Name: Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis bij muizen voor multiple sclerose onderzoek. Deze methode toont immuuncel infiltratie en cytokine expressie in het centrale zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Else Kröner-Fresenius Stichting (EKFS) Onderzoek Opleidingsgroep Translationeel Onderzoek Innovatie - Pharma (TRIP) en door de "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-economisch Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" van de Staat Hessen.

ETHIEK STATEMENT: Onze experimentele procedures worden goedgekeurd door de ethische commissie van het Regierungspräsidium Darmstadt (Duitsland) en bevestigen om nationale en Europese regelgeving. Alle inspanningen werden gedaan om het dierenleed te beperken en het aantal gebruikte dieren te verminderen. 1. EAE Model <ol><li> Inductie van de EAE model <ol><li> Gebruik 10- tot 13-weken oude vrouwelijke 129S4 / SvJae x C57BL / 6 muizen voor de inductie van EAE. </li><li> Geven de muizen een subcutane injectie in de bovenste en onderrug van de encefalitogene MOG 35-55 (myeline oligodendrocyt glycoproteïne) peptide (200 ug), geëmulgeerd in 200 gl compleet Freund`s adjuvant (CFA) dat 400 ug Mycobacterium tuberculosis. Opmerking: Als negatieve, niet-ziekteverwekkende sham control, incompleet Freund&#39;s adjuvans met Mycobacterium tuberculosis, in hetzelfde volume en via dezelfde weg, kan worden gebruikt. </li><li> TherENadat en opnieuw 24 uur later, geven de muizen een intraperitoneale injectie van pertussis toxine (in totaal 0,2 g, verdund in 200 ul fosfaat-gebufferde zoutoplossing, PBS). Onbehandeld muizen als controlegroep, te kunnen vergelijken met zieke gezonde dieren. Opmerking: Het is ook mogelijk om EAE te induceren met 200-300 gg MOG 35-55 peptide 300-500 ug Mycobacterium tuberculosis in CFA en 0,2-0,3 ug pertussis toxine in een volume van 0,1-0,2 ml per injectie. </li><li> Beginnend één week na de injectie, onderzoeken muizen die dagelijks voor de klinische symptomen (zie stap 1.2.1) Opmerking: de dag van begin van de ziekte varieert in verschillende experimenten, maar onder de omstandigheden in ons laboratorium, is rond dag 11 en dus hier dag 14 gedefinieerd als 3 dagen na het begin van de ziekte. Alle muizen in deze studie ontwikkelde klinische symptomen. </li></ol></li><li> Scoren van de muizen <ol><li> Classificeren klinische symptomen van klinische scores als volgt:0) geen tekenen, 0,5) distale verlamming van de staart, 1) volledige verlamming van de staart, 1.5) slappe staart en een lichte zwakte van de achterpoten, 2) slappe staart en ernstige zwakte van de achterpoten, 2.5) slappe staart en verlamming van één achterpoot, 3) slappe staart en verlamming van beide achterpoten, 3.5) verlamming van beide achterpoten en zwakte van één voorste ledemaat (muizen het bereiken van deze score werden gedood, in overeenstemming met de lokale ethische richtlijnen). </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de Single Cellen voor Flowcytometrieanalyse Opmerking: Het antilichaam mengsel bestaat uit 1 pi CD45-Vioblue, 2 pl CD8-eFluor650, 0,5 gl CD11b-eFluor605, 0,5 gl F4 / 80-PE-Cy7, 1 ui CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 gl CD11c -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 en 1 pl Ly6G-APC-Cy7. Let op: Als je bloed, lymfeklieren, milt en het ruggenmerg neem vervolgens de procedure is als volgt: Muizen zijn diep verdoofd met een combinatie van isoflUrane (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht). Volgende open de thorax, verwijder het bloed met een intracardiale stick en perfuseren de muizen intracardiaal met koude PBS. verwijder de lymfeklieren gevolgd door milt en tenslotte het ruggenmerg. Als u niet nodig om de muizen intracardiaal perfuseren dan euthanaseren de muizen onder diepe narcose door luxatie van de nek. <ol><li> Isolatie van splenocyten <ol><li> Verdoven muizen met een combinatie van isofluraan (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht). </li><li> Natte incisie met 80% isopropanol om eventuele besmetting met haren te voorkomen en open de thorax de lengterichting, zonder prikken diepere weefsels, met een schaar. </li><li> Perfuseren muizen intracardiaal met koude PBS pH 7,0 23. Opmerking: De milt is gelegen in de linker superieure abdominale kwadrant onder de ribbenkast. Als alleen de milt worden bestudeerd, kan dit orgaan worden verwijderd voordat de perfusie om retain alle celtypen van belang. </li><li> Verwijder de milt en afgesneden ongeveer 1/8 en wegen. Bewaar het monster in PBS op ijs. </li><li> Knijp het miltweefsel door een 70 urn mesh zeef (geplaatst over een 50 ml buisje) met de zuiger van een 2 ml injectiespuit. </li><li> Was de zeef met 5 ml PBS. Centrifugeer bij 1800 xg gedurende 3 min. Resuspendeer de pellet in 500 pl lyserende oplossing. Opmerking: In dit stadium kan het nodig zijn om een ​​differentiële celtelling wanneer later een alternatieve FACS analyse methode toegepast die geen kralen (zie hoofdstuk 3) dienst heeft. </li><li> Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (KT) en voeg 500 ul PBS. Centrifugeer 6 min bij 650 xg bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Herhaal de wasstap met 500 pi PBS. Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% runderserumalbumine (BSA) / PBS, voeg 2 pl Fc-receptor-1 (FcRI) blokkerende buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Voeg 13 ul van eentibody mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Opmerking: kleuringsprocedure de fabrikant aanbevolen één wasbeurt, maar extra reductie van achtergrondkleuring kan worden bereikt door eventueel herhalen van de wasstap een of twee keer. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 500 ui PBS (of eventueel loopbuffer voor eiwitscheiding om te beperken die cel klonteren) en mogelijk in de flowcytometrie buis. Houd cellen op ijs. </li></ol></li><li> Isolatie van lymfeknoopcellen <ol><li> Verdoven muizen met een combinatie van isofluraan (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht). </li><li> Natte incisie met 80% isopropanol en open de thorax in lengterichting met een schaar. Perfuseren muizen intracardiaal met koude PBS pH 7,0 23. </li><li> Om de lies lymfeklier te isoleren, verwijder voorzichtig de huid in het gebied van de hip en kies de lymfeklier voorzichtig uit het vetweefsel met een tang. Weeg de lies lymfeklier en bewaar het monster in PBS op ijs. Opmerking: We gebruikten inguinale lymfeklieren in onze studies omdat O`Connor et al. gevonden dat grote aantallen van geactiveerde monocyten, macrofagen, neutrofielen en T-cellen waren aanwezig in de inguinale lymfeknopen na EAE inductie 24. </li><li> Knijp de lymfeklier door een 70 um mesh zeef (geplaatst over een 50 ml tube) met behulp van de zuiger van een 2 ml spuit. </li><li> Was de zeef met 5 ml PBS. Centrifugeer bij 2400 xg gedurende 8 minuten. Resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% BSA / PBS, voeg 2 ul FcRI blokkeerbuffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Voeg 13 ul antilichaam mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 300 ui PBS (of een geschikte loopbuffer) en overbrengeneen flowcytometrie buis. </li></ol></li><li> Isolatie van bloedcellen <ol><li> Voeg 50 ul 20 mM HEPES bij 50 pl bloed (gestabiliseerd met EDTA) en voeg 500 ul lyserende oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en voeg 500 ul PBS. Centrifugeer 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. Gooi supernatant en herhaal de wasstap. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% BSA / PBS, voeg 2 ul FcRI blokkeerbuffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Voeg 13 ul antilichaam mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 300 pi PBS en mogelijk in de flowcytometrie buis. </li></ol></li><li> Isolatie van het ruggenmerg cellen <ol><li> Verdoven muizen met een combinatie van isofluraan (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht). </li><li> Natte incisie met 80% isopropanol en open de thorax lengterichtingmet een schaar. Perfuseren muizen intracardiaal met koude PBS pH 7,0 23. </li><li> Bevochtig de incisie gebied op de rug en maak weer een longitudinale snit met een scalpel en verwijder de huid. </li><li> Knip het lumbale deel van de wervelkolom (die de achterpoten innervates) en spoelen met PBS een injectiespuit aan het ruggenmerg extraheren. Knip ongeveer 1/3 van de lumbale koord, weegt dit en bewaar het monster in PBS op ijs. </li><li> Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, voeg 500 ul cel losraken oplossing en HBSS (1: 1). Voeg 3 mg / ml collagenase A en 1 eenheid / ml DNase I, onthalzen de cellen door herhaaldelijk op en neer pipetteren en incubeer gedurende 30 minuten onder schudden bij 37 ° C bij 400 rpm. Opmerking: Desgewenst kan de celsuspensie worden vrijgemaakt van verontreinigende myeline en celresten door dichtheidsgradiënt centrifugatie die de gevoeligheid van de meting kan flowcytometrie verbeteren daardoor reducerende achtergrond autofluorescentie eend het aantal gebeurtenissen die moeten worden overgenomen (zie paragraaf 3.5). </li><li> Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 ml 10% foetaal kalfsserum (FCS) / Dulbecco&#39;s minimaal essentieel medium (DMEM) en onthalzen de cellen opnieuw door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. </li><li> Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS en knijp het ruggenmerg door een 70 urn mesh zeef (geplaatst over een 50 ml buisje) met de zuiger van een 2 ml injectiespuit. </li><li> Was de zeef met 4 ml PBS. Centrifugeer bij 1800 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% BSA / PBS, voeg 2 ul FcRI blokkerende reagens en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Voeg 13 ul antilichaam mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 500 pl PBS (of een geschikte loopbuffer) en mogelijk in de flowcytometrie buis. </li></ol></li></ol> 3. Flow cytometrische analyse <ol><li> Titreer alle antilichamen vooraf optimale concentraties te bepalen zoals beschreven door Olesch et al. 25. </li><li> Gebruik antilichaam vastleggen compensatie kralen voor eenkleurige compensatie multi-color compensatie matrices maken volgens de instructies fabrikant `. </li><li> Controle van de kalibratie dagelijks met behulp van specifieke kralen volgens de instructies de fabrikant. </li><li> Direct voor de flowcytometrie meting, voeg 30 ul flowcytometrische absolute aantal standaard om de cellen (voor isolatie zie paragraaf 2,1, 2,2, 2,3, 2,4) absolute celtellingen bepalen. In plaats van het tellen van kralen van de cellen kunnen worden geteld. </li><li> Neem monsters (cellen uit de milt, lymfeklieren en bloed: 100.000 gebeurtenissen, het ruggenmerg: 500.000 events) in een flowcytometer eennd analyse met behulp van specifieke software flowcytometrie. <ol><li> Open de flowcytometrie software en FCS toe te voegen 3.0-bestanden door te drukken op de knop &quot;add samples&quot;. </li><li> Open het bestand toegevoegd door te dubbelklikken. Stel de kanalen voor de x- en y-as. Om selecteert u de cel populaties van belang te creëren een poort (zie figuur 4). </li></ol></li></ol> 4. Kwantitatieve PCR analyse <ol><li> Isolatie van mRNA en transcriptie in cDNA <ol><li> Pak het mRNA van lumbale ruggenmerg (1/3), milt (1/8) en lies lymfeklieren door fenol-chloroform en neerslaan met ethanol 26. <ol><li> Hiervoor Homogeniseer het weefsel in 1 ml guanidinium thiocyanaat-fenol mengsel, incubeer gedurende 10 minuten. Voeg 200 ul chloroform en opnieuw incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Na een centrifugatie stap (18.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C), was de bovenste waterige fase met 500 pl isopropanol en centrifugeer (18.000 xg gedurende 8 minuten bij 4° C). </li><li> Was de pellet met 500 pi ethanol en na centrifugatie stap (18.000 g gedurende 5 min bij 4 ° C), droog de pellet in de vacuümconcentrator (5 min bij 30 ° C). Daarna resuspendeer de pellet in 30 ul water. </li></ol></li><li> Om het mRNA te extraheren uit bloed, centrifuge 500 gl EDTA-bloed gestabiliseerd (300 x g 10 min 4 ° C). <ol><li> Neem de bufferlaag, die witte bloedcellen en verdund in 1 ml lyserende oplossing (150 mM NH4Cl, 100 mM NaHCO 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4). </li><li> Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, gecentrifugeerd cellen bij 650 g gedurende 6 minuten en vervolgens tweemaal wassen met PBS. </li><li> Extraheer het mRNA van witte bloedcellen (WBC&#39;s) met een kit voor RNA extractie volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Voeren cDNA-synthese onder toepassing van een kit voor cDNA-synthese zoals willekeurige hexameren volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 200 ng mRNA voor het CDNEen synthese. </li></ol></li><li> kwantitatieve PCR <ol><li> Om de hoeveelheid van een specifiek mRNA te kwantificeren, gebruiken 1 ui cDNA, 1 uM vooruit / achteruit primer en een fluorescerende DNA-bindende kleurstof volgens de instructies van de fabrikant 27. Zie Tabel 1 voor de sequenties voor de primer sets. Meet de CT-waarden van IL-1β, IL-6, IL-23, IFNy, TNFa en PPIA (peptidyl prolyl isomerase) met een kwantitatieve PCR systeem. </li><li> Om te bepalen van de relatieve mRNA expressie gebruik maken van de vergelijkende methode 27 CT (cyclus drempelwaarde). <ol><li> Hiervoor normaliseren CT-waarden van de doelgenen de expressieniveaus van PPIA door het aftrekken van de gemiddelde CT-waarde PPIA van het doelwitgen, zoals in eerdere studies (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Vervolgens berekent de zogenaamde ΔΔCT-waarden, met behulp waarvan de AC T-waarden normaliserenvan de doelgenen van EAE muizen om het expressieniveau van de doelwitgenen van onbehandelde muizen, weer door het aftrekken van de gemiddelde AC T-waarde in de onbehandelde muizen uit de AC T-waarde in EAE muizen. </li><li> De relatieve mRNA-expressie van het doelwitgen te krijgen, berekent de verhouding met de volgende formule: 2 - ΔΔct. </li></ol></li></ol></li><li> Test de specificiteit van elke primer. Bepaal het geamplificeerde fragment in door middel van een 2% agarosegel 31. De fragmentgrootte is weergegeven in tabel 1. </li></ol>

MJP is een adviseur voor Xellia en voor Leo Pharmaceuticals.

EAE model beschreven heeft de meeste aandacht gekregen als een model van MS en wordt routinematig gebruikt in het testen van therapeutische strategieën voor MS 32. De muis ziekte vertoont vele klinische en histologische kenmerken van MS en wordt veroorzaakt door de inductie van autoimmuniteit neuronale antigenen. Sensibilisatie tegen myeline antigenen geassocieerd met bloed hersenbarrière disfunctioneren en daardoor immune cel infiltratie in het CNS. Onze resultaten tonen aan dat immuuncellen verhogen tijdeli...

Multiple sclerose (MS) en de bijbehorende diermodel, experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE), tonen autoimmune neuroinflammatie veranderingen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Vroege actieve MS en EAE letsels worden gekenmerkt door de aanwezigheid van geïnfiltreerde immuuncellen. De etiologie van MS nog steeds onbekend, maar wordt algemeen beschouwd als de vernietiging van myeline gemedieerd door autoreactieve T-cellen omvatten. Deze autoreactieve T-cellen scheiden cytokines en chemokines die andere immune cellen zoals B cellen, monocyten en neutrofielen uit de circulatie te trekken. Monocyten differentiëren tot macrofagen. Interferon gamma (IFNy) uitgescheiden door autoreactieve T cellen polariseert de macrofagen in pro-inflammatoire macrofagen. De pro-inflammatoire cytokinen macrofagen afgifte en reactieve zuurstofdeeltjes die apoptose in oligodendrocyten te bevorderen. De dood van de oligodendrocyten leidt tot demyelinisatie. Voorts B-cellen differentiëren tot pLasma cellen en afgifte autoantilichamen tegen de myelineschede, uiteindelijk leidt tot afbraak van myeline. Het verlies van myeline leidt tot afbraak van axonen en neuronen en daardoor de vorming van laesie plaatsen in het CZS die de belangrijkste kenmerk van MS 1 vertegenwoordigen. In de periferie, worden T-cellen en B-cellen geactiveerd in de lymfeklieren, ze prolifereren in de milt en migreren door de circulatie in het centrale zenuwstelsel. Monocyten en neutrofielen prolifereren in het beenmerg en ook migreren door de circulatie in het centrale zenuwstelsel. Leukocytextravasatie uit beenmerg, milt en lymfeknopen in het bloed of uit de bloedstroom in het centraal zenuwstelsel is een meerstaps proces dat afhankelijk is van verschillende factoren, waaronder moleculaire interacties tussen leukocyten en endotheel gemedieerd door chemokines en chemokinereceptoren. De productie van chemokinen van verschillende celtypen kunnen worden geïnduceerd tijdens de immune keuze reactietijdn door cytokinen zoals tumornecrosefactor-α (TNFa), IFNy en interleukine-6 ​​(IL-6), die vervolgens rekruteert immuuncellen naar de plaats van ontsteking 2,3. Immune cellen vormen een subset van chemokine receptoren op hun oppervlak, afhankelijk van het celtype en migratie pad naar de ontstekingsplaats. Aldus CXCR2, CCR1 en CXCR1 uitgedrukt op rijpe neutrofielen in het beenmerg en bloed 4 en binding van de liganden, CXCL2, CCL5 of CXCL6 respectievelijk activeert neutrofielen en bevordert hechting aan het endotheel en vervolgens de migratie van de cellen in de weefsels 5-9. CCL2 en CCL20 trekken monocyten en Th1 / Th17 cellen 10, die CCR2 11 en CCR6 12 respectievelijk uit te drukken,. CCR1 en CCR5, door verschillende celtypen, waaronder T-cellen, monocyten en macrofagen 13 uitgedrukt, binden CCL3, CCL5 en CCL7 en worden opgereguleerd tijdens MS-14. CXCR3 wordt uitgedrukt op T-cellen en bindt CCL9, CCL10 enCCL11 15. Een belangrijkste strategie bij MS behandeling is de uitputting van immuuncellen of voorkomen van immuuncellen infiltratie in het CNS. Daarom heeft de blokkade van specifieke chemokine receptoren onderzocht in EAE. Antagonisme of genetische deletie van CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 of CXCR2 19 vermindert EAE pathologie, terwijl antagonisme of genetische deletie van CCR1 20, leverde CCR5 20 of CXCR3 21 niet de pathologie te verminderen. Daarom is de expressie van specifieke chemokine receptoren op leukocyten is cruciaal voor de infiltratie van de laatste in het CZS en bepaalt het verloop van EAE. De uitputting van immuuncellen is een effectieve behandelingsstrategie voor MS-patiënten, omdat geïnfiltreerd immune cellen geven cytokines zoals TNFa, IL-6 en IL-1β, die op zijn beurt het bevorderen ontstekingsproces of afbraak van 22 neuronen. Bovendien auto-reactieve Th1 cellen geven IFNy, die op zijn beurt stimuleert macrofagen TNFa, IL-1β en IL-23 vrij. Dit manuscript beschrijft de inductie van EAE, het bepalen van de immune celverdeling en cytokine niveaus (mRNA) in verschillende weefsels in muizen EAE. Cellen werden op verschillende tijdstippen die in het ziekteverloop een tijdsafhankelijke overzicht van inflammatoire processen die uiteindelijk leiden tot laesievorming in het CZS verschaffen.

<table><tbody><tr><td>ABI Prism 7500 Sequence Detection System&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, USA</td><td></td><td>kwantitatieve PCR-systeem</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>A6964</td><td>oplossing voor celdetachment</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Frankfurt, Germany</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Frankfurt, Germany</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>552843</td><td>compensatiekralen</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Cytometric absolute count standard&nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>Cytometer Setup and Tracking beads&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, USA</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Germany</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>First Strand cDNA-Synthesis kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc receptor-1 blocking buffer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometric absolute count standard</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software v10&nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, USA</td><td></td><td>flowcytometriesoftware</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td></td><td>flowcytometer</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>K0221</td><td>fluorescente DNA-bindende kleurstof&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>74104</td><td>RNA-extractiekit</td></tr></tbody></table>

inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerose wordt als een autoimmune ziekte, die wordt gekenmerkt door laesievorming in het centrale zenuwstelsel (CNS) leidt tot cognitieve en motorische stoornissen zijn. Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) een nuttig diermodel van MS, omdat het ook gekenmerkt door laesievorming in het CNS, motorische beschadiging en wordt ook aangedreven door auto-immuunziekten en inflammatoire reacties. Een van de modellen EAE wordt geïnduceerd met een peptide afgeleid van myeline oligodendrocyt-eiwit (MOG) 35-55 bij muizen. De EAE muizen ontwikkelen een progressieve ziekte natuurlijk. Deze cursus is verdeeld in drie fasen: de preklinische fase (dag 0-9), het begin van de ziekte (dag 10 - 11) en de acute fase (dag 12 - 14). MS en EAE geïnduceerd door autoreactieve T-cellen die infiltreren het CZS. Deze T-cellen scheiden chemokines en cytokines die leiden tot de aanwerving van verdere immuuncellen. Daarom is de immune celverdeling in het ruggenmerg dijdens de drie fasen ziekte onderzocht. Het tijdstip van de ziekte waarop de activering / proliferatie / accumulatie van T-cellen, B-cellen en monocyten begint markeren werd de immuuncel verdeling lymfklieren, milt en bloed ook beoordeeld. Bovendien voert de verschillende cytokines (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) in de drie ziekte fasen werden bepaald, inzicht in de ontstekingsprocessen van de ziekte. Concluderend, de data geven een overzicht van de functionele profiel van immuuncellen in EAE pathologie.

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de verschillende methoden beschreven in dit artikel. 1) Muizen krijgen een injectie van MOG 35-55 antigen en de ontwikkeling van de eerste klinische symptomen na 10,7 ± 0,3 dagen 28. Een vertegenwoordiger ziekteverloop van EAE muizen wordt weergegeven in figuur 1. 2) verschillende weefsels (milt, lymfeknopen, lumbale ruggenmerg) en bloed worden uit contro...

Dit manuscript beschrijft de methoden voor inductie en scoren van het experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) model, samen met de beoordeling van immuunceldistributie en mRNA-cytokineniveaus in lymfeklieren, milt, bloed en ruggenmerg met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR, respectievelijk, in verschillende fasen van de ziekte.

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Het algemene doel van het model voor experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is het faciliteren van de studie naar de potentiële moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan de ontwikkeling van multiple sclerose. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van multiple sclerose, zoals: in welk stadium van de ziekte infiltreren immuuncellen het centrale zenuwstelsel? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het EAE-model veel van de belangrijkste kenmerken van multiple sclerose nabootst, zoals demyelinisatie en immuuncelinfiltratie.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van multiple sclerose, aangezien geneesmiddelen die met deze methode zijn getest, al zijn goedgekeurd voor deze ziekte. In het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode problemen kunnen ondervinden, omdat er strikte voorwaarden in overweging moeten worden genomen bij het induceren van EAE. Muizen moeten in een stressvrije omgeving worden gehouden en een pertussistoxine moet vers worden bereid.Een officiële demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het isoleren van de lymfeklieren en het extraheren van het ruggenmerg moeilijk te leren zijn op basis van alleen een beschrijving. Begin met het subcutaan injecteren van 10 tot 13 weken oude vrouwelijke muizen met 200 micrograms myelin oligodendrocyte glycoprotein, geëmulgeerd in 200 microliters complete Freund's adjuvant, bevattend 400 micrograms mycobacterium tuberculosis.Injecteer de muizen onmiddellijk en 24 uur later intraperitoneaal met 0,2 micrograms pertussistoxine in 200 microliters PBS. Het is essentieel dat de muizen zowel aan de hantering als aan de experimentele omgeving zijn gewend voordat de EAE-inductie plaatsvindt, om stress te voorkomen die de ontwikkeling van klinische symptomen kan belemmeren. Onderzoek de muizen een week na de injectie dagelijks op klinische symptomen, zoals beschreven in de tabel.Om de door EAE geïnduceerde immuuncelpopulatie in de lymfeklieren te evalueren, bevochtigt u op het juiste tijdstip na inductie het incisiegebied met 80% isopropanol en verwijdert u voorzichtig de huid over de heupstreek. Verwijder met een pincet voorzichtig de inguinale lymfeklier uit het vetweefsel. Weeg vervolgens de klier en plaats het monster in PBS op ijs.Om de cellen van het ruggenmerg te analyseren, bevochtig meticulously de rug van het dier met isopropanol en gebruik een scalpel om een longitudinale incisie langs de ruggengraat te maken. Verwijder vervolgens de huid en dissecteer het lumbale deel van de wervelkolom vrij, dat de achterpoten innerveert. Spoel de wervelkolom door met een met PBS gevulde spuit om het ruggenmerg te extraheren.Nadat ongeveer 1/3 van het lumbale ruggenmerg is verwijderd, weegt u het spinale fragment en bewaart u het weefsel in PBS op ijs. Om de immuuncelpopulatie van de milt te analyseren, opent u het weefsel om toegang te krijgen tot het onderste deel van de buikholte. Verwijder vervolgens de milt en snijd ongeveer 1/8 van het weefsel af.Weeg het miltfragment en bewaar het weefsel in PBS op ijs. Gebruik vervolgens de zuiger van een spuit van 2 mL om de rest van het weefsel door een zeef met een maaswijdte van 70 micron in een buis van 50 milliliter te persen, gevolgd door een spoeling van de zeef met 5 milliliter PBS. Centrifugeer de gefilterde cellen.Resuspendeer de pellet in 500 µL cellysebuffer en breng de cellen over naar een buisje van 1,5 mL. Na 10 minuten bij kamertemperatuur worden de cellen twee keer gewassen in 500 µL PBS. Na de tweede wasbeurt wordt de pellet geresuspendeerd in 100 µL 0,2% BSA in PBS, waarna twee µL Fc-receptor blokkeringsbuffer aan de cellen wordt toegevoegd.Na 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur worden de cellen gelabeld met 13 µL antilichaamcocktail gedurende nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen aan het einde van de incubatie minstens twee keer in 500 µL PBS en resuspendeer het uiteindelijke pellet in 500 µL verse PBS. Draag de cellen vervolgens over naar een flowcytometrie-buis op ijs.Ten slotte, om de monsters via flowcytometrie te analyseren, voegt u direct voor de flowcytometrie-meting 30 microliters flowcytometrische absolute telstandaard toe aan de cellen om de absolute celaantallen te bepalen. Analyseer vervolgens de monsters op de flowcytometer. Zoals deze figuur illustreert, wordt tijdens de acute fase van EAE-inductie een voorbijgaande toename van alle immuuncelpopulaties binnen de lymfeklieren waargenomen.In de milt vertonen echter alleen macrofagen, B-cellen, T-cellen en neutrofielen een verhoogde infiltratie. In het bloed vertonen alle immuuncelpopulaties een tijdelijke toename in hun perifere circulatie tijdens de preklinische fase, wat overeenkomt met een soortgelijke ziekteafhankelijke toename in het lumbale ruggenmerg tijdens de acute fase van de ziekte, met uitzondering van de monocytenpopulatie, die vermoedelijk differentieert in macrofagen na binnenkomst in het ruggenmerg. Hier wordt de gating-strategie voor de evaluatie van de verschillende celpopulaties getoond.Het aantal cellen is gerelateerd aan de hoeveelheid geanalyseerd weefsel of bloedvolume, wat de absolute cel telling weerspiegelt. In de lymfeklieren is de expressie van IL-23 mRNA verhoogd tijdens de preklinische fase, terwijl de expressie van IL-6 op een ziekteafhankelijke manier toeneemt. In de milt nemen de expressie van IL-6 en IL-23 toe in de preklinische fase, terwijl de expressie van IL-1 beta mRNA niet wordt beïnvloed tot het begin van de ziekte.In het bloed is uitsluitend de expressie van TNF-alpha mRNA opgereguleerd en dit gebeurt op een ziekteafhankelijke manier. In het lumbale ruggenmerg worden TNF-alpha, IL-1 bèta en interferon gamma geïnduceerd tijdens de acute fase, terwijl IL-6 alleen tijdens de onsetfase van de ziekte is opgereguleerd. Zodra het EAE-model onder de knie is, kunnen de daaropvolgende celisolatie en effectanalyse in acht uur voor tien muizen worden voltooid, mits deze correct worden uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Western Blot of ELISA, worden uitgevoerd om de resultaten van de mRNA-expressieanalyse te bevestigen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van multiple sclerose om het mechanisme van demyelinisatie in het centrale zenuwstelsel te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het EAE-model kan worden geïnduceerd en hoe immuuncellen kunnen worden geïsoleerd om reproduceerbare flowcytometrie-resultaten te verkrijgen.Vergeet niet dat het werken met compleet adjuvans van Freund uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom voorzorgsmaatregelen tijdens deze procedure, zoals het optillen van de huid van de muis en het waarborgen van volledige penetratie van de huid door de spuit.

induction-experimental-autoimmune-encephalomyelitis-mice-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de inductie en de klinische scoren van een diermodel van multiple sclerose: chronisch-recidiverende experimentele auto-immune encephalomyelitis in DA ratten. De ziekte, veroorzaakt door het immuniseren van ratten met een emulsie met hele rat het ruggenmerg en de volledige Freund's adjuvans, presenteert klinische symptomen lijken op de menselijke ziekte.

Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the method of inducing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by injecting myelin-derived peptides with an adjuvant to activate autoreactive T cells, which migrate to the brain. Pertussis toxin is administered to increase blood-brain barrier permeability, allowing these T cells and other immune cells to enter the brain. These immune cells cause demyelination, leading to impaired nerve transmission and development of EAE.

Generation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

Dit protocol beschrijft hoe te bepalen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis CNS-bescherming vertonen als gevolg van het onderdrukken van immuuncel-infiltratie of neuroprotectief zijn tijdens de aanval van immuuncel-infiltratie.

Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis is een van de meest gebruikte muizenmodellen van multiple sclerose. In het huidige protocol worden C57BL/6J-muizen van beide geslachten geïmmuniseerd met myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide, wat voornamelijk resulteert in oplopende parese van de staart en ledematen. Hier bespreken we het protocol van EAE-inductie en -evaluatie.

Modellering van multiple sclerose bij de twee geslachten: MOG35-55-geïnduceerde experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis bij muizen voor multiple sclerose onderzoek. Deze methode toont immuuncel infiltratie en cytokine expressie in het centrale zenuwstelsel.

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels (Video) | JoVE Journal

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Meer video's verkennen