Gericht op biofilm geassocieerde

Het algemene doel van deze procedure is om op eenvoudige en reproduceerbare wijze bacteriële biofilms te kweken in een 96-well plaatformaat op pegs die aan het deksel zijn bevestigd, voor antibioticagevoeligheidstesten met behulp van een levensvatigheids kleurstof. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontdekking en ontwikkeling van antibiotica door activiteiten te onderzoeken op biofilms-geassocieerde cellen, die vaak representatiever zijn voor infectietoestanden in vivo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om vooraf gevormde biofilms eenvoudig uit te dagen in een drieledige assay in een medium en de inhibitie te bepalen met een gangbare levensvatigheids kleurstof.

Begin met het kweken van een cultuur van een biofilm-producerend organisme in een voedingsrijk medium. Inoculeer de Staphylococcus aureus-stam Newman vanuit een glycerolstock in 10 milliliters Muller-Hinton medium. Voer alle werkzaamheden waarbij S.aureus wordt gehanteerd uit met handschoenen en in een veiligheidskast.

Incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C op een rotatieschudder. Voeg het berekende cultuurvolume toe aan een centrifugebuis en pellet de cellen door één minuut te centrifugeren bij 10.000 Gs. Om het biofilm-inoculum voor te bereiden, wordt het gebruikte groeimedium afgezogen en wordt de celpellet geresuspendeerd in 20 milliliter CRPMI. Voeg met een 200 microliter multichannelpipet 125 microliter inoculum vanuit een reservoir van 25 milliliter toe aan elke well van de rijen A tot G van de bodemplaat.

Vul elk well van rij H met 125 µL steriel CRPMI-medium als steriliteitscontrole. Pak het peg-deksel en houd dit boven de bodem van de plaat met de pennen naar beneden gericht. Lijn de individuele pennen voorzichtig uit met de betreffende wells.

Vermijd fysiek contact tussen de plaat en de pinnen. Zodra deze zijn uitgelijnd, wordt het deksel voorzichtig naar beneden bewogen. Afdicht het deksel op de plaat met paraffinefilm om verdamping te voorkomen en plaats het in een afsluitbare plastic zak, die stevig wordt dichtgesloten.

Houd het luchtvolume in de zak zo laag mogelijk om verdamping te minimaliseren. Incubeer de plaat zonder schudden gedurende 48 uur bij 37 °C in een incubator met 5% Carbon Dioxide. Neem op de dag van de biofilm-challenge een nieuwe 96-well plaat en voeg 100 µL CRPMI, geëquilibreerd naar kamertemperatuur, toe aan elke well van rij B tot H. Verdun tot vier testverbindingen afzonderlijk in 1,0 mL CRPMI tot 2x de gewenste eindconcentratie.

Voeg 200 µL van verbinding 1 toe aan putjes A1-A3. Voeg 200 µL van verbinding 2 toe aan putjes A4-A6. Voeg 200 µL van verbinding 3 toe aan putjes A7-A9. En voeg 200 µL van verbinding 4 toe aan putjes A10-A12. Verdun de testverbindingen serieel met behulp van een multichannel-pipet.

Begin met het overbrengen van 100 µL van rij A naar rij B en meng dit. Zet dit proces voort door telkens 100 µL van putje naar putje over te brengen. Meng na elke overdracht en stop bij rij F. Verwijder na het mengen 100 µL uit rij F naar een afvalcontainer.

Breng geen vloeistof over naar rijen G en H. Voeg tenslotte met een meerkanaals pipet 100 microliters CRPMI toe aan elke put van de plaat, om het eindvolume op 200 microliters te brengen. Voeg 200 microliters fosfaatgebufferde zoutoplossing toe aan een nieuwe, steriele 96-wellsplaat met putafmetingen die identiek zijn aan die van de biofilm-initiatieplaat. Verwijder vervolgens de plastic zak en de paraffinefilm van de geïncubeerde biofilm-initiatieplaat.

Til het deksel recht omhoog en voorkom contact tussen de pinnen en de bodem van de plaat, omdat dit de biofilm kan beschadigen. Bewaar het onderste gedeelte voor de daaropvolgende OD600-analyse. Spoel planktonische cellen weg door het pindeksel op de plaat met PBS te plaatsen.

Dompel de pinnen vijf seconden onder. Til ze uit de PBS en dompel ze nogmaals onder, waarbij u er alert op let dat de pinnen niet tegen de wanden van het well raakken. Plaats het gespoelde pindeksel in de challenge-plaat.

Vermijd onnodig contact tussen de pinnen en de bodemplaat, aangezien dit de biofilm beschadigt, wat leidt tot inconsistente resultaten. Seal de plaat met paraffinefolie en plaats deze, zoals eerder beschreven, in een afsluitbare plastic zak. Incubeer de plaat, zonder schudden, gedurende 24 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2.

Neem de bodem van de plaat voor biofilminitiatie en resuspendeer de bacteriën in elke put met een multichannelpipet. Meet de OD600 met een geschikte microplaatlezer om te bevestigen dat er groei heeft plaatsgevonden in alle putten, behalve in de steriliteitscontroles in rij H. Gebruik een plaatlezer die is uitgerust met een incubatiekamer en in staat is om kinetische fluorescentiemetingen uit te voeren voor het detecteren van de resazurine-omzetting. Stel een kinetische fluorescentiemeting van 24 uur in met een excitatie van 530 nanometer en een emissie van 590 nanometer.

Stel de temperatuur van de kamer in op 37 °C en laat de plaat elke 20 minuten uitlezen. Stel de platenlezer in om vanaf de onderkant van de plaat te meten, conform de instructies van de fabrikant. Bereid het wassen van de plaat voor door met een multichannelpipet 200 µL PBS aan elke well van een steriele 96-wellplaat toe te voegen.

Bereid vervolgens biofilmherstelmedium voor door 400 µL van een resazurin-stokoplossing van 0,8 mg/mL toe te voegen aan 20 mL CRPMI-medium, tot een eindconcentratie van 16 µg/mL resazurin. Voeg daarna met een multichannel-pipet 150 µL biofilmherstelmedium toe aan elke put van een nieuwe 96-wells plaat. Verplaats de challenge-plaat van de incubator naar een veiligheidskast voor biologische agentia en verwijder voorzichtig de plastic zak en de afdichtingsfolie.

Verwijder het peg-deksel van de challenge-plaat en spoel de planktonische cellen af met PBS zoals voorheen, waarbij de bodem van de challenge-plaat bewaard wordt voor de daaropvolgende OD600-analyse. Plaats na het spoelen het peg-deksel in de plaatbodem die het medium voor biofilmherstel bevat. Wikkel de zijkant van de plaat in paraffinefolie, waarbij u er zorg voor draagt dat de bodem van de perimeterputjes niet wordt geblokkeerd.

Plaats de plaat direct na het afdekken in de platenlezer en start een kinetische meting over een periode van 24 uur door het eerder gemaakte resazurine-kinetische protocol te activeren. Om de groei van planktonische cellen te kwantificeren die tijdens de challenge wel of niet kunnen optreden, wordt de OD600 van de gehele bodem van de challenge-plaat gemeten met een microplatenlezer. Hier wordt een voorbeeldindeling van een challenge-plaat getoond, waarbij twee volledige verdunningen worden gebruikt om de concentraties van de verbinding te titreren.

Gegroeide biofilms werden behandeld met neocuproïne of het kopercomplex daarvan. OD600-metingen van de bodem van de challenge-plaat na 24 uur onthulden dat het neocuproïne-kopercomplex, maar niet neocuproïne alleen, het loslaten en de daaropvolgende groei van levensvatbare cellen uit behandelde biofilms voorkwam bij concentraties van 1,25 micromolair of hoger. De overeenkomstige biofilms werden vervolgens getest met de resazurine-assay.

Visuele inspectie na 24 uur maakt een snel ja-nee antwoord mogelijk wanneer meerdere platen parallel worden uitgevoerd. Resazurine kleurt roze in wells met levensvatbare biofilms, maar blijft blauw wanneer de biofilm is geëlimineerd. Een kinetische meting van de resazurine-conversie kan concentratie-afhankelijke effecten op de levensvatbaarheid van de biofilm onthullen, zoals hier wordt aangetoond met gentamicin.

De concentratieafhankelijke vertraging in het begin van de kleurstofconversie is indicatief voor een afname van de levensvatbaarheid van de biofilm. Het is bij het uitvoeren van deze procedure belangrijk om ervoor te zorgen dat de pinnen niet tegen de wand van de wells stoten.