Differentiatie van atriale cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen Met behulp van de BMP Antagonist Grem2

Het algemene doel van dit differentiatieprotocol is om homogene populaties van atriale cardiomyocyten in cultuur te genereren. Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de studie van hartontwikkeling en hartziekten zoals atriale aritmie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het homogene culturen van atriale cardiomyocyten in vitro produceert en dat het kan worden gedaan met minimale training.

Tot vier dagen voordat de muis embryonale stamcel, of mESC-culturen, worden ingesteld, 10-centimeter weefselschotels met 5 milliliter 0,2% gelatine-oplossing elk, coderen in zes welplaten met 1 milliliter gelatine per wel in een gesteriliseerde weefselcultuurhood. Op de dag van de cultuur, verwijder de extra gelatine-oplossing, en voeg 10 milliliter medium toe aan een van de gelatine-gecoate 10-centimeter schotels. Gebruik vervolgens cryotongs om voorzichtig een fles van 1 maal 10 tot de 6 mESC's in een 37-graad Celsius waterbad te draaien totdat er slechts een kleine ijskristall in het midden van de fles overblijft.

Droog de fles met een wegwerpbare, pluisvrije doek en steriliseer het met 70% ethanol. Plaats vervolgens de fles in de weefselcultuurhood en gebruik een P1000 pipet om de ESC's aan de schotel toe te voegen. Plaats de cellen in een 37-graad Celsius bevochtigde celcultuur incubator met 5% koolstofdioxide, en beweeg de plaat voorzichtig van voor naar achteren en van links naar rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen.

Aan het einde van de incubatie, gebruik een brightfield microscoop om de celanhechtenis te bevestigen. Sommige puinhopen en dode cellen zullen worden waargenomen. Vervang het medium met 10 milliliter vers mESC medium, en breng de cellen terug naar de incubator.

Wanneer de cultuur 60 tot 70% conflueert, spoel de plaat met 5 milliliter steriele DPBS zonder magnesium en calcium, en incubeer de cellen in 2 milliliter trypsine EDTA bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Terwijl de cellen incuberen, aspireer de overtollige gelatine-oplossing uit een nieuwe 10-centimeter schotel per gepassageerde cultuur, en voeg 10 milliliter medium toe aan elke plaat. Verzamel vervolgens de losgekoppelde cellen door centrifugatie in een 15 milliliter buis, en re-suspendeer het pellet in 10 milliliter mESC medium.

Afhankelijk van de gewenste splitsingsverhouding, voeg 0,5 tot 1 milliliter celsuspensie toe aan elke 10 centimeter schotel en breng de cellen terug naar de incubator, de cellen voorzichtig verdeelend in elke schotel zoals zojuist is gedemonstreerd. Wanneer de gepassageerde cellen 70% conflueert, los ze met trypsine EDTA op zoals zojuist is gedemonstreerd, en re-suspendeer de enkele celsuspensie in 5 milliliter embryoid body of EB medium. Tel de mESC's en verdun ze vervolgens in het juiste volume EB medium tot een eindconcentratie van 2,5 keer 10 tot de 3e cellen per milliliter.

Voeg vervolgens 2 milliliter PBS toe aan de bodem van een steriele 10-centimeter bacteriële petrischaal per hangende druppelcultuur, en breng de EB-suspensie over in een steriele oplossingskom. Verwijder nu het deksel van een van de voorbereide schalen en gebruik een meerkanaals pipet, uitgerust met zes tips, om voorzichtig 60 20-microliter druppels EB-suspensie op het binnenoppervlak te deponeren. Plaats het deksel voorzichtig weer op de schotel, zorg ervoor dat de hangende druppels niet worden losgemaakt en plaats de schalen twee dagen in de celcultuur incubator.

Om de EB's te wassen, verwijder voorzichtig het deksel van de hangende druppelcultuur en kant het op een hoek van 45 graden. Gebruik vervolgens een 5-milliliter serologische pipet met kamertemperatuur EB medium om de EB's voorzichtig in een pool aan de onderkant van het deksel te wassen. Inspecteer het deksel zorgvuldig op EB's die aan het oppervlak zijn vastgehecht, en breng de EB's vervolgens over in een ongecoate, 6-centimeter petrischaal.

Breng de EB's terug naar de weefselcultuur incubator voor nog eens twee dagen, controleer de platen dagelijks op EB aggregatie en aanhechting. Voordat de EB's worden geplaatst, vervang de overtollige gelatinecoatingoplossing in elk wel van de voorbereide zes-welplaat, met 2 milliliter vers bereid, kamertemperatuur Grem2 behandelingsmedium. Gebruik vervolgens een P1000 pipet ingesteld op 100 microliter om 30 EB's over te brengen naar elke wel, en breng de plaat vervolgens terug naar de incubator voor een nacht, de cellen gelijkmatig verspreidend met zachte bewegingen zoals gedemonstreerd.

Nadat de EB's zich aan de bodem van de wels hebben gehecht, vervang het Grem2 medium elke twee dagen tot dag 10. Voed vervolgens de cellen met vers EB medium elke twee dagen om een gezonde celcultuur te onderhouden. Voorafgaand aan hun hangende druppelcultuur, zouden de pluripotente stamcellen compact en vrij van spontane differentiatie moeten zijn.

Als spontane differentiatie wordt waargenomen, mogen de cellen niet worden gebruikt in de hangende druppelculturen. Kwaliteit EB wordt over het algemeen het beste gevormd binnen gelijkmatig verdeelde, goed afgeronde hangende druppels. Tegen dag twee van differentiatie zouden de EB's zichtbaar moeten zijn voor het blote oog, als sferische arrangementen van differentiërende stamcellen aan de uiteinden van de hangende druppels.

Op dag vier zouden goed gevormde EB's vrij zwevend en homogeen in grootte en vorm moeten zijn. Eenmaal geplaatst, zullen de EB's afvlakken terwijl de cellen migreren van de EB naar het oppervlak van de weefselcultuurplaat, zoals hier wordt waargenomen op differentiatiedagen acht en 10. In niet-behandelde controlewels worden kleine, langzaam samentrekkende patches waargenomen zo vroeg als dag zes en zo laat als dag negen.

Terwijl in Grem2-behandelde wels, zijn grote patches met een relatief snel samentrekkende snelheid gebruikelijk. RT-QPCR analyse van genexpressie in de gedifferentieerde cellen onthult typisch hoge niveaus van cardiale structurele en regulatorische genen in Grem2-behandelde culturen. Als de