Name: Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA In Situ hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Leer miRNA in situ hybridisatie voor borstkankeronderzoek met patiëntweefselmonsters. Deze methode detecteert de lokalisatie van micro RNA's en helpt bij het begrijpen van hun rol in tumoronderdrukking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidie (5R01 CA178386-03) en de USC ASPIRE-1-subsidie aan HC. We willen Vrushab Gowda bedanken voor zijn assistentie met het manuscript.

Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Chonnam National University Hwasun Hospital en Universiteit van South Carolina. TMA monsters bestaande uit borstkanker en afgestemd aangrenzend normaal borstweefsel werden verstrekt door de Biobank van Chonnam National University Hwasun Hospital, een lid van de Korea Biobank Network. 1. Oplossing Voorbereiding <ol><li> Bereid 1 liter DNase en RNase vrij water. Maak alle chemische oplossingen met behulp van diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water. Behandel 1 liter water met 500 pi DEPC en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur geroerd. Autoclaaf het water naar DEPC inactiveren. Let op: Adem geen DEPC omdat het bekend carcinogeen. </li><li> Bereid 1x PBS van 10x PBS met behulp van DEPC behandeld water. </li><li> Bereid 20x SSC (ontbinden 175,3 g NaCl en 88,2 g natriumcitraat in 800 ml water, breng de pH op 7,0 met een paar daling van 14 N oplossing van HCl en het volume aan te passen tot 1 L met water), 4% paraformaldehyde, 95% ethanol, 80% ethanol met behulp DEPC behandeld water. </li><li> Voeg 8 ml triethanolamine en 1,05 ml HCl in 590 ml DEPC-behandeld water en voeg 1,5 ml azijnzuuranhydride voor acetylering. </li><li> Bereid 50 pg / pl proteinase K in buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 in DEPC behandeld water). </li><li> Bereid hybridisatiebuffer bestaande uit 500 pl formamide, 250 pl 20x SSC, 100 gl 50x Denhardt&#39;s oplossing, 12,5 ui t-RNA, 2,5 ul haringsperma DNA, 30 ui RVC, 0,02 g blokkerende reagens en 50 pi DEPC water. Vers bereid. </li></ol> 2. Breast Tissue Secties <ol><li> Snijd 5 urn in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde secties met microtoom en de sectie op dia 14 in rekening te brengen. Opmerking: De borstweefsel hier gebruikt is eerder bereid uit de Korea Biobank Network. </li></ol> 3. Tissue Voorbereiding <ol><li> Verwijderen paraffine weerm het weefsel door onderdompeling glijdt in Coplin jar 2x in verse xyleen gedurende 10 min elk en hydrateren de weefselsectie van 5 min incubaties afnemende concentraties ethanol (100%, 95% en 80%) in DDH 2 O. Voer deze stap in een zuurkast. </li><li> Dompel het weefsel in DEPC behandeld water gedurende 5 minuten. Op dit moment maken de grenzen rond weefselsectie met hydrofobe barrière pen. </li><li> Bevestigen van het weefsel met 4% PFA gedurende 15 minuten gevolgd door een wassing met PBS. </li><li> Dompel het weefsel in 0,3% Triton X-100 / PBS gedurende 10 minuten gevolgd door een wassing met PBS. </li><li> Incubeer monster met 50 ug / ul proteïnase K-oplossing gedurende 15 minuten bij 37 ° C. incubeer weefselcoupes vervolgens met triethanolamine en azijnzuuranhydride gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een wassing met PBS. Nr PBS wassing nodig tussen Proteinase K behandeling en triëthanolamine / azijnzuuranhydride behandeling. </li></ol> 4. hybridisatie <ol><li> Was het weefsel grondig en Incuverminder de weefselsectie hybridisatie buffer gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur. Meestal 120 pl hybridisatie buffer is genoeg om de weefselsectie dekken. </li><li> Verdun 5&#39;-DIG gemerkte probe LNA eindconcentratie van 3:00 in 120 ul hybridisatieoplossing. De voorraad concentratie gewoonlijk 40 ng / ul, 3 ul voeg leverbaar tot 120 gl hybridisatiebuffer en incuberen mengsel bij 95 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Incubate weefselsectie met probe &#39;s nachts bij 54 ° C (Tm) in een vochtige kamer. Meestal 120 pl is genoeg om een ​​gedeelte bevatten. Maak luchtvochtigheid met behulp van twee natte papieren handdoeken. De ideale grootte van de kamer is 10 inch bij 8 inch. </li><li> Opmerking: Tm kan verschillend zijn voor verschillende miRNA zijn. 54 ° C is vermelding voor miR-489. </li></ol> 5. wassing <ol><li> Was het weefsel met 5x SSC gedurende 7 min (na de hybridisatie stap, RNase vrije omstandigheden niet meer nodig). </li><li> Was het weefsel sectie with 1x SSC gedurende 7 min tweemaal bij 57 ° C. </li><li> Was de weefselsectie met 0,2X SSC gedurende 7 minuten bij 57 ° C. </li><li> Was de weefselsectie met 0,2X SSC gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer weefselsectie in PBS gedurende 10 min. </li></ol> 6. Blocking <ol><li> Incubeer de weefselsectie met blokkerende buffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in een vochtige kamer (Om blokkeerbuffer voeg 2 ml FBS, 10 ul Tween-20 en 3 gl BSA in PBS 18 m. Store blokkerende buffer bij 4 ° C). </li></ol> 7. Primary Antibody Incubation en Development <ol><li> Verdun 1: 300 anti-DIG-AP antilichamen in blokkeerbuffer en incubeer de weefselsectie met antilichaam bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was de secties met wasbuffer 3 keer, gedurende 5 minuten elk (buffer geleverd door development kit). </li><li> Ontwikkelen van het weefsel gedeelte met een commerciële kit voor alkalische fosfatase dat CY-3 tl-licht produceert. </li> &lt;li&gt; Was de sectie met wasbuffer gedurende 5 minuten. Vlek sectie met 100 ul van 2,5 ng / ul Hoechst kleurstof gedurende 5 minuten, gevolgd door 5 minuten wassen met wasbuffer. </li><li> Monteer de sectie met montage buffer volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik 15 ul per weefsel sectie en veeg overmatige montage oplossing met een tissue af te vegen. Sluit de dia met duidelijke nagellak om lekkage te voorkomen. </li><li> Houd u aan de sectie tl-microscoop met met 10x lens, zodat totale vergroting is 100X. </li></ol>

<ol><li>Shah, N. R., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+pathogenesis+of+breast+cancer%3A+Implications+in+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment.</a> World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-185+suppresses+tumor+proliferation+by+directly+targeting+E2F6+and+DNMT1+and+indirectly+upregulating+BRCA1+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).</li>
<li>Ye, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-375+induces+trastuzumab+resistance+in+HER2-positive+breast+cancer+by+targeting+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R.</a> BMC Cancer. 14, 134(2014).</li>
<li>Oneyama, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+downregulation+of+mTOR%2FFGFR3+controls+tumor+growth+induced+by+Src-related+oncogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways.</a> Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).</li>
<li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+breast+cancer%3A+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).</li>
<li>Quesne, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+prognostic+associations+of+miR-205+and+let-7b+in+breast+cancer+revealed+by+in+situ+hybridization+analysis+of+micro-RNA+expression+in+arrays+of+archival+tumour+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue.</a> J Pathol. 227, 306-314 (2012).</li>
<li>Fernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-340+inhibits+tumor+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+by+targeting+multiple+negative+regulators+of+p27+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).</li>
<li>Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-224+upregulation+and+AKT+activation+synergistically+predict+poor+prognosis+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-146+up-regulation+predicts+the+prognosis+of+non-small+cell+lung+cancer+by+miRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization.</a> Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+in+situ+hybridization+for+formalin+fixed+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues.</a> J Vis Exp. , e50785(2013).</li>
<li>Ucar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-212+and+miR-132+are+required+for+epithelial+stromal+interactions+necessary+for+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development.</a> Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).</li>
<li>Nuovo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+microRNAs+in+paraffin+embedded%2C+formalin+fixed+tissues+and+the+co-localization+of+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets.</a> Methods. 52, 307-315 (2010).</li>
<li>Kierzek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+locked+nucleic+acid+residues+on+the+thermodynamic+properties+of+2%27-O-methyl+RNA%2FRNA+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+miR-182+and+miR-503+cooperatively+targets+FBXW7%2C+contributing+to+the+malignant+transformation+of+colon+adenoma+to+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma.</a> J Pathol. 234, 488-501 (2014).</li>
</ol>

Er is niets te onthullen.

Het doel van deze studie was het niveau van miRNA expressie in borstkanker weefsels met behulp miRNA in situ hybridisatie bepalen. Er zij op gewezen dat in dit experiment alle omstandigheden werden geoptimaliseerd voor borstkankerweefsel. Verdere optimalisatie kan het nodig zijn andere weefseltypes. Alle oplossingen moeten worden gemaakt met DEPC water en alle containers worden gebruikt moet worden gespoeld met DEPC behandeld water en vervolgens geautoclaveerd. Zelfs kleine RNase vervuiling kunnen interfereren ...

Borstkanker is de meest voorkomende kwaadaardige aandoeningen die de vrouwelijke bevolking over de hele wereld. Meer dan 1,3 miljoen gevallen van borstkanker worden elk jaar wereldwijd 1,2 gemeld. Hoewel tumorcellen worden traditioneel als biologisch homogeen en hoog proliferatieve beschouwd, is het duidelijk geworden dat borstkanker genetisch en klinisch heterogeen. Resistentie tegen heersende antikankergeneesmiddelen is een kenmerk van gevorderde borstkanker, wat leidt tot de sterfte in de meerderheid van patiënten via de facilitering van kankerprogressie en afstand metastase 3. MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse kleine RNA- moleculen ongeveer 22 nucleotiden lang die genexpressie reguleren door mRNA translatie te blokkeren of bemiddelen mRNA afbraak 4. Meer dan 2000 verschillende miRNAs dusver geïdentificeerd in de mens, die verband houden met menselijke ziekten 5. Een groeiend scala aan studies have aangetoond dat miRNAs kan functioneren als oncogenen en tumor suppressors en worden vaak verstoord bij tumoren 6. miRNAs aanzienlijke invloed hebben alle primaire tumorigenese door regeling van de belangrijkste regulatoren van celcyclusprogressie, senescentie, apoptose en autofagie, samen met die van tumorcel beweeglijkheid, invasie en metastase 7. Afwijkende miRNA expressie is ook geassocieerd met klinische implicaties zoals stadium, differentiatie, prognose en respons adjuvante 8. Vooral een groter miR-146 expressie is gecorreleerd met slechte prognose bij longkankerpatiënten 9. Een andere studie heeft aangetoond dat verloren expressie van miRNA-let7b samenhangt met kwaadaardige fenotypes en derhalve slechte overleving 6. Inzicht in de typen cellen en structuren die miRNAs expressie is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de mechanismen waarmee veranderingen in miRNA expressie beïnvloeden cel enweefsel fenotypen 10. Bepaalde miRNAs gevonden te worden uitgescheiden in stromale cellen worden in genomen door epitheelcellen en specifiek inwerken op hun doelen. In dezelfde geest, miR-212 en miR-132 worden uitgescheiden door stroma en reguleren van de epitheliale-stromale interacties die nodig is voor ductaal uitgroei tijdens de ontwikkeling van de borstklier 11. De algemene doelstelling van dit document is een gedetailleerd protocol om miRNA expressie in borstkanker weefsels op te sporen door middel van miRNA in situ hybridisatie uit te leggen. We hebben alle omstandigheden geoptimaliseerd om de niveaus van miRNA-489 expressie in borstkanker patiëntenmonsters testen. Hiervoor gebruikten we een DIG gemerkte vergrendeld nucleïnezuur (LNA) probe in ons experiment. Sommige van de nucleotiden had een LNA modificatie, dat wil zeggen een methyleen brug tussen het 2 &#39;zuurstofatoom en het 4&#39; koolstofatoom van het ribose ruggengraat die de nucleotide zodat het blijft &quot;vergrendeld&quot; na hybridisatie vastgesteld. Daardoor is het veel moeilijkerhet gehybridiseerde complex te denatureren 12,13.

<table><tbody><tr><td>ELF-97</td><td>Life technology&nbsp;</td><td>E6604</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhard't&nbsp;</td><td>Life technology&nbsp;</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>t-RNA</td><td>Roche</td><td>109541</td><td>Reconstitueer in DEPC water</td></tr><tr><td>Herring Sperm DNA</td><td>Promega&nbsp;</td><td>D1815</td><td></td></tr><tr><td>Roche Blocking&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>RVC</td><td>Fisher</td><td>50-812-650</td><td>Voor gebruik centrifugeer het eerst bij 16,1 RCF en neem de supernatant&nbsp;</td></tr><tr><td>miR-489 probe&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>38599-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free BSA</td><td>Roche&nbsp;</td><td>711454</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody-anti DIG</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1609478</td><td></td></tr></tbody></table>

clinicopathologische analyse van mirna expressie in breast cancer weefsels met behulp van mirna<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor miRNA-detectie in borstkankerweefsel met behulp van in situ hybridisatie met een digoxigenine-gelabelde LNA (Locked Nucleic Acid) sonde. De sonde werd herkend door anti-DIG alkalische fosfatase-antilichamen en later ontwikkeld met alkalische fosfatase-substraat dat fluorescente signalen produceert. Hier gebruikten we de miRNA in situ hybridisatie (MISH) techniek om de expressie van miR-489 te analyseren in weefsels van borstkankerpatiënten. Deze techniek kan de lokalisatie van de geïnteresseerde miRNA in individuele weefselmonsters detecteren. Deze techniek kan worden gebruikt om de expressie van de gewenste miRNA in tumorweefsel te vergelijken met die in aangrenzend normaal weefsel en om de specifieke structuren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor het tot expressie brengen van deze miRNA. Deze techniek kan zeer nuttig zijn om bepaalde klinische vragen te beantwoorden, zoals de rol van specifieke miRNA in de ontwikkeling van kanker. Onze resultaten geven aan dat mammaire epitheliale cellen significant hogere niveaus van miR-489 tot expressie brengen dan aangrenzende tumorcellen.

Menselijke borstkanker weefsel werd gebruikt om miRNA-489 expressie te bepalen. Borstklier duct en epitheelcellen bleken significant hoger miRNA-489 levels dan aangrenzend tumorweefsel bij twee patiënten (Figuur 1A en 1B) uit te drukken. Hieruit blijkt duidelijk dat miRNA-489 expressie verloren is gegaan in tumorweefsel, wat suggereert tumor onderdrukkende activiteit van miRNA-489. Om verder te bevestigen deze resultaten, tumorweefsel en aangrenzend norm...

Hier presenteren we een protocol om miRNA-expressie in monsters van borstkankerpatiënten te detecteren met behulp van miRNA in situ hybridisatie.

Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; hybridisatie

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Het algemene doel van deze Micro RNA In Situ Hybridisatie is om de lokalisatie van het Micro RNA van belang aan te tonen in borstkankerweefsel. Zo kan de resulterende informatie antwoord geven op een kernvraag binnen het vakgebied van borstkanker, zoals bijvoorbeeld of het betreffende micro RNA onduidelijk is of fungeert als tumorsuppressor.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het cellulaire kernvorming van belang kan detecteren in borstkankerweefsel. Begin de weefselpreparatie door paraffine te verwijderen uit vooraf geprepareerde coupes van borstweefsel. Dompel de objectglaasjes twee keer gedurende tien minuten in een Coplin-pot met vers xyleen.Rehydrateer de weefselsectie door incubaties in afnemende concentraties ethanol in dubbel gedestilleerd water gedurende telkens vijf minuten. Dompel het weefsel vervolgens vijf minuten onder in water behandeld met diethylpyrocarbonaat of DEPC. Terwijl het weefsel is ondergedompeld, worden er met een hydrofobe barrièrepen grenzen rond de weefselsectie getrokken.Fixeer na de DEPC-onderdompeling het weefsel gedurende 15 minuten in 4% PFA. Volg de fixatie met een wasstap met PBS. Dompel het weefsel vervolgens tien minuten onder in 0,3% Triton X-100 in PBS.Incubeer het monster met 50 µg/µL Proteinase K-oplossing gedurende 15 minuten bij 37 °C. Incubeer vervolgens de weefselcoupes met triethanolamine en azijnzuumhybride gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Volg dit met een wasstap met PBS.Was het weefsel grondig. Incubeer de weefselcoupe vervolgens gedurende twee uur bij kamertemperatuur met 120 µL hybridisatiebuffer. Verdun daarna de 5'-DIG-gelabelde NLA-probe tot een uiteindelijke concentratie van 3 pM in 120 µL hybridisatieoplossing.Voeg vervolgens 3 µL van de 40 ng/µL voorraadoplossing toe aan de 120 µL hybridisatiebuffer. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten bij 95 °C. Plaats de weefselsectie in een bak van tien bij acht inch en bedek het weefsel met 120 µL van de probe, zodat het volledig is bedekt.Maak twee papieren handdoeken nat en bedek de container om een bevochtigingskamer te creëren. Incubeer de weefselcoupe gedurende de nacht bij 54 °C. Was het weefsel na hybridisatie zeven minuten lang met vijf X saline sodium citrate buffer of SSC bij 57 °C.Was daarna de weefselsnede twee keer met 1 X SSC. Was de weefselsnede vervolgens met 0,2 X SSC. Was de weefselsnede daarna zeven minuten lang met 0,2 X SSC bij kamertemperatuur.Incubeer de weefselcoupe tien minuten in PBS. Incubeer de weefselcoupe één uur bij kamertemperatuur in een bevochtigingskamer met blokkeringsbuffer. Verdun het anti-DIG AP-antilichaam 1:300 in blokkeringsbuffer.Incubeer de weefselcoupe met het antilichaam gedurende één nacht bij 4 graden Celsius. Was de coupes de volgende dag drie keer vijf minuten lang met washbuffer. Volg de instructies van de commerciële ELF 97-kit om de weefselcoupe te ontwikkelen met alkalische fosfatase dat fluorescent licht van grootte drie produceert.Was daarna de sectie gedurende vijf minuten met wasbuffer. Kleur de sectie gedurende vijf minuten met 100 µL Hoechst-kleurstof in een concentratie van 2,5 ng/µL. Volg de kleuring met een wasbeurt van vijf minuten met wasbuffer.Gebruik 15 µL monteerbuffer per weefselcoupe. Verwijder overtollige monteersolutie met een weefseldoekje. Seal vervolgens het objectglas met transparante nagellak om lekken te voorkomen.Observe tot slot de sectie met een fluorescentiemicroscoop bij een totale vergroting van 100 X. Menselijk borstkankerweefsel van twee patiënten werd gebruikt om de expressie van Micro RNA 489 te bepalen. Er werd vastgesteld dat kliergang- en epitheelcellen van de mamma significant hogere Micro RNA 489-niveaus vertoonden dan het aangrenzende tumorweefsel. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van Micro RNA-in situ hybridisatie met behulp van monsters van borstkankerpatiënten.

clinicopathological-analysis-mirna-expression-breast-cancer-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel beschrijft een in situ hybridisatie protocol geoptimaliseerd voor colorimetrische detectie van microRNA expressie in formaline gefixeerde niersecties.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie voor formaline gefixeerde nierweefsel

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Hier beschrijven we een vereenvoudigd protocol voor microRNA (miRNA) expressieanalyses in gearchiveerde, formaline-gefixeerde, paraffine-ingeslagen (FFPE) of vers bevroren prostaatkanker (PCa) klinisch weefsel met behulp van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH).

miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues

Nucleïnezuur afbraak in archivering weefsel, tumor heterogeniteit, en een gebrek aan vers bevroren weefsel monsters kan negatieve invloed hebben op kanker diagnostische diensten in pathologie laboratoria wereldwijd. Dit manuscript wordt beschreven voor het optimaliseren van een panel van biomarkers met behulp van een multiplex magnetische kraal assay te classificeren van kanker van de borst.

Optimalisatie van een Multiplex RNA gebaseerde expressie-Assay met behulp van borst kanker archiefmateriaal

Paraffine-ingebedde specimens formaline-vaste vormen een waardevolle bron van moleculaire biomarkers voor ziekten bij de mens. Hier presenteren we een laboratorium gebaseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol, in eerste instantie ontworpen met vers bevroren RNA, en geoptimaliseerd voor de analyse van gearchiveerde microRNAs uit weefsels tot 35 jaar opgeslagen.

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

We presenteren een protocol voor structurele en analyse van de samenstelling van natuurlijke orale biofilm van orthodontische apparatuur...

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

In de pathogenese van bot metastase, angiogenese is een cruciaal proces en vormt derhalve een doel voor beeldvorming en therapie. Hier presenteren we een rat model van site-specifieke borstkanker botmetastase en beschrijven strategieën om niet-invasieve beeld...

Multi-modale beeldvorming van angiogenese in een Naakt ratmodel van borstkanker botmetastase Met behulp van Magnetic Resonance Imaging, Volumetrische computertomografie en Echografie

Leer miRNA in situ hybridisatie voor borstkankeronderzoek met patiëntweefselmonsters. Deze methode detecteert de lokalisatie van micro RNA's en helpt bij het begrijpen van hun rol in tumoronderdrukking.

Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA

Meer video's verkennen