Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Het algemene doel van het model voor experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is het faciliteren van de studie naar de potentiële moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan de ontwikkeling van multiple sclerose. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van multiple sclerose, zoals: in welk stadium van de ziekte infiltreren immuuncellen het centrale zenuwstelsel? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het EAE-model veel van de belangrijkste kenmerken van multiple sclerose nabootst, zoals demyelinisatie en immuuncelinfiltratie.

De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van multiple sclerose, aangezien geneesmiddelen die met deze methode zijn getest, al zijn goedgekeurd voor deze ziekte. In het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode problemen kunnen ondervinden, omdat er strikte voorwaarden in overweging moeten worden genomen bij het induceren van EAE. Muizen moeten in een stressvrije omgeving worden gehouden en een pertussistoxine moet vers worden bereid.

Een officiële demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het isoleren van de lymfeklieren en het extraheren van het ruggenmerg moeilijk te leren zijn op basis van alleen een beschrijving. Begin met het subcutaan injecteren van 10 tot 13 weken oude vrouwelijke muizen met 200 micrograms myelin oligodendrocyte glycoprotein, geëmulgeerd in 200 microliters complete Freund's adjuvant, bevattend 400 micrograms mycobacterium tuberculosis.

Injecteer de muizen onmiddellijk en 24 uur later intraperitoneaal met 0,2 micrograms pertussistoxine in 200 microliters PBS. Het is essentieel dat de muizen zowel aan de hantering als aan de experimentele omgeving zijn gewend voordat de EAE-inductie plaatsvindt, om stress te voorkomen die de ontwikkeling van klinische symptomen kan belemmeren. Onderzoek de muizen een week na de injectie dagelijks op klinische symptomen, zoals beschreven in de tabel.

Om de door EAE geïnduceerde immuuncelpopulatie in de lymfeklieren te evalueren, bevochtigt u op het juiste tijdstip na inductie het incisiegebied met 80% isopropanol en verwijdert u voorzichtig de huid over de heupstreek. Verwijder met een pincet voorzichtig de inguinale lymfeklier uit het vetweefsel. Weeg vervolgens de klier en plaats het monster in PBS op ijs.

Om de cellen van het ruggenmerg te analyseren, bevochtig meticulously de rug van het dier met isopropanol en gebruik een scalpel om een longitudinale incisie langs de ruggengraat te maken. Verwijder vervolgens de huid en dissecteer het lumbale deel van de wervelkolom vrij, dat de achterpoten innerveert. Spoel de wervelkolom door met een met PBS gevulde spuit om het ruggenmerg te extraheren.

Nadat ongeveer 1/3 van het lumbale ruggenmerg is verwijderd, weegt u het spinale fragment en bewaart u het weefsel in PBS op ijs. Om de immuuncelpopulatie van de milt te analyseren, opent u het weefsel om toegang te krijgen tot het onderste deel van de buikholte. Verwijder vervolgens de milt en snijd ongeveer 1/8 van het weefsel af.

Weeg het miltfragment en bewaar het weefsel in PBS op ijs. Gebruik vervolgens de zuiger van een spuit van 2 mL om de rest van het weefsel door een zeef met een maaswijdte van 70 micron in een buis van 50 milliliter te persen, gevolgd door een spoeling van de zeef met 5 milliliter PBS. Centrifugeer de gefilterde cellen.

Resuspendeer de pellet in 500 µL cellysebuffer en breng de cellen over naar een buisje van 1,5 mL. Na 10 minuten bij kamertemperatuur worden de cellen twee keer gewassen in 500 µL PBS. Na de tweede wasbeurt wordt de pellet geresuspendeerd in 100 µL 0,2% BSA in PBS, waarna twee µL Fc-receptor blokkeringsbuffer aan de cellen wordt toegevoegd.

Na 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur worden de cellen gelabeld met 13 µL antilichaamcocktail gedurende nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen aan het einde van de incubatie minstens twee keer in 500 µL PBS en resuspendeer het uiteindelijke pellet in 500 µL verse PBS. Draag de cellen vervolgens over naar een flowcytometrie-buis op ijs.

Ten slotte, om de monsters via flowcytometrie te analyseren, voegt u direct voor de flowcytometrie-meting 30 microliters flowcytometrische absolute telstandaard toe aan de cellen om de absolute celaantallen te bepalen. Analyseer vervolgens de monsters op de flowcytometer. Zoals deze figuur illustreert, wordt tijdens de acute fase van EAE-inductie een voorbijgaande toename van alle immuuncelpopulaties binnen de lymfeklieren waargenomen.

In de milt vertonen echter alleen macrofagen, B-cellen, T-cellen en neutrofielen een verhoogde infiltratie. In het bloed vertonen alle immuuncelpopulaties een tijdelijke toename in hun perifere circulatie tijdens de preklinische fase, wat overeenkomt met een soortgelijke ziekteafhankelijke toename in het lumbale ruggenmerg tijdens de acute fase van de ziekte, met uitzondering van de monocytenpopulatie, die vermoedelijk differentieert in macrofagen na binnenkomst in het ruggenmerg. Hier wordt de gating-strategie voor de evaluatie van de verschillende celpopulaties getoond.

Het aantal cellen is gerelateerd aan de hoeveelheid geanalyseerd weefsel of bloedvolume, wat de absolute cel telling weerspiegelt. In de lymfeklieren is de expressie van IL-23 mRNA verhoogd tijdens de preklinische fase, terwijl de expressie van IL-6 op een ziekteafhankelijke manier toeneemt. In de milt nemen de expressie van IL-6 en IL-23 toe in de preklinische fase, terwijl de expressie van IL-1 beta mRNA niet wordt beïnvloed tot het begin van de ziekte.

In het bloed is uitsluitend de expressie van TNF-alpha mRNA opgereguleerd en dit gebeurt op een ziekteafhankelijke manier. In het lumbale ruggenmerg worden TNF-alpha, IL-1 bèta en interferon gamma geïnduceerd tijdens de acute fase, terwijl IL-6 alleen tijdens de onsetfase van de ziekte is opgereguleerd. Zodra het EAE-model onder de knie is, kunnen de daaropvolgende celisolatie en effectanalyse in acht uur voor tien muizen worden voltooid, mits deze correct worden uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Western Blot of ELISA, worden uitgevoerd om de resultaten van de mRNA-expressieanalyse te bevestigen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van multiple sclerose om het mechanisme van demyelinisatie in het centrale zenuwstelsel te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het EAE-model kan worden geïnduceerd en hoe immuuncellen kunnen worden geïsoleerd om reproduceerbare flowcytometrie-resultaten te verkrijgen.

Vergeet niet dat het werken met compleet adjuvans van Freund uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom voorzorgsmaatregelen tijdens deze procedure, zoals het optillen van de huid van de muis en het waarborgen van volledige penetratie van de huid door de spuit.