Name: Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Leer MyoD-eiwitpartners identificeren met tandem-affiniteitszuivering en massaspectrometrie in HeLa S3-cellen. Deze methode onthult laagfrequente interacties in subnucleaire compartimenten voor spierbiologieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het Ait-Si-Ali-lab werd ondersteund door de Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot en het 'Wie ben ik?' Laboratory of Excellence #ANR-11-LABX-0071 gefinancierd door de Franse regering via haar 'Investeringen voor de Toekomst' programma beheerd door de ANR onder subsidie #ANR-11-IDEX-0005-01. EB werd ondersteund door een INCa-subsidie.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gepresenteerde methode maakt uitputtend identificatie van partners van een transcriptiefactor, MyoD. Geopenbaard MyoD partners in een heteroloog systeem resistent tegen MyoD geïnduceerde differentiatie, namelijk HeLa-S3-cellen. Dus per definitie, die MyoD partners zijn alomtegenwoordig uitgedrukt. Deze omvatten algemene en sequentie-specifieke transcriptiefactoren, chromatine-modificerende enzymen, RNA verwerking eiwitten, kinasen (tabellen 1 en 2). Omdat HeLa-S3-cellen zijn resisten...

Eukaryote multicellulaire organismen zijn samengesteld uit verschillende organen en weefsels. Elke functionele weefsel heeft een specifiek gen-expressie patroon dat wordt bepaald bij elke differentiatiestap. Celdifferentiatie omvat activering van specifieke genen, onderhoud van hun expressie en algemeen zwijgen van een aantal genen, die betrokken zijn bij celproliferatie. Skeletspierdifferentiatie of myogenese, dus een meerstaps-proces, dat begint met het bepalen van mesodermale stamcellen in myoblasten en vervolgens leidt tot de differentiatie van deze myoblasten in eerste mono-kernhoudende en vervolgens meerdere kernen, myotubes . Zo myoblasten worden &#39;bepaald&#39; cellen, die nog steeds in staat zijn te laten groeien, maar ze zijn toegewijd aan de skeletspieren afstamming, en kan dus alleen differentiëren in skeletspiercellen ofwel tijdens de embryonale ontwikkeling of bij volwassen spier regeneratie. Het proces van de skeletspieren terminal verschillenentiation wordt georkestreerd door een specifieke genetische programma dat begint met de permanente verlaten de celcyclus van myoblast precursorcellen die leidt tot een definitieve silencing van proliferatie geassocieerde genen, zoals E2F doelgenen 1. Inderdaad, tijdens het proces van terminale differentiatie, proliferatie van myoblasten arrestatie een cruciale stap die de expressie van specifieke genen skeletspier en fusie van myoblasten in myotubes 2 voorafgaat. Een dergelijk programma maakt spier stamcellen volwassen, ook wel satelliet-cellen, om te differentiëren tijdens het regeneratieproces volgende skeletspieren letsel. Zoogdieren myogenesis is sterk afhankelijk van een familie van myogene basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactoren MyoD, Myf5, MRF4 en myogenin, vaak aangeduid als de familie van de skeletspieren bepaling factoren of MRFs (Muscle Regulatory Factors) 3. Elk van hen speelt een essentiële rol in de specificatie en differentiatie van de skeletspieren cellen en heeft een specifieke uitdrukking patroon 5-7 april. De activering van Myf5 en MyoD vormt de bepalende stap die cellen verbindt aan de myogene lineage, en daaropvolgende expressie van myogenin triggers myogenesis met activatie van skeletspieren specifieke genen, zoals MCK (Muscle Creatine Kinase). Myogene bHLH transcriptiefactoren samen met leden van de familie MEF2 in de activatie van spier- genen uit eerder stille loci 8. Ze stimuleren ook de skeletspier gentranscriptie als heterodimeren met alomtegenwoordige bHLH eiwitten, E12 en E47, bekend als E-eiwitten, die de zogenaamde E-dozen in diverse gen-regulatoire gebieden 8 te binden. Twist, Identiteitskaart (remmer van differentiatie) en andere factoren negatief regelen dit proces, door te concurreren met MyoD voor E eiwitten binden 8. MyoD wordt beschouwd als de voornaamste speler in triggering spier terminale differentiatie 9 </sup&gt; aangezien het het vermogen tot bepaling myogene / differentiatie (trans-differentiatie) programma in vele volledig gedifferentieerde non-spiersystemen 10-13 induceren. Inderdaad, gedwongen expressie van MyoD induceert de trans-differentiatie van verschillende celtypes zelfs die afgeleid van een ander embryonale oorsprong 12. Zo kan MyoD hepatocyten, fibroblasten, melanocyten, neuroblasten, en adipocyten zetten in spier-achtige cellen. De trans-differentiërende werking van MyoD omvat een abnormale activatie van het myogene genetische (met name de doelwitgenen) in een niet-musculaire omgeving, gelijktijdig aan de onderdrukking van de genetica`s (met name, proliferatie genen). In prolifererende myoblasten, wordt MyoD uitgedrukt, maar is niet in staat om zijn doel genen te activeren, zelfs wanneer het zich bindt aan hun promotoren 14-16. Daarom is de eis MyoD continu worden uitgedrukt in niet-gedifferentieerde myoblasten steeds vrij elusive. MyoD kon zijn doel genen als gevolg van de aanwerving van repressieve chromatine modificerende enzymen onderdrukken in delende myoblasten vóór het laden van het activeren van chromatine remodeling enzymen 14,17. Bijvoorbeeld, in prolifererende myoblasten, MyoD is geassocieerd met transcriptionele co-repressor KAP-1, histondeacetylasen (HDACs) en repressieve lysine methyltransferasen (kmts), waaronder histon H3 lysine 9 of H3K9 en H3K27 kmts en actief onderdrukken de doelwitgenen expressie door de oprichting van een lokaal repressieve chromatinestructuur 14,17. Belangrijk is dat een recent rapport blijkt dat MyoD zelf direct gemethyleerd door de H3K9 KMT G9a wat resulteert in de remming van zijn transactiverende activiteit 16. De epigenetische mechanismen betrokken bij de trans-differentiatie van niet-spiercellen door MyoD grotendeels onbekend. Met name sommige cellijnen resistent tegen MyoD geïnduceerde trans-differentiatie. Dus in HeLa-cellen, MyoD is inactief ofzelfs functioneren dan repressor plaats van transcriptie-activator door gebrek aan expressie van de BAF60C subeenheid van chromatine remodeling complex SWI / SNF 18. Dit model kan dus gekozen om beter te karakteriseren van de mechanismen van MyoD geïnduceerde genrepressie. Het is ook geschikt om het vermogen van MyoD repressieve chromatine milieu veroorzaken bij zijn doel loci met de daarbij behorende partners en dus ontdek de MyoD-afhankelijke repressieve mechanismen in delende myoblasten te fine-tunen terminale differentiatie testen. Hier beschrijven we het protocol voor de identificatie van MyoD partners met behulp van Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) karakterisering. Het gebruik van HeLa-S3-cellen stabiel tot expressie Flag-HA-MyoD toegestaan ​​voldoende materiaal naar de MyoD complexen van gefractioneerde kernextracten zuiveren. De identificatie van MyoD partners in het heterologe systeem volgde validatiop in een relevante systeem.

<table><tbody><tr><td>Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Utrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer:&nbsp; Dounce homogenisator&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 en 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Agitatieapparaat voor spinners</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Laag-bindende buizen</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Lege draaikolom</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide 4-12%&nbsp; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x laadbuffer&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x reducerend middel</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Zilverkleuringskit</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeerfiltereenheden, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Protein G agarose kralen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G&nbsp; Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Flag resin (anti-Flag M2-agarose affiniteitsgel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA resin (monoklonaal Anti-HA agarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Flag vrij peptide (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Aangepaste synthese</td><td>Resuspendeer tot 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td></tr><tr><td>HA vrij peptide (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Aangepaste synthese</td><td>Resuspendeer tot 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid-gebaseerde eiwitanalysekit : BCA-kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteïneremmers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Luminol-gebaseerde versterkte chemiluminescentie (ECL) HRP-substraat</td><td>Life technologies</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Gesneden zalmzaad DNA (Deoxyribonucleïnezuur natriumzout uit zalmtestes)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Spermine tetrahydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS running buffer</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (hoge glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Voorverwarmen&nbsp; bij 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05% fenolrood</td><td>Life technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Serum</td><td>GE healthcare life sciences&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Elk lot serum moet eerst worden getest voor uw cellen.</td></tr><tr><td>Penicilline en Streptomycine&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw-oplossing, 0,4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Water (steriel gefilterd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA van rat (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Te gebruiken voor western blotting</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>Te gebruiken voor immunoprecipitatie en western blotting</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Muis</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Konijn</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-rat -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van myod interactoomanalyse gebruik van tandem affinity purification gekoppeld aan massaspectrometrie

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletspieren terminale differentiatie begint met de inzet van pluripotente mesodermale voorlopercellen te myoblasten. Deze cellen nog steeds de proliferatie- of ze kunnen differentiëren en zekering in meerkernige myotubes, die verder rijpen om myovezels te vormen. Skeletspieren terminale differentiatie wordt georkestreerd door de gecoördineerde actie van de verschillende transcriptiefactoren, in het bijzonder de leden van de Muscle Regulatory Factors of MRFs (MyoD, myogenin, Myf5 en MRF4), ook wel de myogene bHLH transcriptiefactoren familie. Deze factoren werken samen met chromatine-remodeling complexen binnen uitgewerkte transcriptie regulerende netwerk om het skelet myogenesis bereiken. Hierbij wordt MyoD beschouwd als de meester myogene transcriptiefactor bij het ontstaan ​​van de spieren terminale differentiatie. Deze opvatting wordt versterkt door het vermogen van MyoD niet-spiercellen zetten in skeletspiercellen. Hier beschrijven we een aanpak gebruikt om MyoD identificereneiwitpartners limitatief om de verschillende factoren die bij skeletspier differentiatie helderen. De lange-termijn doel is om de epigenetische mechanismen die betrokken zijn bij de regulatie van de skeletspieren genen, dwz., MyoD doelen begrijpen. MyoD partners worden aangegeven met Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) vanaf een heteroloog gekoppeld met massaspectrometrie (MS) karakterisering, gevolgd door validatie van de rol van de relevante partners in skeletspier terminale differentiatie. Afwijkende vormen van myogene factoren, of de afwijkende regelgeving, worden geassocieerd met een aantal van spieraandoeningen: aangeboren myasthenia, myotone dystrofie, rhabdomyosarcoom en gebreken in de spieren regeneratie. Als zodanig myogene factoren een pool van mogelijke therapeutische doelwitten in spieraandoeningen, zowel wat de mechanismen die ziekte zelf en regeneratieve mechanismen die ziektebehandeling kunnen verbeteren veroorzaken. Zo is de gedetailleerde understanding van de intermoleculaire interacties en genetische programma gecontroleerd door de myogene factoren essentieel voor een rationeel ontwerp van efficiënte therapieën.

Om de regulering van MyoD activiteit te begrijpen, ondernam we de volledige karakterisering van de MyoD complexen met behulp van biochemische zuivering, op basis van de immunozuivering van een dubbele tag vorm van MyoD gevolgd door massaspectrometrie (MS). Het gebruik van HeLa-S3 cellijn die vlag-HA-tag MyoD en een controle-cellijn die vlag-HA toelaat om genoeg materiaal om de MyoD complex te zuiveren door het uitvoeren van dubbel-affiniteitszuivering van Flag-HA-MyoD krijgen. <p cla...

MyoD is een myogene transcriptiefactor met een sterk vermogen om myogene transdifferentiatie van vele volledig gedifferentieerde niet-spiercellijnen te induceren. De epigenetische mechanismen die bij deze transdifferentiatie betrokken zijn, zijn grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een methode voor dubbele affiniteitszuivering, gevolgd door massaspectrometrie, om MyoD-partners uitputtend te karakteriseren.

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Het algemene doel van dit experiment is om MyoD-eiwitpartners grondig te karakteriseren. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in het veld van de skeletspierbiologie, zoals moleculaire regulatie van skeletspiertonusdeformatie door de belangrijke spiertranscriptiefactor, MyoD. Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons toestaat om MyoD-partners te ontrafelen die selectief een lage abundantie hebben, één gelokaliseerd in één specifiek subnucleair compartiment.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de regulatie van spierdifferentiatie, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere weefsels, specifiek nucleaire differentiatie. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Lauriane Fritsch, een onderzoeksassistent uit ons laboratorium. In dit protocol zullen MyoD-complexen worden gezuiverd uit HeLa S3-cellen die stabiel MyoD met FLAG glutenine-tags tot expressie brengen.HeLa S3-cellen getransduceerd met de lege vector zullen worden gebruikt als controle. Beide cellijnen werden eerder gekweekt, verzameld en bewaard bij min 80 graden Celsius, zoals beschreven in de protocoltekst. Ontdooi de cellensedimenten snel in een waterbad op 37 graden Celsius.Alle buffers en homogenisatoren moeten worden voorgekoeld en deze hele procedure moet worden uitgevoerd in een koude ruimte. Typisch worden 20 gram cellen gebruikt voor elk experimenteel punt, maar voor de doeleinden van deze demonstratie worden slechts 10 gram, of ongeveer 10 ml cellen, verwerkt. Resuspendeer de cellen in 10 ml hypotone buffer A, door eerst 5 ml van de buffer te gebruiken.Voeg vervolgens 2,5 ml toe, gevolgd door nog eens 2,5 ml. Was de pipet goed met verse buffer om het maximale aantal cellen te krijgen. Breng 20 ml van de cellsuspensie over in de voorgekoelde homogenisator met een goed passende stamper.Homogeniseer de cellen met 20 slagen. Breng de cellsuspensie over in een 50 milliliter buisje. Voor maximale herstel van cellen, was de homogenisator met 3,5 ml sucrosebuffer.Breng deze suspensie snel over in de 50 ml buis om de kernen te behouden en lekkage te beperken. Kleur een 30 microliter aliquot van de cellsuspensie met 30 microliter 4% Trypan Blauw en analyseer onder de microscoop om de lysisefficiëntie te bepalen. Alle kernen moeten blauw zijn als de lysis succesvol is.Herhaal indien nodig de homogenisatie. Centrifugeer gedurende zeven minuten bij 10.000 x g en vier graden Celsius om de kernen te pelleten. Bewaar het supernatant als een cytoplasmatisch fractie.Begin de procedure voor het bereiden van de nucleaire zout extracteerbare fractie door de kernenpellet opnieuw op te schorsen in 4 ml sucrosebuffer. Voeg vervolgens 4 ml hoge zoutbuffer druppel voor druppel toe terwijl je grondig mixt op een vortex om een eindconcentratie van 300 mM natriumchloride te krijgen. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs met elke vijf minuten mixen.Verlaag vervolgens de natriumchlorideconcentratie tot 150 mM door 8 ml sucrosebuffer toe te voegen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 x g en vier graden Celsius. Verzamel het supernatant, dat de zout extracteerbare fractie is, en laat het op ijs.Om de chromatine gebonden fractie voor te bereiden, resuspendeer het pellet zorgvuldig in 3,5 ml sucrosebuffer. Voeg calciumchloride toe tot een eindconcentratie van 1 mM en mix. Het calciumchloride zal de micrococcische nuclease activeren die later zal worden toegevoegd.Verwarm de suspensie gedurende één minuut op 37 graden Celsius. Voeg 35 microliter van een micrococcische nuclease stamkleurstof van 5 eenheden per microliter toe om een eindconcentratie van 25 10 duizendste eenheid per microliter te krijgen. Incubeer gedurende exact 12 minuten op 37 graden Celsius.Mix elke vier minuten. Plaats na 12 minuten onmiddellijk de reactie op ijs. Om de micrococcische nuclease activiteit te stoppen, voeg 56 microliter van 5 molair EDTA pH 8,0 toe tot een eindconcentratie van 4 mM en vortex.Incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Soniceer vijf keer gedurende één minuut elke keer op hoge amplitude met een pauze van één minuut tussen de sonicaties. Centrifugeer zowel de zout extracteerbare als de nucleosoom verrijkte fracties gedurende 30 minuten bij 85.000 x g bij vier graden Celsius.Verzamel de supernatanten. De zout extracteerbare fractie zou ongeveer 13 ml moeten zijn. En de nucleosoom verrijkte fractie zou ongeveer 6 ml moeten zijn.MyoD-eiwitcomplexen zullen worden gezuiverd door dubbele affiniteitszuivering. Aangezien de procedures voor FLAG-gebaseerde en HA-gebaseerde zuivering vergelijkbaar zijn, wordt alleen de FLAG-gebaseerde zuivering gedemonstreerd. Na toevoeging van TEGN brengt u het geschikte volume van FLAG-hars over in een 50 ml buisje.300 microliters van FLAG-hars van de commerciële 50% voorgewassen FLAG-hars is nodig voor elk experimenteel punt. Centrifugeer gedurende twee minuten bij 1.000 x g. Verwijder het supernatant, voeg koud TEGN toe en centrifugeer opnieuw.Was de FLAG-hars met koud TEGN in totaal vijf keer. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de FLAG-hars in een gelijk volume van TEGN. Voor elk experimenteel punt, meng 300 microliters van de gewassen FLAG-hars en het overeenkomstige eiwitextract.Gebruik een 15 ml buis voor de nucleosoom verrijkte fractie en een 50 ml buis voor de zout extracteerbare fractie. Incubeer de buisjes gedurende een nacht op een roterende wiel bij vier graden Celsius. Op de volgende dag, centrifugeer alle buisjes gedurende twee minuten bij 1.000 x g bij vier graden Celsius.Verzamel de supernatanten en bewaar ze bij vier graden Celsius tot het resultaat van de zuiveringsefficiëntietest is verkregen. Voor de zout extracteerbare monsters, resuspendeer de FLAG-hars in 4 ml van TEGN en breng over naar een 15 ml buisje. Herhaal deze stap drie keer, telkens overbrengen naar dezelfde 15 ml om parels te vermijden.Centrifugeer gedurende

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

We presenteren een geoptimaliseerd tmt-labelprotocol (tandem mass tag) dat gedetailleerde informatie bevat voor elk van de volgende stappen: eiwitextractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering, indiening bij een proteomics-faciliteit en gegevensanalyses.

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Leer MyoD-eiwitpartners identificeren met tandem-affiniteitszuivering en massaspectrometrie in HeLa S3-cellen. Deze methode onthult laagfrequente interacties in subnucleaire compartimenten voor spierbiologieonderzoek.

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

Meer video's verkennen