Met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de Human Sclera
May 6th, 2016
Menselijke scleraweefsels zijn voornamelijk collageen; daarom is het niet gemakkelijk bruikbaar voor immunohistologie. Om het doel te bereiken van het uitvoeren van immunohistologie voor confocale microscopie van sclerale weefsels, werd een lamineertechniek gebruikt.
Het algemene doel van deze methodologie is het uitvoeren van confocale microscopie van de menselijke sclera. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het oogheelkundige veld te beantwoorden. Zoals de verdeling van immuuncellen en de vasculaire status in de gezonde en de pathologische omstandigheden in de sclera.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het confocale beeldvorming van dicht bindweefsel mogelijk maakt. Demonstrerend de procedure zal Stefan Kremers zijn, een afstudeerstudent uit ons laboratorium. Om te beginnen, bereid 96 procent ethanol en PBS in afzonderlijke buisjes voor.
Bereid vervolgens 100 microliter per monster van de primaire antilichamen voor in de aanbevolen verdunning van PBS met twee procent BSA, en bewaar alle oplossingen op ijs. Schik schone instrumenten, waaronder een tot twee Colibri-pincetten, rechte micro-dissectie schaar, gebogen schaar, een nummer 10 scalpel, of oogheelkundige scalpel micro-veer, vier 26 gauge naalden en een doekje. Wikkel aluminiumfolie rond een polystyreen plaat, of bereid een kurkplak voor om het weefsel te bevestigen.
Na het produceren van een anterieure geopende bulb volgens het tekstprotocol, plaats de sclera op een doekje met de open kant naar boven. Gebruik vervolgens Colibri-pincetten om het netvlies en de gepigmenteerde uveale lagen van de binnenste sclera te verwijderen totdat de sclera vrij is van deze lagen. Gebruik vervolgens indien nodig gebogen schaar om het netvlies en uvea van de papilla te verwijderen.
Verwijder vervolgens de resterende conjunctiva, extra-ovulare spieren en tenons capsule van de oppervlakkige sclera. Gebruik nu Colibri-pincetten om het weefsel voorzichtig vast te houden, snijd met rechte schaar ongeveer twee vierkante centimeter grote sclerale monsters uit verschillende locaties op het weefsel, vermijd herhaaldelijk grijpen met de pincetten omdat dit het gebied ongeschikt maakt voor confocale microscopie. Plaats de monsters in 1,5 milliliter buisjes, voeg 1,5 milliliter 96 procent ethanol toe en incubeer gedurende 15 minuten om het weefsel te fixeren.
Vervolgens, na het verwijderen van de ethanol, gebruik 1,5 milliliter PBS om de monsters drie keer vijf minuten lang te wassen terwijl je schudt. Breng de monsters vervolgens over naar 1,5 milliliter PBS met vijf procent BSA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur, wat zwelling van de monsters zal induceren, om te helpen bij het lamineren en om niet-specifieke binding te voorkomen. Wanneer de monsters zijn gezwollen, gebruik onder een stereo-binoculaire microscoop 26 gauge naalden die aan de randen zijn gebogen om de achterste sclerale monsters aan de aluminiumfolie omhulde polystyreenmembraan of kurkplak te bevestigen.
Gebruik vervolgens om de monsters met volledige dikte te lamineren Colibri-pincetten om de anterieure rand van het sclerale weefsel horizontaal vast te houden. Snijd met een nummer 10 scalpel voorzichtig een zo dunne laag mogelijk van de oppervlakkige sclera van de onderliggende laag. Om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt, pipet 50 microliter PBS op de lagen.
Nadat de lagen zijn gesneden, plaats ze in 100 microliter PBS in een 96-wellplaat en gebruik een waterdichte stift om zowel de oriëntatie als de laag te labelen. Blijf lagen isoleren en overbrengen naar de 96-wellplaat tot het weefsel volledig is gelamineerd. Om Immunohistochemie uit te voeren, verwijder het medium uit de 96-wellplaat door de pipet tegen de wand van elke well te houden en de vloeistof te aspiheren.
Voeg vervolgens 100 microliter van de primaire antilichamen verdund een op 100 in PBS met twee procent BSA toe aan de juiste wells en incubeer gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag 200 tot 300 microliter PBS om de monsters op een shaker drie keer vijf minuten lang te wassen. Indien nodig, gebruik een ander primair antilichaam en incubeer opnieuw gedurende een nacht bij vier graden Celsius.
Voeg vervolgens 100 microliter van de corresponderende secundaire antilichamen toe, verdund een op 300 in PBS met twee procent geitenserum, en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende één tot twee uur. Na de incubatie, gebruik 200 tot 300 microliter PBS om de monsters opnieuw op de shaker drie keer vijf minuten lang te spoelen. Voeg vervolgens 100 microliter van een een op 2000 verdunning van DAPI toe aan elke well en incubeer in het donker bij kamertemperatuur.
Was de monsters vervolgens twee keer met 200 tot 300 microliter PBS. Breng de monsters onder de stereo-binoculaire microscoop op microscoopglaasjes over om ervoor te zorgen dat het monster plat op het glaasje ligt en voeg een tot twee druppels fluorescerend montagemedium toe. Plaats vervolgens een dekglas erop en gebruik transparante nagellak om de randen te verzegelen.
Bewaar in het donker bij vier graden Celsius voor later gebruik of onderzoek direct door confocale microscopie. Om de dikte van de monsters te verifiëren, neem z-stacks, aangezien de dikte equatoriaal en posterieur verschilt, afhankelijk van de locatie van de sclera. Deze afbeeldingen tonen het diverse netwerk van het bloedvatplexis in gelamineerde menselijke sclera afgeleid van de anterieure en posterieure episclera.
De bloedvaten zijn positief voor CD31 zoals weergegeven in groen. In deze figuur worden LYVE1 positieve immuuncellen van de episclera en hun relatie tot de CD31 positieve bloedvaten geïllustreerd. De z-stack-serie is genomen bij 10x vergroting om de driedimensionale relaties van bloedvaten en immuuncellen te onderzoeken.
Zoals hier getoond kan ook de aanwezigheid van bloedvaten of immuuncellen in de extra-oculaire spieren die binnen de sclera zijn ingesloten worden geanalyseerd, met behulp van de markers CD31 en LYVE1 respectievelijk. Eenmaal onder de knie, kan de lamineertechniek in minder dan een uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het weefsel niet mag uitdrogen.
Vergeet niet dat het werken met menselijk weefsel potentieel besmettelijk kan zijn
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het uitvoeren van confocale microscopie op menselijk scleraal weefsel, dat voornamelijk uit collageen bestaat en uitdagingen stelt voor immunohistochemie. De techniek is bedoeld om de verdeling van immuuncellen en de vasculaire status te onderzoeken in zowel gezonde als pathologische omstandigheden van de sclera.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Oogheelkunde
- Histologie
- Microscopie
Achtergrond
- De menselijke sclera is een dicht bindweefsel dat voornamelijk uit collageen bestaat.
- Immunohistochemie is uitdagend vanwege de samenstelling van de sclera.
- Confocale microscopie kan gedetailleerde beeldvorming van de sclera bieden.
- Het begrijpen van immuunresponsen in de sclera is cruciaal voor oogheelkundig onderzoek.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor confocale microscopie van menselijk scleraal weefsel.
- Om de verdeling van immuuncellen in gezonde en pathologische sclera te beoordelen.
- Om de vasculaire status in de sclera te evalueren met behulp van geavanceerde beeldtechnieken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van 96 procent ethanol en PBS in individuele buisjes.
- Laminertechniek voor weefselvoorbereiding.
- Confocale microscopie voor beeldvorming van dicht bindweefsel.
- Demonstratie van de procedure door een afgestudeerde student.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle toepassing van confocale microscopie op scleraal weefsel.
- Inzichten in de verdeling van immuuncellen in verschillende sclerale omstandigheden.
- Evaluatie van de vasculaire status in zowel gezonde als pathologische sclera.
- Demonstratie van de effectiviteit van de laminertechniek.
Conclusies
- De ontwikkelde methodologie verbetert het vermogen om scleraal weefsel te bestuderen.
- Confocale microscopie biedt waardevolle inzichten in de oculaire gezondheid.
- Deze techniek kan verder onderzoek in de oogheelkunde vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Studying immune cell distribution and vascular status in dense connective tissues like the human sclera presents challenges for target validation in ophthalmic drug development. This laminating technique enables confocal microscopy of otherwise opaque tissues, supporting mechanistic de-risking by providing quantitative spatial data on biomarker expression. The method enhances predictive confidence in preclinical models by allowing analysis of larger tissue samples to reduce sampling bias in target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding immune cell localization relative to vascular structures in dense tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying spatial relationships between CD31-positive vessels and LYVE1-positive cells.
- Predictive Value: Improves portfolio triage through quantitative 3D imaging of target engagement in pathological versus healthy sclera.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates standardized, thin tissue layers suitable for reproducible immunohistochemical staining and confocal imaging.
- Quantitative Outputs: Enables z-stack acquisition for thickness-adjusted measurements of biomarker-positive structures across scleral regions.
- Scalability: Facilitates preparation of multiple samples from different anatomical locations for comparative screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by preserving native tissue architecture for analysis of immune-vascular interactions.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides data on vascular and immune biomarkers to inform go/no-go criteria in preclinical advancement.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by directly visualizing co-localization of therapeutic targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling detailed phenotypic screening of immune and vascular targets in dense connective tissues prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through spatial mapping of biomarker expression in human sclera.
- Screening: Delivers assay-ready laminates with standardized thickness for reliable compound evaluation in ophthalmic target validation.
- Analytics: Generates quantitative confocal readouts (e.g., z-stacks, co-localization metrics) for comparing conditions across samples.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation by preserving human tissue relevance in immune-vascular studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for confocal analysis of other dense connective tissues beyond the sclera.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in dense tissue analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of tissue preparation for confocal microscopy across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier go/no-go decisions based on human tissue target engagement data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative assessment of biomarker distribution in pathological models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, confocal microscopy, and immunohistochemical staining techniques.
- Dependent on instrumentation including stereo-binocular microscopes, scalpels, and confocal imaging systems.
- Necessitates standardization of laminating thickness and antibody incubation protocols across users.
- Involves adaptation considerations for varying tissue density and anatomical location within the sclera.
- Includes practical limitations such as preventing tissue drying during lamination and managing autofluorescence in dense collagen.
