Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Het algemene doel van het experimentele Auto-immuun Encefalomyelitis of EAE-model, is om het onderzoek naar de mogelijke moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van multiple sclerose te vergemakkelijken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van multiple sclerose te beantwoorden, zoals in welk stadium van de ziekte immuuncellen het centrale zenuwstelsel binnendringen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het EAE-model veel van de belangrijkste kenmerken van multiple sclerose nabootst, zoals demyelinisatie en infiltratie van immuuncellen.

De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van multiple sclerose omdat geneesmiddelen die met deze methode zijn getest al zijn goedgekeurd voor deze ziekte. Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden omdat er grondige voorwaarden zijn die moeten worden overwogen bij het induceren van EAE. Muizen moeten in een stressvrije omgeving worden gehouden en een pertussis toxine moet vers worden bereid.

Officiële demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de isolatie van de lymfeklieren en de extractie van het ruggenmerg moeilijk te leren zijn door alleen beschrijving. Begin met het subcutaan injecteren van 10 tot 13 weken oude vrouwelijke muizen met 200 microgram myeline oligodendrocyte glycoproteïne. geëmulgeerd in 200 microliters volledige Freund's adjuvant, bevattende 400 microgram mycobacterium tuberculosis.

Onmiddellijk en 24 uur later, injecteer de muizen intraperitoneaal met 0,2 microgram pertussis toxine in 200 microliters PBS. Het is essentieel dat muizen zowel aan de omgang als aan de experimentele omgeving zijn aangepast voordat EAE-inductie naar het induceren van stress wordt geleid, wat de ontwikkeling van klinische symptomen kan voorkomen. Een week na de injectie, onderzoek de muizen dagelijks op klinische symptomen zoals beschreven in de tabel.

Om de door EAE geïnduceerde lymfeklieren immuuncelpopulatie te evalueren, bevochtig het incisiegebied op het juiste tijdstip na inductie met 80% isopropanol en verwijder voorzichtig de huid boven de heupregio. Gebruik pincetten om voorzichtig de inguinale lymfeknoop uit het vetweefsel te verwijderen. Weeg vervolgens de knoop en plaats het monster in PBS op ijs.

Om de ruggenmergcellen te analyseren, bevochtig de achterkant van het dier met isopropanol en gebruik een scalpel om een longitudinale snede door de wervelkolom te maken. Vervolgens verwijdert u de huid en verwijdert u het lumbale deel van de wervelkolom, dat de achterpoten innerveert. Spoel de wervelkolom door met een met PBS gevulde spuit om het ruggenmerg te extraheren.

Na het verwijderen van ongeveer 1/3 van het lumbale koord, weeg het wervelfragment en bewaar het weefsel in PBS op ijs. Om de splenische immuuncelpopulatie te analyseren, opent u het weefsel om toegang te krijgen tot het onderste deel van de buik. Vervolgens verwijdert u de milt en snijdt u ongeveer 1/8 van het weefsel af.

Weeg het miltfragment en bewaar het weefsel in PBS op ijs. Gebruik vervolgens de zuiger van een tweede mL-sering om de rest van het weefsel te vermalen door een 70 micron gaaszeef op een 50 milliliterbuis, gevolgd door een vijf milliliter PBS-was van de zeef. Centrifugeer de gefilterde cellen.

Suspensie de pellet in 500 microliters cellysebuffer en breng de cellen over in een 1,5 milliliterbuis. Na 10 minuten bij kamertemperatuur, was de cellen twee keer in 500 microliters PBS. Na de tweede was, suspendeert u de pellet in 100 microliters van 0,2% BSA in PBS en voegt u twee microliters Fc-receptor één blokkerende buffer toe aan de cellen.

Na 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur, label de cellen met 13 microliters antilichaamcocktail voor nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatie, was de cellen ten minste twee keer in 500 microliters PBS en suspendeer de uiteindelijke pellet in 500 microliters vers PBS. Breng vervolgens de cellen over in een flowcytometriebuis op ijs.

Ten slotte, om de monsters te analyseren door flowcytometrie, voegt u direct vóór de flowcytometriemetingen 30 microliters flowcytometrisch absoluut telstandaard toe aan de cellen voor het bepalen van de absolute celtelling. Analyseer vervolgens de monsters op de flowcytometer. Zoals deze figuur illustreert, wordt een tijdelijke toename in alle immuuncelpopulaties binnen de lymfeklieren waargenomen tijdens de acute fase van EAE-inductie.

In de milt echter, tonen alleen macrofagen, B-cellen, T-cellen en neutrofielen een verhoogde infiltratie. In het bloed vertonen alle immuuncelpopulaties een tijdelijke toename in hun perifere circulatie tijdens de preklinische fase die overeenkomt met een soortgelijke ziekte-afhankelijke toename in het lumbale ruggenmerg tijdens de acute fase van de ziekte, met uitzondering van de monocytpopulatie, die vermoedelijk differentieert in macrofagen na binnenkomst in het ruggenmerg. Hier wordt de gating-strategie voor de evaluatie van de verschillende celpopulaties getoond.

Het aantal cellen is gerelateerd aan de hoeveelheid weefsel of bloedvolume die wordt geanalyseerd, wat de absolute celtelling weerspiegelt. In de lymfeklieren is IL-23 mRNA-expressie verhoogd tijdens de preklinische fase, terwijl de expressie van IL-6 op ziekte-afhankelijke wijze toeneemt. In de milt nemen de expressie van IL-6 en IL-23 toe in de preklinische fase, terwijl IL-1 bèta mRNA-expressie niet wordt beïnvloed tot het begin van de ziekte.

In het bloed is de expressie van alleen TNF-alfa mRNA opgereguleerd en op ziekte-afhankelijke wijze. In het lumbale ruggenmerg worden TNF-alfa, IL-1 bèta en interferon gamma geïnduceerd tijdens de acute fase, terwijl IL-6 alleen tijdens de aanvangsfase van de ziekte wordt opgereguleerd. Eenmaal onder de knie, kunnen het EAE-model, de daaropvolgende celisolatie en effectenanalyse in acht