Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie
April 7th, 2016
De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.
Het algemene doel van deze procedure is om time-lapse analyse van diverse ontwikkelingsprocessen mogelijk te maken met behulp van een fluorescent dissecting microscoop met eenvoudige strategieën voor heruitlijning na drift in elke richting. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, omdat het directe observatie van weefsels en orgaanontwikkeling in levende embryo's gedurende meerdere uren mogelijk maakt. Het grote voordeel van deze methode is dat het een betaalbare en gemakkelijke alternatief is voor complexere technieken die normaal gesproken worden gebruikt voor time-lapse opnames van zich ontwikkelende weefsels en organen, zoals laser scanning of verlichte microscopie.
Hoewel deze methode inzichten kan geven in ruimtelijke en temporele veranderingen die plaatsvinden tijdens de ontwikkeling van veegvis embryo's en larven, kan het ook worden toegepast om vroege ontwikkelingsprocessen en andere modelorganismen te onderzoeken. Bovendien is het geschikt om dynamische processen in volwassen organismen te observeren, zoals wortel genezing en regeneratie. In voorbereiding, identificeer zeer reproductieve volwassen vissen uit de transgene GFP-expresserende lijn.
De avond voor de plant micro-injectie, zet vijf mannelijk-vrouwelijk paar reproductieve vissen in vijf kweekcontainers. In de containers, houd het mannetje en het vrouwtje gescheiden door een verwijderbaar zeefje gedurende de nacht. De volgende ochtend, net nadat het licht aangaat, zet een mannetje en een vrouwtje samen boven het zeefje, wat zal voorkomen dat ze hun eieren opeten.
Nu, observeer de vissen terwijl ze paaien. Zodra het paar ongeveer 50 eieren heeft geproduceerd, scheid ze. Breng vervolgens de eieren over met behulp van een Pasteur pipette naar een petrischaal gevuld met embryowater voor een eerste ronde injectie.
Herhaal dit proces voor elk gekoppeld paar. Als er extra eieren nodig zijn, kunnen dezelfde paarvormingen meerdere keren bij elkaar worden gebracht en gescheiden. Voor de micro-injectie wordt de voorbereiding van schalen en injectienaalden op een vrij standaard manier uitgevoerd.
Details zijn te vinden in het tekstprotocol. Begin met het laden van een voorbereide injectienaald. Gebruik een micro-loader tip om de naald terug te vullen met twee microliters MO werkoplossing, en bevestig vervolgens de naald in een micro-manipulator.
Vervolgens kan de naaldtip worden geopend. Terwijl u het bekijkt met de dissectiemicroscoop, gebruik pincetten om het uiteinde open te knijpen, of duw de punt tegen een stijve ondergrond. Vervolgens kalibreert u het injectievolume door de MO oplossing in een druppel mineraal olie op een raster te injecteren.
Pas de injectie aan om 75 micron druppels te maken die overeenkomen met ongeveer 200 picoliter oplossing. Bereid vervolgens de embryo's voor om te worden geïnjecteerd. Schik de ongeveer 21 celstadium embryo's langs de groef van de micro-injectieschaal met de vegetatieve pool gericht naar de benadering van de micro-injectienaald, die onder een hoek van 45 graden van de groef staat.
Nu, injecteer de embryo's. Met de naald, doorboor het chorion en het dooier, en injecteer vervolgens de geladen Morpholino oplossing in de dooier. Dit werkt voor embryo's in het stadium van één of twee cellen.
Na het injecteren van alle embryo's, gebruik een brede bore Pasteur om ze te verzamelen. Breng de geïnjecteerde embryo's over in petrischalen gevuld met embryowater en incubeer ze bij 28,5 graden Celsius. Later in de middag, siphon dode embryo's weg en vervang het embryowater.
De volgende ochtend, nadat de embryo's door gastrulatie heen zijn gegaan, remmen hun melanisatie door hun water te vervangen door embryowater dat een spoorhoeveelheid PTU bevat. Wees voorzichtig, PTU zal de juiste ontwikkeling voorafgaand aan gastrulatie verstoren. Later, op het gewenste ontwikkelingsstadium, dechorionate de embryo's met scherpe pincetten.
Gebruik de microscoop om het chorion vast te grijpen met één paar pincetten, en probeer de andere kant van het chorion vast te grijpen met een tweede paar pincetten. Trek vervolgens voorzichtig de pincetten uit elkaar zonder het embryo te verstoren. Vervolgens anesthetiseer de embryo's met Tricaine, en ga verder met het inbedden van de embryo's en agarose op een 15 micron herplaatsingsraster geplaatst in een dekglasbodem micro-schaal.
Laad vervolgens één milliliter aliquots van gesmolten agarose in 1,5 milliliter reactiebuisjes. Zet de buisjes in warmteblokken ingesteld op 36 graden Celsius, en wacht tot ze afkoelen. Breng vervolgens een embryo over naar de micro-schaal met behulp van een breed buisje.
Siphon het overtollige embryowater af en leg de embryo over met agarose. Terwijl de agarose nog vloeibaar is, gebruik twee kleine pipettenpunten om de embryo's te oriënteren. Positioneer de structuur van belang, in dit geval de pronefros, zo dicht mogelijk bij de glazen bodem, en in de nabijheid van het raster.
Het raster mag niet over de structuur van belang liggen. Het is voordelig om maximaal vier embryo's in verschillende micro-schalen in te bedden, en plan om de beste te beeld te maken. Goed inbedden vereist enige oefening.
Terwijl de agarose nog vloeibaar is, moet het embryo in een gewenste positie worden georiënteerd. Als het een pronefros is, dicht bij de glazen bodem, en op een geschikte afstand tot het herplaatsingsraster. Controleer de agarose routinematig.
Zodra het hard genoeg is om de embryo's vast te houden, laat het nog twee tot drie minuten bezinken. Leg vervolgens de ingebedde embryo over met embryowater dat sporen van PTU en tricaine bevat. Decanteer of siphon het overtollige embryowater af en sluit het deksel om verdamping te voorkomen.
Het resultaat mag geen luchtbellen bevatten. Het embryo kan nu worden afgebeeld met de glazen bodem naar de objectieve lens. Gebruik de voorbereiding om time-lapse beelden te maken, bijvoorbeeld door periodiek Z-stack beelden te maken gedurende meerdere uren, het is noodzakelijk om te corrigeren voor focale drift.
Als het mogelijk is, pas een auto-focus strategie toe. Schakel de auto-focus optie in de software control in. Kies voor
Overzicht
Deze methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's mogelijk met behulp van een fluorescentie dissecterende microscoop. Het staat directe observatie van weefsels en orgaanontwikkeling over een aantal uren toe, wat inzichten biedt in ontwikkelingsbiologie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Zebravis embryologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Time-lapse beeldvorming is cruciaal voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- Traditionele methoden kunnen complex en duur zijn.
- Deze methode biedt een eenvoudigere en goedkopere alternatief.
- Het kan worden toegepast op verschillende modelorganismen.
Doel van het onderzoek
- Om de observatie van orgaanontwikkeling in levende embryo's te vergemakkelijken.
- Om een methode te bieden die gemakkelijk te gebruiken en kosteneffectief is.
- Om onderzoekers in staat te stellen dynamische ontwikkelingsprocessen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van volwassen zebravissen voor kweek.
- Micro-injectie van Morpholino oplossingen in embryo's.
- Inbedding van embryo's in agarose voor beeldvorming.
- Time-lapse beeldvorming met een fluorescentie dissecterende microscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle observatie van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's.
- Aangetoond de effectiviteit van de methode voor time-lapse beeldvorming.
- Biedt inzichten in ruimtelijke en temporele veranderingen tijdens ontwikkeling.
- Toonde toepasbaarheid op andere ontwikkelingsprocessen en organismen.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol hulpmiddel voor onderzoek in de ontwikkelingsbiologie.
- Het vereenvoudigt het proces van het observeren van levende embryo's over tijd.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van verschillende ontwikkelingsverschijnselen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method provides an accessible approach for time-lapse imaging of organogenesis in zebrafish embryos, enabling direct observation of developmental processes without requiring complex or expensive microscopy infrastructure. By supporting longitudinal imaging of tissue dynamics in a vertebrate model, it facilitates early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique offers a cost-effective alternative for generating quantitative, reproducible data on morphogenetic events relevant to disease modeling and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in kidney development by visualizing spatial and temporal alterations in nephrogenesis upon wt1a knockdown.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through direct visualization of pronephric tubule formation and nephron primordia fusion in live embryos.
- Predictive Value: Facilitates assessment of phenotypic severity in morphant models, aiding in target confidence evaluation for renal disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative z-stack and time-lapse readouts of fluorescently labeled kidney structures for comparative analysis between control and perturbed conditions.
- Operational Value: Utilizes a fluorescence dissecting microscope with autofocus and relocation grids to minimize drift, enhancing reproducibility across imaging sessions.
- Assay Readiness: Produces standardized imaging outputs that can be used to establish baseline phenotypes for compound screening or genetic modifier studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables observation of conserved developmental processes in zebrafish, a disease-relevant system for modeling human kidney disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows tracking of cellular migration and tubule morphogenesis defects, providing insight into off-target or pathway-specific effects of genetic perturbations.
- Preclinical Alignment: Supports progression from discovery to preclinical validation by establishing dose- or time-dependent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for renal pathways where dynamic tissue imaging informs mechanism of action and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports functional validation of targets like wt1a by enabling real-time observation of downstream developmental consequences in a living system.
- Screening: Generates reproducible fluorescence-based readouts suitable for assessing compound effects on kidney morphogenesis in a vertebrate context.
- Analytics: Provides quantitative measurements of tubule length, primordia formation, and cellular localization over time, enabling objective comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects early developmental phenotypes to later-stage organ dysfunction, supporting biomarker-aligned assessment of renal toxicity or repair.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable imaging capability that can be applied across multiple developmental models and organ systems with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking genetic perturbation to observable developmental defects in a physiological context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through hardware-based drift correction (autofocus, relocation grids) and standardized embryo preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, visual confirmation of pathway modulation in a whole-organism assay.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on severity and specificity of developmental phenotypes observed in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and embryo staging for successful application.
- Dependent on fluorescence dissecting microscope with z-stack capability and software supporting autofocus and stage repositioning.
- Necessitates standardization of agarose embedding and embryo orientation to ensure consistent imaging quality across users and sessions.
- Adaptation to other organs or models may require changes in transgenic reporters, injection timing, or developmental staging.
- Practical limitations include lower throughput compared to automated systems and manual effort required for drift monitoring when autofocus is not used.
