Name: Met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de Human Sclera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer confocale microscopie van het menselijk sclera met een lamineertechniek. Deze methode maakt gedetailleerde beeldvorming van dicht bindweefsel mogelijk om immuuncelverdeling en vaatstatus te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Duitse Onderzoeksstichting (FOR2240 "(Lymph) Angiogenese en Cellulaire Immuniteit bij Inflammatoire Oogaandoeningen" naar CC en LMH; HE 6743/2-1 en HE 7643/3-1 naar LMH; CU47/6-1 naar CC), Duitse Kankerhulp (naar LMH en CC), GEROK-programma Universiteit van Keulen (naar SLS en LMH) en EU COST BM1302 "Samenwerkingskrachten voor Cornea Regeneratie" (naar CC).

Het gebruik van menselijke weefsels moeten worden beoordeeld en goedgekeurd door een institutionele review board of het equivalent goedgekeurd. Het werk dat hier beschreven werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie en had de goedkeuring van wetenschappelijk onderzoek. Dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. De menselijke sclerale monsters werden verkregen uit de ogen van de wereld donoren (maximum post-mortem tijd 24 uur) bij de Eye Bank van de afdeling Oogheelkunde, Universiteit van Keulen, Duitsland. 1. Experimentele Voorbereiding <ol><li> Bereid 96% ethanol en fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in verschillende buizen. Bereid de primaire antilichamen in de aanbevolen verdunning van PBS met 2% runderserumalbumine (BSA) en alle oplossingen op ijs bewaren. Bereid 100 ul per monster. </li><li> Reinig alle instrumenten en scherpe scalpels. Na herhaalde snijden met dezelfde scalpel, verander de scalpel. </li><li> Verkrijgen 1-2 colibri tang, recht micro ontleden schaar, een # 10 scalpelof oogheelkundige scalpel micro veer, en vier 26 G naalden. </li><li> Wikkel aluminiumfolie rond een polystyreen plaat of gebruik maken van een kurk bord om het weefsel te brengen. Werken onder een binoculaire stereo microscoop. Werken onder een steriele laminaire luchtstroom indien nodig. </li></ol> 2. Bereid de Sclera <ol><li> Voorzichtig de lamp te houden en het uitvoeren van een perforeren trepanatie op de corneoscleral deel en draai de trepan. Draai de trepan voorzichtig en gelijkmatig op het oppervlak een even ronde geslepen uit te voeren. Gebruik een 15,5 mm formaat trepan. Snijd de resterende bijlagen met gebogen schaar. Verwijder de corneoscleral trepanation. Dit resulteert in een naar voren geopende lamp. <ol><li> Zet de sclera op een wattenstaafje met het open gedeelte naar boven. Verwijder de retina en uvea, gebruik Colibri tang beide lagen (retina en uvea) vanaf de sclera trekken. Heeft de gepigmenteerde uvea niet achter op de innerlijke sclera. Gebruik de gebogen schaar om de retina en uvea uit de papil te verwijderen. Verwijder de remaining bindvlies, oculaire spieren en Tenon capsule uit de oppervlakkige sclera. </li></ol></li><li> Verwijder de sclerale monster in de gewenste grootte door het gebruik van rechte-type schaar en de colibri tang. Neem ongeveer 2 cm 2 sized sclerale monsters van verschillende locaties. Vanwege de geringe omvang, houdt u de sclera voorzichtig en knip de gewenste grootte als vierkanten met behulp van de straight-type schaar. De corneoscleral trepanatie definieert de voorste rand van de sclerale monsters. <ol><li> Voorkom het grijpen met de tang het gebied waar het weefsel werd gegrepen is niet geschikt voor confocale microscopie analyse. Bereid het vereiste aantal monsters afhankelijk van het experiment (bijv ventraal vs. posterieur vergelijk figuur 1) en de hoeveelheid gebruikte antilichamen. </li></ol></li><li> Plaats de monsters in 1,5 ml buizen voor later gebruik. Bevestig de monsters in 1,5 ml 96% ethanol gedurende 15 min, en vervolgens wassen drie keer telkens 5 minin 1,5 ml PBS op de shaker. Als het werken met bevroren weefsel, voert u deze stap voor snap het vriespunt. </li><li> Gebruik verse weefsel. Echter, als dit niet mogelijk is, snap bevriezen van de sclera in vloeibare stikstof en bewaar deze bij -20 ° C voor later gebruik. Als het werken met bevroren weefsel, ontdooien voor gebruik. Vermijd herhaaldelijk ontdooien en bevriezen cycli. </li><li> Houd elk monster in PBS met 1,5 ml 5% BSA bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Deze stap leidt tot een zwelling van het monster dat is nuttig voor het lamineren en voorkomt ook niet-specifieke binding. </li><li> Nadat de monsters zijn gezwollen, de voorbereiding van de sclerale pleinen voor het lamineren. Werken onder een microscoop, bijvoorbeeld een binoculaire stereomicroscoop. Bevestig het achterste sclerale monsters naar het polystyreen membraan gewikkeld in aluminiumfolie of kurkplaat met de 26 G naalden. </li><li> Buig de randen van de naalden zodat ze niet interfereren met het gezichtsveld onder de microscoop. </li><li> Laminaat de volledige dikte sclerale samples. <ol><li> Ten eerste, houd de voorste sclerale rand met behulp van colibri tang. Snijd voorzichtig een dunne laag van de oppervlakkige sclera met de # 10 scalpel, de oftalmische scalpel micro veer of een spatel. Houd de scalpel horizontaal en snijd de oppervlakkige laag zo dun mogelijk uit de onderliggende laag. </li><li> Ontleden een dunne sclerale laag van de sclerale plein. Deze methode is vergelijkbaar met standaard chirurgische technieken om een flap te bereiden tijdens trabeculectomie en moet leiden tot 30-80 urn dikke lagen (vergelijk figuur 2). </li></ol></li><li> Voorkom drogen van de sclera door toevoeging van kleine hoeveelheden van PBS aan het weefsel, zoals 50 ul PBS met een pipet. </li><li> Doe de cut lagen in 100 ul van PBS in de plaat met 96 putjes en label zowel de oriëntatie (richting extern en intern) en de laag (oppervlakkig en diep), bijvoorbeeld met een waterdichte kleur. </li><li> Herhaal stap 2,7-2,9 totdat het weefsel volledig is gelamineerd. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Voer Immunohistochemie <ol><li> Voeg 100 ul van de vereiste primaire antilichamen in de aanbevolen verdunning. Hier, bijvoorbeeld bij gebruik CD 31 (monoklonaal muis-anti humaan) en LYVE1 antilichaam (konijnen tegen humaan), zowel in een verdunning van 1: 100 in PBS (bevattende 2% BSA) en incuberen bij 4 ° C overnacht. Aan het medium in de putjes 96 te wijzigen, houdt de pipet aan de wand van de put en verwijder de vloeistof. </li><li> De volgende dag, drie keer per wast de monsters 5 min bij 200-300 ul PBS op de shaker. Voeg 100 ul van de corresponderende secondaire antilichamen; Hier gebruiken geit antimuis fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) en geit anti konijn cyaninekleurstoffen 3 (Cy3) en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Verdun de secundaire antilichamen 1: 300 in PBS met 2% geitenserum. </li><li> Spoel de monsters opnieuw drie keer telkens 5 min in 200-300 ui PBS op de shaker. </li><li> Voer kern kleuring, bv </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdunning 1: 2000, 100 pl per putje en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur), daarna wassen opnieuw 2 keer in 200-300 ui PBS op de shaker. </li><li> Breng de monsters op objectglaasjes, insluiten in 1-2 druppels fluorescerende fixeermiddel, voeg een dekglaasje, verzegelen door het bedekken van de randen met transparante lak, en bewaar bij 4 ° C voor later gebruik of dia&#39;s met de confocale rechtstreeks onderzocht microscoop. </li><li> Gebruik een confocale microscoop (of equivalent) om de monsters te analyseren. Gebruik de gewenste vergroting, bijvoorbeeld 10-40X vergroting. </li><li> De dikte van de monsters controleren meten confocale microscopie gebruikt Z-Stacks. De hoeveelheid mogelijke sclerale secties afhankelijk van de locatie van de sclera, de dikte equatoriaal en posterieur (vergelijk inleiding) verschilt. </li></ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li>
<li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li>
<li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis%3A+what+can+we+learn+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li>
<li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact%2C+functional+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li>
<li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+chamber-associated+immune+deviation%2C+ocular+immune+privilege%2C+and+orthotopic+corneal+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li>
<li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li>
<li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li>
<li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+content+of+the+scleral+spur%2C+trabecular+mesh%2C+and+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li>
<li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+CS+%22The+sclera%22">The sclera</a>. , Springer. (2012).</li>
<li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Blutkreislauf+des+Auges%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225(1943).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li>
<li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm%27s+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li>
<li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li>
<li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li>
<li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Ophthalmol+Soc+U+K%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li>
<li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen financiële belangen te hebben. De inhoud van dit artikel valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs.

Lamineren van de humane sclera is een werkwijze voor het uitvoeren confocale microscopie op dit weefsel. Een kritische stap in dit proces is het gebruik van ethanol in plaats van formaline voor het aanbrengen van het weefsel. In onze ervaring, worden betere resultaten verkregen bij het gebruik van ethanol in plaats van formaline voor fixatie. Blunt scalpels verergeren de procedure en moet worden vermeden. Ook moet het opdrogen van de sclera worden vermeden, aangezien compliceert de procedure en vermindert de kwaliteit v...

De sclera is de stijve buitenste laag dat het oog, die is gemaakt van dicht bindweefsel omvat. Het helpt om intraoculaire structuren beschermen en om intraoculaire druk te handhaven. Dus de sclera is essentieel voor helder zicht. Het mist lymfevaten 1,2 en vormt daardoor een buitenste lymfatische-vrije grens tussen deze en de lymfatische-binnenmantel eye 3-7. Het biedt ook bevestiging plaatsen voor oculaire spieren, waardoor de anatomische gelijkenissen delen met pezen. Omdat de sclera bestaat voornamelijk uit dichte bundels van type I collageen en heeft kleinere aantallen collageen type III, IV, V, VI, VIII en 8,9 elastine 10,11, dit weefsel is niet makkelijk te gebruiken voor immunohistochemie. Anatomisch kan de sclera worden gescheiden in drie lagen: (1) de oppervlakkige gevasculariseerde episclera, vond onder het bindvlies en Tenon capsule en naar de zijkanten en ee achterkant van het oog met uitzicht op de baan; (2) de sclerale stroma, het grootste deel van de sclera; en (3) de lamina fusca, die een dunne, gepigmenteerde laag direct boven de uvea. Onze anatomische kennis over de sclera komt vooral voort uit de eerste helft van de 20e eeuw. Op dat moment, bestudeerden de anatomie van bloedvaten voornamelijk met Indische inkt injecties 12 en vasculaire gieten 13-15. Later, werd onderzocht in angiografische studies 16-19. Sinds die tijd zijn de oudere technieken verbeterd en nieuwe ontwikkeld die hebben ons als aanvulling op eerdere anatomische kennis. Zo is het slechts tien jaar geleden dat we deze betrouwbare lymfatische markers als lymfatisch vasculair endothelium specifieke hyaluronan receptor-1 (LYVE1) 20 of podoplanin 21 hebben. Confocale microscopie biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de anatomische kenmerken van de verschillende tissues van het oog. Deze meerdere vlekken worden gebruikt voor het differentiëren van markers van cellen of voor de lokalisatie van cellen in verband met bloedvaten en andere anatomische structuren. Het geeft een overzicht wanneer het monster is van een groter formaat en stelt ons in staat om te scannen door middel van een steekproef bij het op zoek naar een specifiek type cel. Met Z-Stack-technologie, kan confocale microscopie worden gebruikt voor monsters tot 100-200 urn. De sclera verschilt in dikte van 0,3 mm achter de spier inserties en 1 mm in de achterpool 11. Omwille van zijn dikte en ondoorzichtigheid, de sclera is niet geschikt voor confocale microscopie met traditionele methoden. Om dit te verhelpen, werden sclerale weefsels gelamineerd mogelijk te maken voor hun analyse met confocale microscopie. Deze techniek is nuttig voor een beter begrip van zowel fysiologische en pathologische situaties de menselijke sclera.

<table><tbody><tr><td>96% ethanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binocular stereo microscope&nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G naalden&nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, België</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Duitsland</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 scalpel&nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic scalpel micro feather&nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 antilichaam (monoklonaal muis anti humaan)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 antilichaam&nbsp; (polyklonaal konijn anti humaan)</td><td>Zytomed, Duitsland</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>geit anti-muis FITC antilichaam</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Duitsland</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>geit anti konijn Cy3 antilichaam</td><td>Dianova, Duitsland</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Geit serum normaal</td><td>Dako, Glostrup, Denemarken</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Duitsland</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscoopglazen&nbsp;</td><td>Engelbrecht, Edermünde, Duitsland</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Duitsland</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluorescente montagemedium&nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 confocale microscopie&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Duitsland</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de human sclera

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

De sclera is een dicht bindweefsel dat bedekt en beschermt het oog. Het bestaat hoofdzakelijk uit dichte bundels collageen (type I, III, IV, V, VI en VII). Door de autofluorescentie, ondoorzichtigheid en dikte, maar het is geschikt gebleken voor confocale microscopie. Een alternatieve benadering voor de hier gepresenteerde, die met formaline gefixeerd in paraffine ingebed sclera voor immunohistochemie gebruikt, heeft technische problemen, vooral wanneer het voorverwarmen weefsel voor antigen herstel. Omdat de sclera relatief arm aan beide cellen en vaten, werd het gebruik van grotere weefselmonsters onderzocht om te voorkomen uitzicht cellen en hun lokalisatie en vaartuigen en andere anatomische locaties begrijpen. Met het oog op de analyse van grotere weefselmonsters onder de confocale microscoop, werd een lamineertechniek uitgevoerd om dunne lagen van de sclera te maken. Naar aanleiding van de analyse van de resultaten van CD31 bloedvaten en lymfevaten endotheliale hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positieve cellen, waarvoor goedkeuring voor wetenschappelijk onderzoek werd verkregen, de voordelen en beperkingen van deze methode worden besproken.

In de representatieve experimenten uitgevoerd hier, voor aantoonbare voordelen die voortvloeien uit het gebruik van deze bijzondere lamineertechniek. Het eerste experiment illustreert de diverse netwerk van de episclerale bloedvaten plexus in drie representatieve beelden (figuur 3). De schepen zijn positief voor CD31. Het tweede experiment toont immuuncellen, met name LYVE1 + cellen van de episclera en hun rel...

Menselijke scleraweefsels zijn voornamelijk collageen; daarom is het niet gemakkelijk bruikbaar voor immunohistologie. Om het doel te bereiken van het uitvoeren van immunohistologie voor confocale microscopie van sclerale weefsels, werd een lamineertechniek gebruikt.

Met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de Human Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Het algemene doel van deze methodologie is het uitvoeren van confocale microscopie van de menselijke sclera. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het oogheelkundige veld, zoals de distributie van immuuncellen en de vasculaire status in de gezonde en pathologische condities van de sclera.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het confocale beeldvorming van dicht bindweefsel mogelijk maakt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Stefan Kremers, een promovendus uit ons laboratorium. Bereid ter voorbereiding 96% ethanol en PBS voor in afzonderlijke buisjes.Bereid vervolgens per monster 100 µL van de primaire antilichamen voor in de aanbevolen verdunning van PBS met twee procent BSA, en bewaar alle oplossingen op ijs. Zet schone instrumenten klaar, waaronder één tot twee Colibri-pincetten, rechte micro-dissectiescharen, gebogen scharen, een scalpel nummer 10 of een oogheelkundige scalpel-microfeather, vier naalden van 26 gauge en een wattenstaafje. Wikkel aluminiumfolie rond een polystyreenplaat, of bereid een kurkplaat voor om het weefsel op te bevestigen.Nadat een naar voren toe geopende bulbus is geproduceerd volgens het tekstprotocol, wordt de sclera op een wattenstaafje geplaatst met het geopende gedeelte naar boven gericht. Gebruik vervolgens colibri-pincetten om het netvlies en de gepigmenteerde uveale lagen van de binnenste sclera te verwijderen, totdat de sclera vrij is van deze lagen. Gebruik indien nodig daarna gebogen scharen om het netvlies en de uvea van de papil te verwijderen.Verwijder vervolgens het resterende conjunctiva, de extra-ovulaire spieren en het kapsel van Tenon van de oppervlakkige sclera. Gebruik nu colibri-pincetten om het weefsel voorzichtig vast te houden en knip met een rechte schaar sclera-monsters van ongeveer twee vierkante centimeter uit verschillende locaties op het weefsel; vermijd herhaaldelijk vastpakken met de pincet, omdat dit het gebied ongeschikt maakt voor confocale microscopie. Plaats de monsters in 1,5 milliliter buisjes, voeg 1,5 milliliters 96% ethanol toe en incubeer gedurende 15 minuten om het weefsel te fixeren.Verwijder vervolgens de ethanol en was de monsters drie keer gedurende vijf minuten met 1,5 milliliters PBS onder voortdurend schudden. Breng de monsters daarna over naar 1,5 milliliters PBS met vijf procent BSA en incubeer deze twee uur bij kamertemperatuur; dit induceert zwelling van de monsters, wat helpt bij het lamineren en aspecifieke binding voorkomt. Wanneer de monsters zijn opgezwollen, gebruik dan onder een stereobinoculair microscoop 26 gauge naalden die aan de uiteinden zijn gebogen om de posterieure sclera-monsters te bevestigen aan het met folie omwikkelde polystyreenmembraan of de kurkplaat.Om de monsters over de volledige dikte te lamineren, gebruikt u colibri-pincetten om de voorrand van het scleraweefsel horizontaal vast te houden. Snijd met een scalpel nummer 10 voorzichtig een zo dun mogelijke laag van de oppervlakkige sclera weg van de onderliggende laag. Om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt, pipetteert u 50 µL PBS op de lagen.Plaats de lagen na het snijden vervolgens in 100 µL PBS in een 96-well plaat en gebruik een watervaste marker om zowel de oriëntatie als de laag te labelen. Ga door met het isoleren van lagen en het overbrengen naar de 96-well plaat totdat het weefsel volledig is gelamineerd. Om immunohistochemie uit te voeren, verwijdert u het medium uit de 96-well plaat door de pipet tegen de wand van elke well te houden en de vloeistof te aspireren.Voeg vervolgens 100 µL van de primaire antilichamen, verdund 1:100 in PBS met twee procent BSA, toe aan de betreffende putjes en incubeer dit gedurende de nacht bij vier °C. Was de monsters de volgende dag drie keer gedurende vijf minuten per keer met 200 tot 300 µL PBS op een schudapparaat. Indien nodig kan een ander primair antilichaam worden gebruikt, gevolgd door een erneure incubatie gedurende de nacht bij vier °C.Voeg vervolgens 100 µL van de overeenkomstige secundaire antilichamen toe, verdund 1:300 in PBS met twee procent geiten serum, en incubeer dit in het donker bij kamertemperatuur gedurende één tot twee uur. Gebruik na de incubatie 200 tot 300 µL PBS om de monsters opnieuw drie keer gedurende vijf minuten per keer af te spoelen op de shaker. Voeg daarna 100 µL van een 1:2000 verdunning van DAPI toe aan elke put en incubeer dit in het donker bij kamertemperatuur.Was de monsters twee keer met 200 tot 300 µL PBS. Breng de monsters onder een stereobinoculaire microscoop over op microscoopglaasjes om er zeker van te zijn dat het monster plat op het glaasje ligt, en voeg één tot twee druppels fluorescerend monteermedium toe. Plaats vervolgens een dekglas bovenop en gebruik transparante nagellak om de randen af te dichten.Bewaar in het donker bij vier graden Celsius voor later gebruik of onderzoek direct met confocale microscopie. Om de dikte van de monsters te verifiëren, moeten z-stacks worden gemaakt, aangezien de dikte equatoriaal en posterieur verschilt afhankelijk van de locatie van de sclera. Deze afbeeldingen tonen het diverse netwerk van het bloedvatplexus in gelamineerde menselijke sclera, afgeleid van de anterieure en posterieure episclera.De bloedvaten zijn positief voor CD31, weergegeven in het groen. In deze figuur worden de LYVE1-positieve immuuncellen van de episclera en hun relatie tot de CD31-positieve bloedvaten geïllustreerd. De z-stack serie is opgenomen bij een 10x vergroting om de driedimensionale relaties tussen de bloedvaten en immuuncellen te onderzoeken.Zoals hier wordt getoond, kunnen de extraoculaire spieren die omsloten zijn door de sclera ook worden geanalyseerd op de aanwezigheid van bloedvaten of immuuncellen, gebruikmakend van respectievelijk de markers CD31 en LYVE1. Zodra de lamineringstechniek onder de knie is, kan deze in minder dan een uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het weefsel niet mag uitdrogen.Vergeet niet dat werken met menselijk weefsel potentieel infectieus kan zijn en dat er vooraf altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals microbiologische en virologische diagnostiek.

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit protocol beschrijft technieken voor de beoordeling van de chemische cross-linking van het konijn sclera met behulp van tweede-harmonische generatie beeldvorming en differentiële scanning calorimetrie.

Tweede harmonische generatie signalen in konijn Sclera als een instrument voor de beoordeling van de therapeutische weefsel dwarsbinding (TXL) voor bijziendheid

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.

Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Hier gepresenteerd is het protocol van de Conpokal techniek, die confocale en atomaire kracht microscopie combineert in een enkel instrument platform. Conpokal biedt dezelfde cel, dezelfde regio, in de buurt van gelijktijdige confocale beeldvorming en mechanische karakterisering van levende biologische monsters.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

De huidige protocollen beschrijven nieuwe beeldvorming van de hele montering voor de visualisatie van perifere structuren in de oculaire lens met methoden voor beeldkwantificering. Deze protocollen kunnen in onderzoeken worden gebruikt om de relatie tussen lensstructuren op microschaal en de ontwikkeling/functie van lenzen beter te begrijpen.

Beeldvorming van de hele montage om de perifere lensstructuur, celmorfologie en organisatie te visualiseren en te kwantificeren

Leer confocale microscopie van het menselijk sclera met een lamineertechniek. Deze methode maakt gedetailleerde beeldvorming van dicht bindweefsel mogelijk om immuuncelverdeling en vaatstatus te bestuderen.

Met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de Human Sclera

Meer video's verkennen