Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

Het algemene doel van dit experiment is om MyoD-eiwitpartners grondig te karakteriseren. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in het veld van de skeletspierbiologie, zoals moleculaire regulatie van skeletspiertonusdeformatie door de belangrijke spiertranscriptiefactor, MyoD. Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons toestaat om MyoD-partners te ontrafelen die selectief een lage abundantie hebben, één gelokaliseerd in één specifiek subnucleair compartiment.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de regulatie van spierdifferentiatie, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere weefsels, specifiek nucleaire differentiatie. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Lauriane Fritsch, een onderzoeksassistent uit ons laboratorium. In dit protocol zullen MyoD-complexen worden gezuiverd uit HeLa S3-cellen die stabiel MyoD met FLAG glutenine-tags tot expressie brengen.

HeLa S3-cellen getransduceerd met de lege vector zullen worden gebruikt als controle. Beide cellijnen werden eerder gekweekt, verzameld en bewaard bij min 80 graden Celsius, zoals beschreven in de protocoltekst. Ontdooi de cellensedimenten snel in een waterbad op 37 graden Celsius.

Alle buffers en homogenisatoren moeten worden voorgekoeld en deze hele procedure moet worden uitgevoerd in een koude ruimte. Typisch worden 20 gram cellen gebruikt voor elk experimenteel punt, maar voor de doeleinden van deze demonstratie worden slechts 10 gram, of ongeveer 10 ml cellen, verwerkt. Resuspendeer de cellen in 10 ml hypotone buffer A, door eerst 5 ml van de buffer te gebruiken.

Voeg vervolgens 2,5 ml toe, gevolgd door nog eens 2,5 ml. Was de pipet goed met verse buffer om het maximale aantal cellen te krijgen. Breng 20 ml van de cellsuspensie over in de voorgekoelde homogenisator met een goed passende stamper.

Homogeniseer de cellen met 20 slagen. Breng de cellsuspensie over in een 50 milliliter buisje. Voor maximale herstel van cellen, was de homogenisator met 3,5 ml sucrosebuffer.

Breng deze suspensie snel over in de 50 ml buis om de kernen te behouden en lekkage te beperken. Kleur een 30 microliter aliquot van de cellsuspensie met 30 microliter 4% Trypan Blauw en analyseer onder de microscoop om de lysisefficiëntie te bepalen. Alle kernen moeten blauw zijn als de lysis succesvol is.

Herhaal indien nodig de homogenisatie. Centrifugeer gedurende zeven minuten bij 10.000 x g en vier graden Celsius om de kernen te pelleten. Bewaar het supernatant als een cytoplasmatisch fractie.

Begin de procedure voor het bereiden van de nucleaire zout extracteerbare fractie door de kernenpellet opnieuw op te schorsen in 4 ml sucrosebuffer. Voeg vervolgens 4 ml hoge zoutbuffer druppel voor druppel toe terwijl je grondig mixt op een vortex om een eindconcentratie van 300 mM natriumchloride te krijgen. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs met elke vijf minuten mixen.

Verlaag vervolgens de natriumchlorideconcentratie tot 150 mM door 8 ml sucrosebuffer toe te voegen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 x g en vier graden Celsius. Verzamel het supernatant, dat de zout extracteerbare fractie is, en laat het op ijs.

Om de chromatine gebonden fractie voor te bereiden, resuspendeer het pellet zorgvuldig in 3,5 ml sucrosebuffer. Voeg calciumchloride toe tot een eindconcentratie van 1 mM en mix. Het calciumchloride zal de micrococcische nuclease activeren die later zal worden toegevoegd.

Verwarm de suspensie gedurende één minuut op 37 graden Celsius. Voeg 35 microliter van een micrococcische nuclease stamkleurstof van 5 eenheden per microliter toe om een eindconcentratie van 25 10 duizendste eenheid per microliter te krijgen. Incubeer gedurende exact 12 minuten op 37 graden Celsius.

Mix elke vier minuten. Plaats na 12 minuten onmiddellijk de reactie op ijs. Om de micrococcische nuclease activiteit te stoppen, voeg 56 microliter van 5 molair EDTA pH 8,0 toe tot een eindconcentratie van 4 mM en vortex.

Incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Soniceer vijf keer gedurende één minuut elke keer op hoge amplitude met een pauze van één minuut tussen de sonicaties. Centrifugeer zowel de zout extracteerbare als de nucleosoom verrijkte fracties gedurende 30 minuten bij 85.000 x g bij vier graden Celsius.

Verzamel de supernatanten. De zout extracteerbare fractie zou ongeveer 13 ml moeten zijn. En de nucleosoom verrijkte fractie zou ongeveer 6 ml moeten zijn.

MyoD-eiwitcomplexen zullen worden gezuiverd door dubbele affiniteitszuivering. Aangezien de procedures voor FLAG-gebaseerde en HA-gebaseerde zuivering vergelijkbaar zijn, wordt alleen de FLAG-gebaseerde zuivering gedemonstreerd. Na toevoeging van TEGN brengt u het geschikte volume van FLAG-hars over in een 50 ml buisje.

300 microliters van FLAG-hars van de commerciële 50% voorgewassen FLAG-hars is nodig voor elk experimenteel punt. Centrifugeer gedurende twee minuten bij 1.000 x g. Verwijder het supernatant, voeg koud TEGN toe en centrifugeer opnieuw.

Was de FLAG-hars met koud TEGN in totaal vijf keer. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de FLAG-hars in een gelijk volume van TEGN. Voor elk experimenteel punt, meng 300 microliters van de gewassen FLAG-hars en het overeenkomstige eiwitextract.

Gebruik een 15 ml buis voor de nucleosoom verrijkte fractie en een 50 ml buis voor de zout extracteerbare fractie. Incubeer de buisjes gedurende een nacht op een roterende wiel bij vier graden Celsius. Op de volgende dag, centrifugeer alle buisjes gedurende twee minuten bij 1.000 x g bij vier graden Celsius.

Verzamel de supernatanten en bewaar ze bij vier graden Celsius tot het resultaat van de zuiveringsefficiëntietest is verkregen. Voor de zout extracteerbare monsters, resuspendeer de FLAG-hars in 4 ml van TEGN en breng over naar een 15 ml buisje. Herhaal deze stap drie keer, telkens overbrengen naar dezelfde 15 ml om parels te vermijden.

Centrifugeer gedurende