TAPE: een biologisch afbreekbaar Hemostatische Glue Geïnspireerd door een alomtegenwoordige Compound in Installaties voor chirurgische toepassing

Het algemene doel van dit protocol is het ontwikkelen van een biologisch afbreekbare hemostatische lijm voor chirurgische toepassingen, geïnspireerd door een alomtegenwoordige verbinding in planten. Deze methode kan ons helpen het waterbestendige adhesiemechanisme van biometrie te begrijpen, zoals weefsellijmen en afdichtingsmiddelen in biomedische toepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het proces voor het maken van TAPE uiterst eenvoudig, schaalbaar en milieuvriendelijk is.

Bereid eerst een tanninezuuroplossing voor in een glazen vial van vier milliliter op een magneetroerer. Voeg één milliliter gedestilleerd water en één gram tanninezuur toe onder roering bij 200 rpm. Na een uur zal het tanninezuur volledig zijn opgelost in een bruine oplossing.

Voeg vervolgens één milliliter gedestilleerd water toe aan één gram PEG-poeder en vortex deze tot een wit mengsel. Houd het mengsel 10 minuten lang op 60 °C. Het moet volledig helder worden.

Laat het daarna weer op kamertemperatuur komen. Meng vervolgens in een microcentrifugebuis 329 µL PEG-oplossing met 671 µL van de tanninezuuroplossing. Neem de aliquoten langzaam op, aangezien beide oplossingen vrij viskeus zijn.

Meng de oplossingen voorzichtig met een smalle spatel tot een honingachtig mengsel. Centrifugeer het mengsel gedurende drie minuten bij 12 300 g in een rotor met vaste hoek. Pipetteer vervolgens voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatant af, waarbij de volledig gevormde TAPE in de buis achterblijft.

Bewaar de TAPE gedurende enkele weken bij vier tot acht graden Celsius. Om de hechtingsterkte van de TAPE te meten, bereidt u een testweefsel voor uit een huidpunchbiopt van een varken. Verwijder al het vet en bereid vervolgens twee testweefsels met een diameter van zes millimeter voor.

Breng commerciële cyanoacrylaatlijm aan op de buitenkant van elk weefsel en bevestig de staven of een soortgelijk object dat door de testmachine vastgegrepen moet worden. Breng vervolgens een druppel TAPE aan op één zijde van het weefsel en verspreid dit gelijkmatig tussen de binnenzijden van de twee weefsels zodat ze aan elkaar vastzitten. Bevestig en ontkoppel de weefsels daarna enkele keren om een homogeen mengsel te creëren dat de interface volledig bedekt.

Bevestig vervolgens de staafjes aan het testapparaat. Begin met het uitoefenen van een kracht van 20 Newtons gedurende één minuut. Laat de staafjes daarna uit elkaar trekken met een snelheid van één millimeter per minuut totdat de weefsels volledig zijn losgekomen.

De gegevens worden weergegeven als een kracht-afstandscurve. Om de adhesiekracht in aanwezigheid van water te testen, voegt u 20 µL water toe aan het losgekoppelde gebied tussen de twee weefsels en bevestigt u onmiddellijk de natte oppervlakken met de TAPE. Herhaal de test zoals voorheen, zonder verdere wijzigingen.

Snijd eerst een dop met een diameter van acht millimeter af van een microcentrifugebuisje en weeg deze. Vul vervolgens de dop met 150 milligram TAPE en bepaal het totale gewicht. Vul de dop niet voorbij de rand, aangezien deze als barrière moet dienen.

Voeg 50 milliliters PBS-buffer toe aan de 75 square centimeter kweekfles. Plaats de geladen dop in de fles en dompel de dop onder. Incubeer de fles bij 37 degrees Celsius op een orbitale schudder ingesteld op 50 rpm, maar niet hoger.

Verwijder op het gewenste tijdstip de dop en droog deze met stikstofgas. Weeg vervolgens de dop. Vul daarna de kolf opnieuw met PBS en zet de incubatie voort onder zacht schudden tot het volgende tijdstip.

Bereken op basis van de metingen het relatieve resterende gewicht. Begin met een volledig geanestheseerde mannelijke muis van zes weken oud, getest met een knijptest in de teen. Zorg ervoor dat er vóór aanvang van de operatie veterinaire zalf op de ogen wordt aangebracht.

Leg nu de lever vrij met een midline abdominale incisie en plaats filterpapier met een bekende massa onder de lever om deze te immobiliseren. Prik vervolgens met een 18-gauge naald in de lever om een bloeding op te wekken. Terwijl het bloed met steriel gaas wordt geabsorbeerd, brengt u onmiddellijk 100 µL TAPE aan op de plaats van de incisie.

Gebruik voor positieve controles cyanoacrylaat of een soortgelijke lijm en doe niets voor negatieve controles. Verdere hechtingen zijn niet nodig. Verzamel na het aanbrengen van het adhesief het bloed van de beschadigde plek op het papier.

Vervang het papier elke 30 seconden gedurende twee minuten. Meet de massa van het geabsorbeerde bloed op de vier filterpapieren. Het dier dient te worden geëuthanaseerd.

Verschillende ratio's van TA en PEG werden getest en de ideale combinatie om TAPE te maken was een volumeverhouding van twee-op-één. Deze TAPE werd aangebracht tussen twee varkenshuiden met een diameter van zes millimeter en vervolgens getest op een trekbank zoals beschreven. De kracht die nodig was om de twee varkenshuiden te scheiden, werd aanvankelijk gemeten op 200 kilopascals en steeg naar 250 kilopascals bij herhaalde cycli.

Wanneer de huidmonsters na elke cyclus van hechting/loslating werden bevochtigd, daalde de treksterkte van de binding aanvankelijk naar 90 kilopascals en nam deze na 20 cycli af tot 50 kilopascals. De duurzaamheid van TAPE werd getest in kleine volumes, verdund in PBS, met schudden onder fysiologische lichtomstandigheden. De massa bleef gedurende 21 dagen behouden bij gebruik van de formulering met een twee-op-één verhouding.

Een formulering van TAPE met een één-op-één ratio bleef onder deze omstandigheden slechts 13 dagen stabiel. Vervolgens werd een in vivo hemostatische test uitgevoerd. De met TAPE afgesloten lever werd vergeleken met commerciële fibrinelijm.

De met TAPE afgesloten lever bloedde aanzienlijk minder dan de lever die met fibrinelijm was afgesloten. Zodra men de techniek beheerst, kan de bereiding van TAPE in vijf minuten worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de geoptimaliseerde verhouding tussen tanninezuur en PEG te handhaven, aangezien dit de adhesiekracht van TAPE drastisch kan beïnvloeden.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van biometrie de weg vrijgemaakt om natuurgeïnspireerde manieren te verkennen voor het oplossen van huidige problemen bij de ontwikkeling van waterbestendige adhesieve materialen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in hemostatische materialen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals weefselsealants voor wondgenezing en implanteerbare patches voor medicijnafgifte.