Name: Gericht op biofilm geassocieerde Staphylococcus aureus Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer een resazurine-gebaseerde gevoeligheidsassay voor biofilm-geassocieerde Staphylococcus aureus. Deze methode maakt reproduceerbare groei van bacteriële biofilms in 96-well platen mogelijk voor antibioticumscreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Saran Kupul voor de technische assistentie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie R01-AI104952 aan FW. Verdere ondersteuning werd verleend door het University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), een door NIH gefinancierd programma (P30 AI027767) dat mogelijk werd gemaakt door de volgende NIH-instituten: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA.

1. Biofilm Initiatie <ol><li> Grow een cultuur van biofilm produceren organisme in een voedselrijke medium. Inoculeer Staphylococcus aureus stam Newman in 10 ml Mueller-Hinton medium uit een glycerol voorraad. Voer alle werkzaamheden waarbij het ​​hanteren van S. aureus met handschoenen en binnen een bioveiligheid kast. </li><li> Incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C op een roterende schudinrichting (100-200 rpm). </li><li> Bepaal de OD 600 van de cultuur met behulp van een spectrofotometer en een standaard cuvette (weglengte: 1 cm). </li><li> Bereken het volume (V) van de cultuur om voorbereidende 20 ml inoculum bij OD 600 (entmateriaal) van 0,1 in chelexed Roswell Park Memorial Institute medium (CRPMI) 9 met de formule: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (cultuur )] Let op: Reference 9 geeft details over CRPMI voorbereiding. <ol><li> Voeg de berekende kweekvolume (van boven) naar een centrifugebuis en pellet cellen door spinnen gedurende 1 min bij 10.000 x g. om preparre biofilm entstof, zuigen de gebruikte groeimedium en resuspendeer celpellet in 20 ml CRPMI. </li></ol></li><li> Giet entstof in een 25 ml reservoir. </li><li> Haal het deksel van een steriele 96-well peg plaat door recht omhoog te trekken. Opmerking: Let erop dat de pennen opknoping vaststelling van het deksel niet te besmetten. De deksel kan ondersteboven op een schone ondergrond binnen een bioveiligheid kast worden geplaatst. </li><li> Met behulp van een 200 gl multichannel pipet 125 ul inoculum aan elk putje rijen A tot en met G van de bodemplaat. </li><li> Vul 125 ul steriel CRPMI medium in elk putje van de toer H als een steriliteit controle. </li><li> Neem de peg-deksel en houd deze boven de plaat bodem met de pinnen naar beneden. Lijn de individuele pinnen met hun respectievelijke putten. Vermijd fysiek contact tussen de plaat en de haringen. Eenmaal uitgelijnd, laat de deksel voorzichtig naar beneden. Vermijd verplaatsingen zoals aanpassingen uitgevoerd nadat de pinnen hebben raakte de bodemplaat kunnen contaminate steriliteit controles in rij H. </li><li> Sluit de deksel op de plaat met paraffine film verdamping plaats en voorkomen in een afsluitbare kunststof zak, verzegelen goed. Houd het luchtvolume in de zak zo laag mogelijk om verdamping te minimaliseren. </li><li> Incubeer zonder schudden bij 37 ° C gedurende 48 uur in een 5% CO2 incubator. Opmerking: 48 h groei optimale al S. aureus, maar zal variëren op basis van het gebruikte organisme. Opmerking: hoewel statische incubatie is een goed uitgangspunt om de test te optimaliseren, zachtjes schudden bij 150 rpm op een microplaat shaker is een mogelijke variatie die biofilm vorming van een aantal S. kan versterken aureus isolaten. </li></ol> 2. Voorbereiding van de biofilm Challenge Plate <ol><li> Op de dag van de biofilm uitdaging een nieuwe 96-well plaat en voeg 100 pl CRPMI, geëquilibreerd tot kamertemperatuur, aan elk putje rijen B tot H te inconsistente resultaten te vermijden, maken gebruik van een 96-well plaat die 200 gl kan bevattenvan media wanneer de pennen zijn binnen, en beschikt putjes met afmetingen gelijk aan die van de biofilm opening plaat. </li><li> Verdun tot 4 testverbindingen afzonderlijk in 1,0 ml CRPMI de gewenste eindconcentratie 2x, teneinde rekening te houden met een eindverdunning in stap 2,7. Opmerking: Een goed startpunt is 8-voudig boven de remmende concentratie van planktonische cellen. </li><li> Voeg 200 ul van verbinding 1 in putten A1 tot A3, verbinding 2 in putjes A4 tot A6, verbinding 3 in putjes A7 naar de A9 en de verbinding 4 in putjes A10 naar A12. </li><li> Serieel verdunde testverbindingen door een multichannel pipet overgebracht 100 ul van rij A naar B rij en meng. </li><li> Op die manier blijft 100 pl dragen tot goed. Meng na elke overdracht en stoppen in rij F. </li><li> Na mengen verdrijven 100 pi van rij F in een afvalcontainer. Gebruik geen vloeistof over te dragen aan rijen G en H. </li><li> Voeg 100 ul van CRPMI aan elk putje van de plaat met een multichannel pipetbreng het volume op 200 pi. Zie figuur 1 voor de uiteindelijke plaat lay-out. </li></ol> 3. Biofilm Challenge <ol><li> Voeg 200 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) een nieuwe steriele 96-well plaat wells met afmetingen die gelijk zijn aan die van de biofilm opening plaat kenmerkt. </li><li> Verwijder de plastic zak en paraffine film van bebroede biofilm initiatie plaat. </li><li> Til het deksel recht omhoog. contact tussen de pennen en de plaatbodem als dit te vermijden kan de biofilm beschadigen. Houd onderste deel voor verdere OD 600 analyse (zie 3.8). </li><li> Afspoelen plankton cellen door het plaatsen van de pin-deksel op de plaat met PBS (uit stap 3.1). Dompel haringen voor 5 sec, til PBS, en nog een keer onder water, zorg dat u de haringen tegen de put zijkanten niet te raken. </li><li> Plaats de gespoeld peg-deksel in de uitdaging plaat. Vermijd onnodig contact tussen haringen en bodemplaat, omdat dit schade zal toebrengen aan de biofilm leidt totinconsistente resultaten. </li><li> Afdichtplaat paraffine folie en plaats in een afsluitbare kunststof zak als beschreven in stap 1.10. </li><li> Incubeer de plaat zonder schudden gedurende 24 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. </li><li> Neem onderkant van biofilm initiatie plaat van 3,3. Resuspendeer de bacteriën in elk putje met een multichannel pipet en meet de OD 600 met een geschikte microplaat reader groei bevestigen zich in alle putjes maar steriliteitscontrole in rij H. </li></ol> 4. Biofilm Bepaling <ol><li> Gebruik een plaatlezer uitgerust met een incubatiekamer en in staat om kinetische fluorescentie metingen voor het detecteren resazurin conversie. Het opzetten van een 24-uurs kinetische fluorescentie meting met behulp van een 530 nm excitatie en 590 nm emissie. </li><li> Stel de kamertemperatuur tot 37 ° C en hebben de plaat lees elke 20 min. Zet de plaat reader meten van de bodem van de plaat volgens de instructies van de fabrikantgen. </li><li> Bereid wassen plaat door het toevoegen van 200 ul PBS met een multichannel pipet naar een steriele 96 wells plaat. </li><li> Bereid biofilm herstelmedium door toevoeging van 400 pl 0,8 mg / ml resazurine stockoplossing aan 20 ml CRPMI medium tot een uiteindelijke concentratie van 16 ug / ml resazurine. Let op: Resazurin is een bekend irriterend voor de huid. Gebruik een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen tijdens het hanteren. CRPMI de biofilm recovery medium werd gebruikt omdat het de laagste achtergrondsignaal, maar kan worden vervangen door Mueller Hinton media indien nodig. </li><li> Voeg 150 ul van biofilm recovery medium met een multichannel pipet aan elk putje van een verse 96-well plaat. </li><li> Transfer uitdaging plaat uit incubator in een bioveiligheid kast en verwijder voorzichtig plastic zak en verzegeling film. </li><li> Verwijder de peg-deksel van de uitdaging plaat en spoel af plankton cellen in PBS, zoals beschreven in 3.4. Houd de onderkant van de uitdaging dienblad daaropvolgende OD 600 analysis (zie 4.10). </li><li> Na het spoelen, plaatst u de pin-deksel in de plaat bodem met de biofilm herstel medium. </li><li> Wikkel de zijkant van de plaat met paraffine film, zorg dat u de onderkant van de perimeter putten niet te hinderen. Onmiddellijk na het verpakken van de plaat, leg het op de plaat lezer en start een kinetische gelezen over een periode van 24 uur door het initiëren van de eerder gemaakte resazurin kinetische protocol uit stap 4.1. </li><li> Groei van planktonische cellen die al dan niet optreden tijdens challenge kwantificeren, lees de OD 600 van de hele uitdaging plaatbodem met een microplaat reader. Volg de instructies gegeven in stap 3.8. Opmerking: Voorzichtig resuspenderen van de inhoud van elk putje en cellen afstoten van de biofilm neiging om te groeien in groepjes aan de bodem van de put. Luchtbelletjes in de put zal sterk beïnvloeden OD600 metingen en moeten worden vermeden of verwijderd voorafgaand aan het lezen. </li></ol>

<ol><li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthesis+infections+after+orthopedic+joint+replacement%3A+the+possible+role+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Rev+%28Pavia%29%22%5BJournal%5D)">Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms.</a> Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases).</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Bordi, C., de Bentzmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hacking+into+bacterial+biofilms%3A+a+new+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intensive+Care%22%5BJournal%5D)">Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge.</a> Ann Intensive Care. 1, 19(2011).</li>
<li>Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+laboratory+reference+strains+mirror+%27real-world%27+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis?</a> Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).</li>
<li>Kwasny, S. M., Opperman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+biofilm+cultures+of+Gram-positive+pathogens+grown+in+a+microtiter+format+used+for+anti-biofilm+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery.</a> Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MBEC+Assay+System%3A+multiple+equivalent+biofilms+for+antibiotic+and+biocide+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing.</a> Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Baker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+stress+induces+a+global+stress+response+in+Staphylococcus+aureus+and+represses+sae+and+agr+expression+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation.</a> Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).</li>
<li>Haeili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+complexation+screen+reveals+compounds+with+potent+antibiotic+properties+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).</li>
<li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+minimal+bactericidal+concentration+of+an+antimicrobial+agent+for+planktonic+cells+%28MBC-P%29+and+biofilm+cells+%28MBC-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B).</a> J Vis Exp. (83), e50854(2014).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persisters%3A+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53(2006).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riddle+of+biofilm+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een gemodificeerde biofilm gekwantificeerd door activiteit van geteste remmers op S. aureus biofilms gericht op de metabole toestand van biofilm geassocieerde cellen. Terwijl de beschreven biofilm initiatie en beroepsprocedures veelal nagebootste aanbevelingen van de fabrikant, het gebruik van Resazurin kleurstof-biofilm geassocieerde cellen die een 24-uurs-remmer uitdaging overleven detecteren en te kwantificeren vereenvoudigt volgens de methode van de cel herstel (via waterbad sonificatie)...

Pathogene bacteriën kunnen biofilms in vivo leidt tot niet-acute chronische infecties 1 vormen. Biofilm geassocieerde infectie is een ernstige risicofactor van medische procedures die de implantatie van vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld kunstbot vervangingen, borstimplantaten) of de installatie van tracheale buizen of urine-katheters 2 te betrekken. In deze context, anti-infectieuze therapie is vrijwel altijd nodig als biofilm-gebaseerde infecties zelden gewist als zodanig, zelfs bij immuuncompetente individuen. Staphylococcus aureus is een van de meest voorkomende pathogenen betrokken in biofilm-gerelateerde complicaties optreden gedurende het gebruik van invasieve medische hulpmiddelen 3. Helaas, de aard van biofilms als een beschermende barrière maakt ze beter bestand zijn tegen de behandeling dan plankton cellen 1,4, en de evaluatie van de voorspelde klinische werkzaamheid is een cruciaal onderdeel van zowel de initiëlegeneesmiddelontwikkeling en resistentie surveillance. Er is steeds meer erkenning dat laboratoriumomstandigheden, gericht op planktonische culturen, mag niet getrouw vertegenwoordigen real-world ziekte 5. Verdere compounding het probleem, replicatie van biofilm fenotypes is moeilijk, en de bestaande biofilm modellen zijn vervelend en lijden aan hoge inter- en intra-assay variabiliteit 6. Zo veel onderzoekers, noodgedwongen uit standaard planktonische celbepalingen drug gevoeligheid, waardoor mogelijk dat daarbij een belangrijk aspect van bacteriële virulentie en ziekte. Hier beschrijven we het protocol voor het testen van bacteriën, in het bijzonder S. aureus, in pre-biofilms gegroeid onder toepassing van een 96 putjes gebaseerde biofilmsysteem 7,8. Terwijl het protocol voor de vorming en uitdaging biofilm volgt in wezen de aanbeveling van de fabrikant, presenteren we een alternatieve informatie-rijke methodologie voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van de BIOFilm na challenge. Kort bacteriën worden gekweekt in de penplaat, waarbij biofilms gevormd op de uitstekende pennen bevestigd aan het deksel van de plaat. Na de vorming van biofilm, worden de haringen zachtjes gedoopt in putjes van een nieuwe plaat gevuld met PBS om plankton cellen te verwijderen. De peg-deksel, met biofilms bevestigd, wordt overgebracht naar een nieuwe uitdaging plaat gemaakt met verschillende concentraties antibiotica te testen. Na een tweede incubatie worden deksels weer verwijderd, gewassen en overgebracht naar een plaat die herstel Resazurin kleurstof, waar een laatste incubatie. Resazurin conversie kan kinetisch worden opgenomen of genomen als een eindpunt lezen na een bepaalde herstelperiode. Deze dye-gebaseerde methode voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van biofilms verschilt aanzienlijk van de vervelende CFU (kolonievormende eenheden) count-gebaseerde methode in het oorspronkelijke protocol 7 beschreven. OD 600 metingen van de drug uitdaging bord en resazurin conversie kinetiek dienen als levensvatbaarheid gelezenouts van planktonische en biofilm cellen, respectievelijk, het aanbieden van een snelle, betrouwbare, informatie-rijke en technisch eenvoudige test voor biofilm te overleven.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>Volg de aanbevelingen van de fabrikant</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Corning&nbsp;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 medium chelexed gedurende 1 uur met Chelex 100 resin en vervolgens aangevuld met 10% onchelexed RPMI-1640</td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>Bio Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC-platen</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>800 &micro;g/ml in DI water&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Filter steriel</td></tr><tr><td>Micro Plate Shaking Platform&nbsp;</td><td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Opname en analyse van resazurin conversie</td></tr><tr><td>Neocuproine</td><td>Sigma</td><td>N1501&nbsp;</td><td>bereid 10 mM stock in 100% Ethanol, bewaar bij -80 &ordm;C</td></tr><tr><td>Copper sulfate</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>bereid een 100 mM stockoplossing in water, bewaar bij 4 &ordm;C</td></tr><tr><td>Cu-Neocuproine</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Gegenereerd door gelijke molariteiten van neocuproine en kopersulfaat te mengen. Mix werd verdund in CRPMI medium tot de gewenste concentratie.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; met behulp van resazurin gebaseerd drug-gevoeligheid assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

De meeste pathogene bacteriën zijn in staat om biofilms te vormen tijdens infectie, maar vanwege de moeilijkheid van het manipuleren en beoordelen van biofilms, wordt het overgrote deel van het laboratoriumwerk uitgevoerd met planktonische cellen. Hier beschrijven we een peg plate-biofilm-assay zoals uitgevoerd met Staphylococcus aureus. Bacteriële biofilms worden gekweekt op pinnen bevestigd aan een 96-wells microtiterplaatdeksel, gewassen door middel van zachte onderdompeling in buffer, en geplaatst in een drug challenge-plaat. Na verdere incubatie worden ze opnieuw gewassen en verplaatst naar een laatste herstelplaat, waarin de fluorescerende kleurstof resazurin dient als levensvatbaarheidsindicator. Deze assay biedt een veel grotere gebruiksgemak, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid, evenals een schat aan gegevens wanneer het wordt uitgevoerd als een kinetische lezing. Bovendien kan deze assay worden aangepast aan een medium-throughput drug screening-benadering waarbij een eindfluorescentie-uitlezing wordt gemaakt, wat een pad biedt voor drug discovery-inspanningen.

De resazurin test is gevoelig genoeg om zeer weinig levensvatbare cellen kan repliceren in drug vrij medium na challenge betrouwbaar detecteren. In deze methode, definiëren we de minimale biofilm uitroeiing concentratie als de laagste concentratie waarbij geen resazurin conversie waargenomen binnen 24 uur. De resazurin assay berust op oxidatieve moleculen gevonden in metabolisch actieve cellen die de kleurstof kleur omzetten van blauw naar roze. Kleurstof conversie is dus een indicatie v...

De meeste bacteriële infecties produceren een biofilm. Vanwege hun omgeving zijn biofilm-geassocieerde bacteriën vaak fenotypisch resistent tegen geneesmiddelen. Nieuwe antibacteriële moleculen die bacteriën in biofilms doden, hebben dus een hoge prioriteit. We stellen een test op om snel te screenen op antimicrobiële verbindingen die effectief zijn bij het uitroeien van biofilms.

Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Het algemene doel van deze procedure is om op eenvoudige en reproduceerbare wijze bacteriële biofilms te kweken in een 96-well plaatformaat op pegs die aan het deksel zijn bevestigd, voor antibioticagevoeligheidstesten met behulp van een levensvatigheids kleurstof. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontdekking en ontwikkeling van antibiotica door activiteiten te onderzoeken op biofilms-geassocieerde cellen, die vaak representatiever zijn voor infectietoestanden in vivo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om vooraf gevormde biofilms eenvoudig uit te dagen in een drieledige assay in een medium en de inhibitie te bepalen met een gangbare levensvatigheids kleurstof.Begin met het kweken van een cultuur van een biofilm-producerend organisme in een voedingsrijk medium. Inoculeer de Staphylococcus aureus-stam Newman vanuit een glycerolstock in 10 milliliters Muller-Hinton medium. Voer alle werkzaamheden waarbij S.aureus wordt gehanteerd uit met handschoenen en in een veiligheidskast.Incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C op een rotatieschudder. Voeg het berekende cultuurvolume toe aan een centrifugebuis en pellet de cellen door één minuut te centrifugeren bij 10.000 Gs. Om het biofilm-inoculum voor te bereiden, wordt het gebruikte groeimedium afgezogen en wordt de celpellet geresuspendeerd in 20 milliliter CRPMI. Voeg met een 200 microliter multichannelpipet 125 microliter inoculum vanuit een reservoir van 25 milliliter toe aan elke well van de rijen A tot G van de bodemplaat.Vul elk well van rij H met 125 µL steriel CRPMI-medium als steriliteitscontrole. Pak het peg-deksel en houd dit boven de bodem van de plaat met de pennen naar beneden gericht. Lijn de individuele pennen voorzichtig uit met de betreffende wells.Vermijd fysiek contact tussen de plaat en de pinnen. Zodra deze zijn uitgelijnd, wordt het deksel voorzichtig naar beneden bewogen. Afdicht het deksel op de plaat met paraffinefilm om verdamping te voorkomen en plaats het in een afsluitbare plastic zak, die stevig wordt dichtgesloten.Houd het luchtvolume in de zak zo laag mogelijk om verdamping te minimaliseren. Incubeer de plaat zonder schudden gedurende 48 uur bij 37 °C in een incubator met 5% Carbon Dioxide. Neem op de dag van de biofilm-challenge een nieuwe 96-well plaat en voeg 100 µL CRPMI, geëquilibreerd naar kamertemperatuur, toe aan elke well van rij B tot H. Verdun tot vier testverbindingen afzonderlijk in 1,0 mL CRPMI tot 2x de gewenste eindconcentratie.Voeg 200 µL van verbinding 1 toe aan putjes A1-A3. Voeg 200 µL van verbinding 2 toe aan putjes A4-A6. Voeg 200 µL van verbinding 3 toe aan putjes A7-A9. En voeg 200 µL van verbinding 4 toe aan putjes A10-A12. Verdun de testverbindingen serieel met behulp van een multichannel-pipet.Begin met het overbrengen van 100 µL van rij A naar rij B en meng dit. Zet dit proces voort door telkens 100 µL van putje naar putje over te brengen. Meng na elke overdracht en stop bij rij F. Verwijder na het mengen 100 µL uit rij F naar een afvalcontainer.Breng geen vloeistof over naar rijen G en H. Voeg tenslotte met een meerkanaals pipet 100 microliters CRPMI toe aan elke put van de plaat, om het eindvolume op 200 microliters te brengen. Voeg 200 microliters fosfaatgebufferde zoutoplossing toe aan een nieuwe, steriele 96-wellsplaat met putafmetingen die identiek zijn aan die van de biofilm-initiatieplaat. Verwijder vervolgens de plastic zak en de paraffinefilm van de geïncubeerde biofilm-initiatieplaat.Til het deksel recht omhoog en voorkom contact tussen de pinnen en de bodem van de plaat, omdat dit de biofilm kan beschadigen. Bewaar het onderste gedeelte voor de daaropvolgende OD600-analyse. Spoel planktonische cellen weg door het pindeksel op de plaat met PBS te plaatsen.Dompel de pinnen vijf seconden onder. Til ze uit de PBS en dompel ze nogmaals onder, waarbij u er alert op let dat de pinnen niet tegen de wanden van het well raakken. Plaats het gespoelde pindeksel in de challenge-plaat.Vermijd onnodig contact tussen de pinnen en de bodemplaat, aangezien dit de biofilm beschadigt, wat leidt tot inconsistente resultaten. Seal de plaat met paraffinefolie en plaats deze, zoals eerder beschreven, in een afsluitbare plastic zak. Incubeer de plaat, zonder schudden, gedurende 24 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2.Neem de bodem van de plaat voor biofilminitiatie en resuspendeer de bacteriën in elke put met een multichannelpipet. Meet de OD600 met een geschikte microplaatlezer om te bevestigen dat er groei heeft plaatsgevonden in alle putten, behalve in de steriliteitscontroles in rij H. Gebruik een plaatlezer die is uitgerust met een incubatiekamer en in staat is om kinetische fluorescentiemetingen uit te voeren voor het detecteren van de resazurine-omzetting. Stel een kinetische fluorescentiemeting van 24 uur in met een excitatie van 530 nanometer en een emissie van 590 nanometer.Stel de temperatuur van de kamer in op 37 °C en laat de plaat elke 20 minuten uitlezen. Stel de platenlezer in om vanaf de onderkant van de plaat te meten, conform de instructies van de fabrikant. Bereid het wassen van de plaat voor door met een multichannelpipet 200 µL PBS aan elke well van een steriele 96-wellplaat toe te voegen.Bereid vervolgens biofilmherstelmedium voor door 400 µL van een resazurin-stokoplossing van 0,8 mg/mL toe te voegen aan 20 mL CRPMI-medium, tot een eindconcentratie van 16 µg/mL resazurin. Voeg daarna met een multichannel-pipet 150 µL biofilmherstelmedium toe aan elke put van een nieuwe 96-wells plaat. Verplaats de challenge-plaat van de incubator naar een veiligheidskast voor biologische agentia en verwijder voorzichtig de plastic zak en de afdichtingsfolie.Verwijder het peg-deksel van de challenge-plaat en spoel de planktonische cellen af met PBS zoals voorheen, waarbij de bodem van de challenge-plaat bewaard wordt voor de daaropvolgende OD600-analyse. Plaats na het spoelen het peg-deksel in de plaatbodem die het medium voor biofilmherstel bevat. Wikkel de zijkant van de plaat in paraffinefolie, waarbij u er zorg voor draagt dat de bodem van de perimeterputjes niet wordt geblokkeerd.Plaats de plaat direct na het afdekken in de platenlezer en start een kinetische meting over een periode van 24 uur door het eerder gemaakte resazurine-kinetische protocol te activeren. Om de groei van planktonische cellen te kwantificeren die tijdens de challenge wel of niet kunnen optreden, wordt de OD600 van de gehele bodem van de challenge-plaat gemeten met een microplatenlezer. Hier wordt een voorbeeldindeling van een challenge-plaat getoond, waarbij twee volledige verdunningen worden gebruikt om de concentraties van de verbinding te titreren.Gegroeide biofilms werden behandeld met neocuproïne of het kopercomplex daarvan. OD600-metingen van de bodem van de challenge-plaat na 24 uur onthulden dat het neocuproïne-kopercomplex, maar niet neocuproïne alleen, het loslaten en de daaropvolgende groei van levensvatbare cellen uit behandelde biofilms voorkwam bij concentraties van 1,25 micromolair of hoger. De overeenkomstige biofilms werden vervolgens getest met de resazurine-assay.Visuele inspectie na 24 uur maakt een snel ja-nee antwoord mogelijk wanneer meerdere platen parallel worden uitgevoerd. Resazurine kleurt roze in wells met levensvatbare biofilms, maar blijft blauw wanneer de biofilm is geëlimineerd. Een kinetische meting van de resazurine-conversie kan concentratie-afhankelijke effecten op de levensvatbaarheid van de biofilm onthullen, zoals hier wordt aangetoond met gentamicin.De concentratieafhankelijke vertraging in het begin van de kleurstofconversie is indicatief voor een afname van de levensvatbaarheid van de biofilm. Het is bij het uitvoeren van deze procedure belangrijk om ervoor te zorgen dat de pinnen niet tegen de wand van de wells stoten.

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

Source: Bucher, T., et al. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how biofilm matrix integrity influences bacterial resistance to ethanol by comparing colony-forming units in untreated and inhibitor-disrupted biofilms. Reduced CFUs in inhibitor-treated samples demonstrate that the extracellular matrix is essential for protecting biofilm-embedded cells from antimicrobial stress.

Ethanol Resistance Assay to Evaluate Biofilm Matrix Integrity

Source: Zhang, M. et. al., Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the application of stimulated Raman scattering microscopy to assess susceptibility to antibiotics by tracking deuterium-labeled metabolic activity. By monitoring carbon–deuterium signals, the method enables rapid detection of resistant and susceptible bacterial populations.

Detection of Bacterial Antibiotic Susceptibility Using a Stimulated Raman Scattering Microscope

This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm's metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Biofilm-infecties vertonen een hoge tolerantie voor chemotherapie. Geen enkele test legt de complexiteit van biofilms vast. In plaats daarvan zijn aanvullende tests nodig. We presenteren een screeningsplatform (ontwikkeld voor S. aureus) dat assays voor levensvatbaarheid, biomassa en biofilmmatrix combineert. Het maakt ontdekking van anti-biofilm medicijnen mogelijk, inclusief de beoordeling van langdurige chemotherapeutische effecten.

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Dit protocol heeft tot doel te beschrijven hoe de mate van Staphylococcus aureus internalisatie en het vermogen om te overleven in de menselijke gastheercel kan worden bestudeerd, evenals de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen.

Verbeterde enzymbeschermingstest om staphylococcus aureus internalisatie en intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen te bestuderen

Deze methodologie maakt het mogelijk om een polymicrobieel biofilmmodel in cystische fibrose op te zetten voor antimicrobiële gevoeligheidstesten in onderzoeks- en klinische laboratoria. Dit model biedt nauwkeurige en betrouwbare resultaten over een reeks outputs.

Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Protocollen voor het gebruik van open systeem stroom biofilms met drip stroom reactoren en roterende schijf reactoren worden in detail.

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Leer een resazurine-gebaseerde gevoeligheidsassay voor biofilm-geassocieerde Staphylococcus aureus. Deze methode maakt reproduceerbare groei van bacteriële biofilms in 96-well platen mogelijk voor antibioticumscreening.

Gericht op biofilm geassocieerde

Meer video's verkennen