid-gradiënt scheiding massa in een 50 cc polypropyleen centrifugebuis. Spin de buizen bij 754 xg, kamertemperatuur, gedurende 30 minuten met afbreken. </li><li> Het verkrijgen van de mononucleaire lagen aan de dichtheid-gradiënt scheiding-supernatant interface van door handmatige pipetteren, wassen in PBS, en invoegen in een 5 ml buis. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pit+cell%3A+description+of+a+new+type+of+cell+occurring+in+rat+liver+sinusoids+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood.</a> Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).</li>
<li>Vermijlen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+natural+killer+cells+exclusively+kill+splenic%2Fblood+natural+killer-resistant+tumor+cells+by+the+perforin%2Fgranzyme+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway.</a> J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).</li>
<li>Gao, B., Radaeva, S., Park, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+natural+killer+and+natural+killer+T+cells%3A+immunobiology+and+emerging+roles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases.</a> J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).</li>
<li>Kaneda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-associated+large+granular+lymphocytes%3A+morphological+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects.</a> Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).</li>
<li>Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+of+perforin+in+cytolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role of perforin in cytolysis?</a> Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).</li>
<li>Kamada, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+carboxypeptidase+and+tryptic+esterase+activities+that+are+complexed+to+proteoglycans+in+the+secretory+granules+of+human+cloned+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells.</a> J Immunol. 142, 609-615 (1989).</li>
<li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+function+of+pit+cells%2C+the+liver-specific+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells.</a> Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).</li>
<li>Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+granular+lymphocytes+or+%26%2334%3Bpit+cells%26%2334%3B+from+rat+liver%3A+isolation%2C+ultrastructural+characterization+and+natural+killer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Large granular lymphocytes or &#34;pit cells&#34; from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity.</a> Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).</li>
<li>Vanderkerken, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+differentiation+of+hepatic+natural+killer+cells+%28pit+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells).</a> Hepatology. 18, 919-925 (1993).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adhesion+molecules+in+the+recruitment+of+hepatic+natural+killer+cells+%28pit+cells%29+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver.</a> Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).</li>
<li>Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+and+lymphokine-activated+killer+cells+require+granzyme+B+for+the+rapid+induction+of+apoptosis+in+susceptible+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+LFA-1+in+hepatic+NK+cell+%28pit+cell%29-mediated+cytolysis+and+apoptosis+of+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells.</a> J Hepatol. 31, 110-116 (1999).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li>
<li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De lever perfusie methode die hierin maakt een selectief oogsten en het bestuderen van de unieke populatie van marginating lever leukocyten. Lever- NK-cellen, ook wel pit cellen 3, vormen een onderscheidende NK cel populatie die in de lever sinusoïden wonen. Ze zijn te vinden in ratten, muizen 17 en bij de mens 18,19. Vergeleken met geïsoleerde perifere NK cellen pitcelen aangetoond hogere cytotoxiciteit tegen YAC-1 en CC531s doelwitcellijnen 20, werden naar een groter aantal ...

De lever sinusoïden bevatten talrijke leukocyt subtypen van verschillende immuun activiteiten kritisch voor het organisme. Zo worden marginating lever (MH) natural killer (NK) cellen, ook bekend als pitcelen kenmerk morfologisch als grote granulaire lymfocyten (LGLs) en functioneel als leukocyten spontane cytotoxische capaciteit dat hepatische weerstand tegen de vestiging van bloed- gedragen tumor uitzaaiingen. Het doel van de werkwijze die hierin wordt selectief oogsten van MH leukocyten, om deze belangrijke en unieke celpopulatie (en immuuncompartiment) bestuderen inschakelen en het effect van verschillende manipulaties (bijv immuunactivatie) de volgende specifieke cellen te helderen. Ondanks het feit dat immuniteit voor een zich ontwikkelende primaire tumor te elimineren, bewijsmateriaal kankerpatiënten en diermodellen geven aan dat het immuunsysteem regelen circulerende tumorcellen, micrometastasen en residual disease gedugh-cel gemedieerde immuniteit (CMI). Er bestaat echter een duidelijke inconsistentie tussen de in vivo capaciteit en in vitro studies bij mensen en bij dieren die aantonen dat de meeste autologe tumorcellen resistent tegen cytotoxiciteit van circulerende leukocyten of milt 1,2. Deze inconsistentie kan worden toegeschreven, ten minste gedeeltelijk, om de in vivo er een afzonderlijke leukocyten subpopulatie, namelijk de marginating-lever (sinusoïden) leukocyten en de subpopulatie van geactiveerde NK-cellen, namelijk pitcelen 3. Inderdaad, ongepubliceerde gegevens uit ons laboratorium aangetoond dat in F344 ratten syngene tumorcellen (MADB106), die bestand zijn tegen circulerende leukocyten en milt werden gevonden, werden gelyseerd door MH-NK-cellen 4. Aldus kunnen tumorcellen die zogenaamd &quot;NK-resistent&quot; circulerende leukocyten worden gecontroleerd door MH-NK-cellen. Opmerkelijk, in muizen de verhoogde activiteit van de MH-NK is duidelijk alleen na in vivo immuunstimulatie (bijvoorbeeld door gebruikmaking van Poly I: C of CpG-C) 5. Lever-specifieke NK-cellen (MH-NK) bevinden zich binnen de sinusvormige lumen, die vastzit aan de endotheelcellen en Kupffer cellen. MH-NK-cellen uitsluitend gekenmerkt door dichte bolvormige korrels en-rod uitgeboord vesicles 6, waarbij zuurfosfatase als lysosomale enzymen en perforine en granzymen bevatten bioactieve stoffen 7,8. Vergeleken met circulerende NK-cellen, NK-MH-cellen vertonen een grotere en kleinere granules en blaasjes 9-11. Onder ontstekingsaandoeningen werden MH-NK-cellen aangetoond hogere expressie vertonen van LFA-1 12 ten opzichte van circulerende NK cellen. Deze verhoogde expressie kan een mechanisme waardoor MH-NK-cellen zijn cytotoxischer tegen sommige tumorcellen dan circulerende NK cellen 13,14 vormen. nterestingly, na in vitro incubatie met interleukine (IL) -2, MH-NK-cellen worden vergroot, enhet aantal en de grootte van de korrels te vergroten, die stroken met een fi le of lymfokine geactiveerde killercellen (LAK) cellen 15. Actieve MH leukocyten kan niet alleen worden verkregen door standaard lever leukocyten oogstmethodes, die gebaseerd zijn op het slijpen en biologische afbraak van het weefsel. Onze aanpak perfusie hierin beschreven heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van de standaard methoden. Ten eerste, de perfusie benadering oogst MH selectief leukocyten voorkomen van besmetting door andere leukocyten uit andere lever compartimenten. Ten tweede, de perfusie techniek beter behoudt de integriteit, de activiteit en de fysiologische milieu van MH leukocyten, anders dan het weefsel verwerking benaderingen die cellen beschadigen of hun morfologie te veranderen en door weefselbeschadiging, het induceren van de afgifte van verschillende factoren die duidelijk moduleren immuunsysteem activiteit. De lever is een belangrijk doelwit orgaan voor kanker metastase eennd voor verschillende infecties 16. Zoals MH cellen unieke kenmerken is het belangrijk om deze specifieke populatie onder verschillende omstandigheden te bestuderen met betrekking tot deze pathologieën. Zo is het waard op te merken dat systemische activering van het immuunsysteem door verschillende BRM (bijvoorbeeld poly I: C of CpG-C) bleken te activeren MH-leukocyten meer dan 5 circulerende leukocyten.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4"</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Blunted-edged forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selectief oogsten van marginating-lever leukocyten

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginerende-hepatische (MH) leukocyten (leukocyten die zich hechten aan de sinusoïden van de lever) bleken een unieke samenstelling en kenmerken te vertonen in vergelijking met leukocyten van andere immuuncompartimenten. Concreet wijzen bewijzen op een duidelijk pro- en anti-inflammatoir profiel van de MH-leukecytenpopulatie en een hogere cytotoxiciteit van leverspecifieke NK-cellen (namelijk pitcellen) in vergelijking met circulerende of splenische immuuncellen bij zowel muizen als ratten. De hier gepresenteerde methode maakt selectieve oogst van MH-leukocyten mogelijk door geforceerde perfusie van de lever bij muizen en ratten. In tegenstelling tot andere methoden die worden gebruikt om lever-leukocyten te extraheren, waaronder weefselvermaling en biologische afbraak, levert deze methode uitsluitend leukocyten op uit de lever-sinusoïden, onverhoeld door cellen uit andere levercompartimenten. Bovendien behoudt de perfusietechniek de integriteit en het fysiologische milieu van MH-leukocyten beter, waardoor bekende fysiologische reacties op weefselverwerking worden gespaard. Aangezien veel circulerende kwaadaardige cellen en geïnfecteerde cellen worden vastgehouden tijdens het passeren door de lever-sinusoïden, fysiek interactie hebbend met endotheelcellen en residente leukocyten, is de unieke MH-leukecytenpopulatie strategisch gelegen om te interageren, identificeren en reageren op afwijkende circulerende cellen. Daarom kan selectieve oogst van MH-leukocyten en hun studie onder verschillende omstandigheden onze begrip van de biologische en klinische betekenis van MH-leukocyten bevorderen, specifiek met betrekking tot circulerende afwijkende cellen en levergerelateerde ziekten en kankermetastasen.

In F344 ratten vergeleken we de cytotoxiciteit van MH-NK-cellen (vanuit de lever sinusoïden geforceerde leverperfusie) om cytotoxiciteit van de gehele lever celpopulatie na mechanisch malen van het leverweefsel, en de cytotoxiciteit van circulerende leukocyten. Alle celpreparaten werden ten minste 3 maal gewassen, zoals routine immunologische tests, en als doelwit cellijnen gebruikten we de allogene YAC-1 of syngene MADB106 doelwitcellijnen. Zoals aangegeven in figuren 1-...

Marginerende leverleukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we een methode voor selectieve oogst van deze specifieke levercelpopulatie, door geforceerde perfusie van de lever van ratten of muizen. Marginerende leverleukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de vatbaarheid voor levergerelateerde ziekten en metastasen.

Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Het algemene doel van deze procedure is om selectief marginerende hepatische leukocyten te oogsten, immuuncellen die hechten aan de sinusoïden van de lever, door middel van geforceerde perfusie van muizen- of rattenlevers. Deze methode maakt het mogelijk om hepatische leukocyten te bestuderen die unieke kenmerken en afwijkende immunologische functies vertonen in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het uitsluitend leukocyten uit de leversinusoïd oplevert, zonder contaminatie door cellen uit andere levercompartimenten zoals het parenchym.De procedure zal worden gedemonstreerd door Liat Sorski en Lee Shaashua, twee uitstekende promovendi uit mijn laboratorium. Spoel vóór het begin van de leverperfusieprocedure gheparineerde PBS door de lijnen van de peristaltische pomp en de vlindernaalden om eventuele luchtbellen te verwijderen. Maak vervolgens, direct na het stoppen van de ademhaling, met een steriele schaar en tandheelkundige pincetten een midline abdominale incisie vanaf de onderbuik van de geëuthanaseerde rat tot aan het xiphoid proces, waarbij u er zorg voor draagt de interne organen niet te beschadigen.Gebruik vervolgens de pincet om het borstbeen op te tillen en snijd voorzichtig het diafragma en de ribbenkast aan beide zijden door. Klem een hemostat op het borstbeen en vouw de ribbenkast rostral om het cardiopulmonaal complex bloot te leggen. Bereid daarna een 21 gauge vlindernaald voor die is aangesloten op een 10 milliliter spuit en voer deze in de rechterventrikel van het hart in.Gebruik vervolgens de spuit van 10 milliliter om zoveel mogelijk bloed op te vangen. Wanneer al het bloed is verzameld, gebruik dan een hemostat om de vena cava caudalis zo dicht mogelijk bij het hart af te klemmen. Verplaats daarna de darmen uit de buikholte naar de linkerzijde van het dier om de vena portae bloot te leggen.Bereid vervolgens een 25 gauge IV-katheter voor die is verbonden met de uitlaatleiding van de peristaltische pomp en breng deze zo caudaal mogelijk in de vena portae in, terwijl deze rostersaal ten opzichte van de vena lienis blijft. Maak daarna een 21 gauge vlindernaald klaar die is verbonden met een spuit van vijf milliliter en breng deze in de vena cava inferior in, caudaal van de hemostaat. Zet de peristaltische pomp aan met een snelheid van ongeveer drie milliliter per minuut en verzamel de eerste milliliters perfusaat die met bloed verontreinigd zijn in de spuit.Plaats de vijf milliliter opvangspuit samen met de 20 milliliter opvangspuit zonder de pomp te stoppen zodra het perfusaat een bleekrode kleur krijgt. Verzamel vervolgens ten minste 20 milliliter leverperfusaat met een snelheid van zeven milliliter per minuut. Beëindig de perfusie wanneer de gehele lever lichtbruin is.Centrifugeer vervolgens het perfusaat en aspireer het supernatant. Om marginerende hepatische leukocyten van de muis te verzamelen, maakt u onmiddellijk na het stoppen van de ademhaling met een steriele schaar en tandweefselpincet een midline abdominale incisie tot aan het xiphoid proces. Gebruik daarna de pincet om het sternum op te tillen en snijd voorzichtig het diafragma en de ribbenkast aan beide zijden door.Klem een hemostat op het borstbeen en vouw de borstkas rostral om het cardiopulmonale complex bloot te leggen. Verplaats de darmen buiten de buikholte naar links van het dier om de poortader bloot te leggen. Sluit vervolgens een naald van 30 gauge aan op een peristaltische pomp en voer deze in de poortader in, rostral van de miltader.Snijd de vena cava inferior boven het diafragma door om de afvoer en opvang van het perfusaat uit de borstholte mogelijk te maken. Zet vervolgens de peristaltische pomp aan met een snelheid van ongeveer three milliliters per minute en vang de eerste milliliters van het met bloed verontreinigde perfusaat op uit het reservoir in de borstholte. Wanneer drie milliliters zijn opgevangen, schakelt u de pomp uit.Plaats vervolgens een vlindernaald van 21 gauge die is verbonden met een spuit van 10 milliliter en hervat de perfusie met een snelheid van maximaal vier milliliter per minuut totdat er 10 milliliter perfusaat uit de borstholte is opgevangen. Beëindig de perfusie zodra de lever lichtbruin kleurt. Breng het perfusaat vervolgens over naar een buis van 15 milliliter.Centrifugeer het monster. Aspireer vervolgens het supernatant. Terwijl marginerende hepatische NK-cellen een uitgesproken cytotoxiciteit vertonen tegen allogene target-cellijnen, vertonen zowel de volledige levercelpopulatie als de circulerende leukocyten aanzienlijk lagere niveaus van cytotoxiciteit en vrijwel geen doding van een syngene target-cellijn.Dezelfde relatief lagere niveaus van cytotoxiciteit zijn zichtbaar wanneer mechanisch bewerkte levers worden gewassen en ondergaan aan dichtheidsgradiëntseparatie. Analyse van specifieke leukocytenpopulaties onthult diepgaande verschillen in de samenstelling van de immuuncelpopulaties uit de circulerende en de levercelcompartimenten. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele minuten worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kan de cel worden gebruikt voor flowcytometrie, PCR of andere methoden voor het karakteriseren van deze belangrijke leukocytenpopulatie. Deze techniek maakt de selectieve oogst van marginerende hepatische leukocyten mogelijk om ons begrip van het biologische en klinische belang te vergroten. In het bijzonder verwachten we hiermee circulerende aberrante cellen en levergerelateerde ziekten te kunnen beheersen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het verzamelen van migrerende hepatische leukocyten.

selective-harvesting-of-marginating-hepatic-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

This video describes a method for spatial separation of three leukemic cell subpopulations: the suspended leukemic cells freely floating in the media, phase bright leukemic cells adhered to the surface of the mesenchymal stromal cell monolayer, and the phase dim leukemic cells that have migrated beneath the mesenchymal stromal cell monolayer from 2D co-culture.

Leukemic Subpopulation Harvest: A Method for Spatial Separation of Leukemic Cell Subpopulations from 2D Co-culture

In this video, we demonstrate the isolation of marginating hepatic leukocytes from mouse liver by forced perfusion.

Isolation of Marginating Hepatic Leukocytes from a Mouse Liver

This video demonstrates the isolation of lymphocytes, including natural killer cells or NK cells, from human liver tissue for selective expansion. Enzymatic and mechanical digestion, followed by density gradient separation, promotes lymphocyte isolation, including NK cells. The collected lymphocytes can be further used for the selective expansion of NK cells.

Natural Killer Cell Isolation from Liver Tissue for Selective Expansion

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Marginale-pulmonale leukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we de selectieve oogst van deze subpopulatie van pulmonale leukocyten, door gedwongen perfusie van de longen bij ratten en muizen. Marginale-pulmonale leukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de gevoeligheid voor door bloed overgedragen en longgerelateerde ziekten.

Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten

Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.

Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie

Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC's), een recent geïdentificeerd intracraniaal celtype, hebben slecht begrepen functies. Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het oogsten van LLC's van muizen en het opzetten van in vitro primaire culturen. Dit protocol is ontworpen om onderzoekers in staat te stellen zich te verdiepen in de cellulaire functies en mogelijke klinische implicaties van LLC's.

Oogst en primaire kweek van leptomeningeale lymfatische endotheelcellen

Leer een methode voor selectief oogsten van marginating-hepatische leukocyten uit ratten- of muizenlevers via geforceerde perfusie. Deze techniek levert zuivere cellen uit de lever sinusoïden voor immunologisch onderzoek.

Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten

Meer video's verkennen