Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie
7 april 2016
De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.
Het algemene doel van deze procedure is om time-lapse analyse van diverse ontwikkelingsprocessen mogelijk te maken met behulp van een fluorescent dissectiemicroscoop, met eenvoudige strategieën voor heruitlijning na drift in elke gewenste richting. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ontwikkelingsbiologie, omdat het directe observatie van weefsel- en orgaanontwikkeling in levende embryo's over meerdere uren mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het een betaalbaar en gebruiksvriendelijk alternatief is voor complexere technieken die gewoonlijk worden gebruikt voor time-lapse opnamen van ontwikkelende weefsels en organen, zoals laserscanning of lichtmicroscopie.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de ruimtelijke en temporele veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling van embryo's en larven van de vegervis, kan deze ook worden toegepast om vroege ontwikkelingsprocessen en andere modelorganismen te onderzoeken. Bovendien is het geschikt voor het observeren van dynamische processen in volwassen organismen, zoals wortelgenezing en regeneratie. Identificeer ter voorbereiding hoogproductieve volwassen vissen uit de transgene GFP-expresserende lijn.
Zet op de middag vóór de micro-injectie in planten vijf man-vrouwparen van voortplantingsvissen in vijf kweekbakken. Houd in de bakken het mannetje en het vrouwtje gedurende de nacht gescheiden door een verwijderbaar zeefje. Plaats de volgende ochtend, direct nadat de lichten aangaan, een mannetje en een vrouwtje samen boven het zeefje, wat voorkomt dat ze hun eitjes opeten.
Observe nu de vissen terwijl ze paren. Zodra het paar ongeveer 50 eitjes heeft geproduceerd, scheidt u hen. Draag de eitjes vervolgens met een Pasteur-pipet over naar een Petrischaal gevuld met embryo-water voor een eerste injectieronde.
Herhaal dit proces voor elk gepaard paar. Indien extra eieren nodig zijn, kunnen dezelfde paren meerdere keren samengebracht en weer gescheiden worden. Voor de micro-injectie vindt de voorbereiding van de schaaltjes en injectienaalden plaats op een vrij standaard manier.
Details zijn te vinden in het tekstprotocol. Begin met het laden van een voorbereide injectienaald. Vul de naald met twee microliters MO-werkoplossing met behulp van een micro-loader-tip en bevestig de naald vervolgens in een micromanipulator.
Vervolgens kan de naaldpunt worden geopend. Terwijl u de punt door een dissectiemicroscoop bekijkt, gebruikt u een pincet om het uiteinde open te knijpen, of drukt u de punt tegen een hard oppervlak. Kalibreer daarna het injectievolume door de MO-oplossing in een druppel minerale olie op een telplaat te injecteren.
Stel de injectie zo in dat er druppels van 75 micron ontstaan, wat overeenkomt met ongeveer 200 picoliters oplossing. Bereid vervolgens de embryo's voor die geïnjecteerd moeten worden. Plaats de embryo's in het 21-celstadium langs de groef van de micro-injectieschaal, waarbij de vegetatieve pool is gericht naar de benadering van de micro-injectienaald, die zich in een hoek van 45 graden ten opzichte van de groef bevindt.
Inject nu de embryo's. Perforeer met de naald het chorion en de dooier, en injecteer vervolgens de geladen Morpholino-oplossing in de dooier. Dit werkt bij embryo's in het één- of tweecelstadium.
Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, gebruik je een Pasteurpipet met een wijde opening om ze te verzamelen. Breng de geïnjecteerde embryo's over naar petrischalen gevuld met embryo-water en incubeer ze bij 28,5 °C. Later op de middag worden dode embryo's weggeheveld en wordt het embryo-water vervangen.
De volgende ochtend, nadat de embryo's de gastrulatie hebben doorloopen, wordt hun melanisatie geremd door het water te vervangen door embryo-water dat een sporenhoeveelheid PTU bevat. Wees voorzichtig, PTU zal de normale ontwikkeling vóór de gastrulatie verstoren. Later, bij het gewenste ontwikkelingsstadium, worden de embryo's gedechoreioneerd met een scherp pincet.
Pak met behulp van de microscoop het chorion vast met één pincet en probeer de andere kant van het chorion vast te pakken met een tweede pincet. Trek vervolgens de pincetten voorzichtig uit elkaar zonder het embryo te beschadigen. Anestheseer de embryo's daarna met Tricaine en ga verder met het inbedden van de embryo's en agarose op een relocatiegrid van 15 micron, geplaatst in een micro-dish met een bodem van dekglas.
Laad vervolgens aliquots van 1 ml gesmolten agarose in reactiebuisjes van 1,5 ml. Plaats de buisjes in hitteblokken die zijn ingesteld op 36 °C en wacht tot ze zijn afgekoeld. Breng daarna met een wide-bore pipet een embryo over naar de micro-dish.
Sifononeer het overtollige embryowater af en bedek het embryo met agarose. Terwijl de agarose nog vloeibaar is, kunnen twee kleine pipetpunten worden gebruikt om de embryo's te oriënteren. Positioneer de structuur van belang, in dit geval de pronephros, zo dicht mogelijk bij de glazen bodem en in de directe nabijheid van het raster.
Het rooster mag de structuur van belang niet overlappen. Het is voordelig om tot vier embryo's in verschillende micro-schaaltjes in te bedden en te plannen om degene met de beste kwaliteit te beelden. Voor een correcte inbedding is enige oefening vereist.
Terwijl de agarose nog vloeibaar is, moet het embryo in de gewenste positie worden georiënteerd. Controleer of de pronefros zich dicht bij de glazen bodem bevindt en op een geschikte afstand van het herpositioneringsrooster. Controleer de agarose regelmatig.
Zodra het hard genoeg is om de embryo's vast te houden, laat het dan nog twee tot drie minuten rusten. Bedek het ingebedde embryo vervolgens met embryowater dat sporen van PTU en tricaine bevat. Giet of zuig het overtollige embryowater af en sluit het deksel om verdamping te voorkomen.
Het resultaat mag geen luchtbellen bevatten. Het embryo kan nu worden afgebeeld met de glazen bodem naar de objectieflens gericht. Bij het gebruik van de preparatie voor time-lapse beelden, bijvoorbeeld door periodiek over meerdere uren Z-stack beelden te maken, is het noodzakelijk om te corrigeren voor focusdrift.
Pas indien mogelijk een autofocusstrategie toe. Schakel de autofocusoptie in de softwarebesturing in. Kies voor het referentiekanaal het helderveldkanaal met doorgelaten licht om fototoxiciteit te minimaliseren.
Het is daarnaast essentieel om een voldoende groot, op het specimen afgestemd zoekbereik te kiezen zodat de autofocus correct functioneert. Positioneer, voordat u afbeeldingen verzamelt, een specifiek punt van het geïmpregneerde raster dicht bij de structuur van belang in het vizier van de software en sla deze positie op met een screenshot. Raadpleeg vervolgens, vlak voordat elk beeldvormingsinterval is afgelopen, de screenshot en pas de positie van de tafel en de focus opnieuw aan indien de autofocus niet wordt gebruikt.
De gepresenteerde methode werd gebruikt om de nierontwikkeling te analyseren in WT1A-gemorpheerde embryo's van een transgene zebravislijn. Tijdens de vroege nefrogene fase vertoonde deze lijn groene fluorescentie in het intermediaire mesoderm waar de nierprogenitoren ontstaan, en later tijdens de ontwikkeling in de vormende tubuli en nefronprimordia. Time-lapse imaging onthulde een normale nefrogese in de controle-embryo's die waren geïnjecteerd met Morpholino.
Op 20 uur na bevruchting waren de zich ontwikkelende pronefrische tubuli zichtbaar. Aan hun anterieure uiteinden kon een sferische ophoping van cellen worden waargenomen, die de vormende nefronprimordia vertegenwoordigen. Gedurende de volgende uren groeiden de tubuli en nefronprimordia, en begonnen de primordia in de middellijn samen te smelten.
In tegenstelling hiermee was de nefrogenese bij de mutanten ernstig verstoord. Hoewel GFP-positieve tubulaire structuren zichtbaar waren 20 uur na bevruchting, waren deze diffuus en onderontwikkeld. Time-lapse imaging toonde aan dat nefronprimordia zich nooit vormden en een opvallend aantal fluorescerende cellen buiten de ontwikkelende pronefrosen ventraal migreerden, waardoor ze het pronefrotische veld verlieten.
Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om te onthouden dat het ontbreken van aanvullende apparatuur, zoals temperatuurregeling of anti-evaporatietafels, regelmatige controles op afwijkingen en heraanpassingen vereist. Na deze procedure kunnen de beeldeembryo's worden verwerkt om andere methoden uit te voeren, zoals immunohistochemie, in situ hybridisatie of real-time PCR, om specifieke componenten van cellen en weefsels te identificeren of om genexpressie te beoordelen.
Overzicht
Deze methode maakt time-lapse-analyse van de orgaanontwikkeling in zebravissenembryo's mogelijk met behulp van een fluorescentiedissectiemicroscoop. Hiermee kunnen weefsels en de orgaanontwikkeling gedurende meerdere uren direct worden waargenomen, wat inzicht biedt in de ontwikkelingsbiologie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Zebravis-embryologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Time-lapse-beeldvorming is essentieel voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- Traditionele methoden kunnen complex en kostbaar zijn.
- Deze methode biedt een eenvoudiger en betaalbaarder alternatief.
- Het kan worden toegepast op diverse modelorganismen.
Doel van de studie
- Om de observatie van orgaanontwikkeling in levende embryo's te vergemakkelijken.
- Om een methode te bieden die gebruiksvriendelijk en kosteneffectief is.
- Om onderzoekers in staat te stellen dynamische ontwikkelingsprocessen te bestuderen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van volwassen zebravis voor de fokkerij.
- Micro-injectie van Morpholino-oplossingen in embryo's.
- Inbedding van embryo's in agarose voor beeldvorming.
- Time-lapse beeldvorming met een fluorescentie-dissectiemicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle observatie van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's.
- De effectiviteit van de methode voor time-lapse-beeldvorming is aangetoond.
- Inzichten verschaft in ruimtelijke en temporele veranderingen tijdens de ontwikkeling.
- Toepasbaarheid aangetoond voor andere ontwikkelingsprocessen en organismen.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol instrument voor onderzoek in de ontwikkelingsbiologie.
- Het vereenvoudigt het proces van het observeren van levende embryo's in de tijd.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van diverse ontwikkelingsfenomenen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode biedt een toegankelijke benadering voor time-lapse imaging van organogenese in zebravisembryo's, waardoor directe observatie van ontwikkelingsprocessen mogelijk is zonder dat er complexe of dure microscopie-infrastructuur vereist is. Door longitudinale imaging van weefseldynamiek in een gewervelde modelorganisme te ondersteunen, faciliteert het targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanistische risicoreductie in discovery pipelines. De techniek biedt een kosteneffectief alternatief voor het genereren van kwantitatieve, reproduceerbare gegevens over morfogenetische gebeurtenissen die relevant zijn voor ziektemodellering en fenotypische screening.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar genfuncties bij nierontwikkeling mogelijk door het visualiseren van ruimtelijke en temporele veranderingen in de nefrogenese na wt1a knockdown.
- Operationele waarde: Ondersteunt hypothesetesten door directe visualisatie van de vorming van pronefrotubuli en de fusie van nefronprimordia in levende embryo's.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de beoordeling van de fenotypische ernst in morphant-modellen, wat helpt bij de evaluatie van de betrouwbaarheid van targets voor pathways van nierziekten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve z-stack en time-lapse read-outs van fluorescent gelabelde nierstructuren voor comparatieve analyse tussen controlecondities en verstoorde condities.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een fluorescentiedissectiemicroscoop met autofocus en relocatiegrids om drift te minimaliseren, wat de reproduceerbaarheid tussen verschillende imagingsessies verbetert.
- Assay-gereedheid: Levert gestandaardiseerde imaging-outputs die gebruikt kunnen worden om baseline-fenotypes vast te stellen voor compound-screening of studies naar genetische modificatoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt observatie mogelijk van geconserveerde ontwikkelingsprocessen in zebravissen, een ziekterelevant systeem voor het modelleren van menselijke nieraandoeningen.
- Mechanistische risicovermindering: Maakt het volgen van defecten in cellulaire migratie en tubulusmorfogenese mogelijk, wat inzicht biedt in off-target effecten of padspecifieke effecten van genetische perturbaties.
- Preklinische afstemming: Ondersteunt de overgang van ontdekking naar preklinische validatie door het vaststellen van dosis- of tijdsafhankelijke fenotypische read-outs.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor renale pathways waarbij dynamische weefselbeeldvorming inzicht geeft in het werkingsmechanisme en de fenotypische uitkomst.
- Discovery Biology: Ondersteunt de functionele validatie van targets zoals wt1a door real-time observatie van downstream ontwikkelingsgevolgen in een levend systeem mogelijk te maken.
- Screening: Genereert reproduceerbare fluorescentiegebaseerde read-outs die geschikt zijn voor het beoordelen van effecten van verbindingen op niermorfogenese in een vertebratencontext.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van tubuluslengte, primordiavorming en cellulaire lokalisatie over tijd, wat een objectieve vergelijking tussen experimentele groepen mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege ontwikkelingsfenotypen met orgaandysfunctie in een later stadium, ter ondersteuning van biomarker-gealigneerde beoordelingen van renale toxiciteit of herstel.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een schaalbare imaging-capaciteit die kan worden toegepast op meerdere ontwikkelingsmodellen en organsystemen met minimale reconfiguratie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-validatie door genetische perturbatie te koppelen aan waarneembare ontwikkelingsdefecten in een fysiologische context.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door hardwarematige driftcorrectie (autofocus, relocatiegrids) en gestandaardiseerde embryo-preparatie.
- Strategische waarde: Verhoogt de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door vroege, visuele bevestiging van pathway-modulatie in een whole-organism assay.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van de ernst en specificiteit van de in vivo waargenomen ontwikkelingsfenotypen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de houderij van zebravissen, micro-injectie en embryo-stadiëring voor een succesvolle toepassing.
- Afhankelijk van een fluorescentie-dissectiemicroscoop met z-stack functionaliteit en software die autofocus en herpositionering van de tafel ondersteunt.
- Standaardisatie van de agarose-inbedding en de oriëntatie van de embryo's is noodzakelijk om een consistente beeldkwaliteit tussen gebruikers en sessies te waarborgen.
- Aanpassing aan andere organen of modellen kan wijzigingen vereisen in transgene reporters, het tijdstip van injectie of de ontwikkelingsstadiëring.
- Praktische beperkingen omvatten een lagere doorvoer in vergelijking met geautomatiseerde systemen en de handmatige inspanning die nodig is voor driftmonitoring wanneer er geen autofocus wordt gebruikt.
