Name: Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Verken een workflow voor het visualiseren van vasculaire regeneratie in muizen na partiële hepatectomie met behulp van µCT en 3D-reconstructie. Deze methode biedt inzicht in vasculaire groei en leverregeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken voor de financiering door het Duitse Ministerie van Onderwijs en Wetenschap (BMBF) via het systeembiologienetwerk "Virtual Liver", subsidienummers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS). De auteurs danken ook Frank Schubert voor technische ondersteuning.

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Duitsland. Omdat het portaal veneuze systeem los van de lever veneuze systeem werd gevisualiseerd, werden afzonderlijke dieren die nodig zijn voor de verschillende vasculaire bomen. 1. Reagentia Voorbereiding <ol><li> Heparine-zoutoplossing <ol><li> Voeg 0,1 ml héparine in 10 ml zoutoplossing (5 IU / ml). </li></ol></li><li> Silicone compound mengsel <ol><li> Voeg 2 ml MV-120 in een 5 ml buis. Verdun MV-120 door toevoeging van 3 ml MV verdunningsmiddel resulteert in een 40% oplossing. </li></ol></li></ol> 2. Portal veneuze systeem Silicone Injection <ol><li> laparotomie <ol><li> Plaats de muis in de anesthesie inductie kamer en verdoven met 2% isofluraan en 0,3 l / min zuurstof. </li><li> Bevestig de verdoofde muis op de operatietafel met behulp van tape met continue inademing van 2%oflurane en 0,3 l / min zuurstof. Controleer de toe-snuifje reflex terugtrekking van de muis en start de werking als de reflex afwezig is. </li><li> Voeg een dwarse incisie op de buik met een schaar van de huidlaag en een elektrische coagulator de spierlaag. Beweeg de darmen naar de linkerkant met behulp van katoen tips en hebben betrekking op de darmen met een zoutoplossing gedrenkt gaasje. </li></ol></li><li> katheterinsertieplaatsen <ol><li> Ontleden poortader onder de microscoop met micro-pincet. Plaats een 6-0 zijden hechtdraad onder de ader extrahepatische portal, in ongeveer 1 mm afstand tot de splitsing en bind het losjes voor later gebruik. </li><li> Injecteren bereid heparine-zoutoplossing via een ader van de penis (mannelijk) of inferior vena cava (vrouwelijke) voor systemisch heparinisatie gedurende 5 minuten. </li><li> Steek de 26-gauge (26 G) katheter met een naald in de poortader en zet het vast met een klem </li></ol></li><li> Heparine-zoutoplossing en siliconen verbinding perfusie <ol><li> Load heparine-zoutoplossing solution in 5 ml spuit en zet perfusie apparaat. Vul het catheter volledig met heparine-zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen. </li><li> Sluit de allonge aan de katheter en strak ze op te lossen. Start heparine-zoutoplossing perfusie met een perfusie snelheid van 0,4 ml / min. </li><li> Ligeer pre-geplaatste 6-0 zijden hechtdraad voor dubbele vaststelling van de katheter en het blokkeren van de bloedstroom van de milt ader en mesenteriale ader. Euthanatize de muis door verbloeding via perfusie onder verdoving. </li><li> Spoel de lever via zoutoplossing gedurende de gehele perfusie procedure om het vochtig te houden. </li><li> Voeg 0,1 ml verharder in de MV-120 buis. Veranderen heparine-zoutoplossing spuit siliconen spuit. </li><li> Begin silicone perfusie perfusie met een snelheid van 0,2 ml / min gedurende ongeveer 1 min tot het kathetersysteem Prefill en de poortader installatie te vullen. Stop met silicone perfusie wanneer de schepen op het oppervlak blauw worden. </li></ol></li><li> monsterneming <ol><li> Houd de lever in situ until het silicone volledig na ongeveer 15 tot 30 minuten gepolymeriseerd. Ontleden ligamenten aansluiten van de lever en de aangrenzende organen met zorg aan de lever intact te houden. Explanteer de lever en zet het in formaline voor fixatie. </li></ol></li></ol> 3. Verminderde veneuze systeem Silicone Injection <ol><li> Voer laparotomie zoals uitgevoerd in stap 2.1 en bloot operatiegebied volledig. </li><li> katheterinsertieplaatsen <ol><li> Ontleden poortader onder de microscoop met micro-pincet. Plaats een 6-0 zijden hechtdraad onder de ader extrahepatische portal, in ongeveer 1 mm afstand tot de splitsing en bind het losjes voor later gebruik. </li><li> Injecteren bereid heparine-zoutoplossing via een ader van de penis (mannelijk) of inferior vena cava (vrouwelijke) voor systemisch heparinisatie gedurende 5 minuten. </li><li> Steek een 26 G catheter (catheter 1) met een naald in de poortader en zet het vast met een klem. Plaats een andere 26 G catheter (catheter 2) met de naald in de vena cava inferior en zet het vast met een klem. </li><li> Afbinden de takken van de vena cava inferior (met inbegrip van links en rechts renale aderen) en het distale einde met behulp van 6-0 synthetisch, monofilament, niet-absorbeerbare polypropyleen hechtdraad. </li></ol></li><li> Heparine-zoutoplossing en siliconen verbinding perfusie <ol><li> Laad heparine-zoutoplossing in 5 ml spuit en zet perfusie apparaat. Vul catheter 1 compleet met heparine-zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen. Sluit uitbreiding buis catheter 1 en zet het stevig vast. Start heparine-zoutoplossing perfusie met een snelheid van 0,4 ml / min. </li><li> Ligeer pre-geplaatste 6-0 zijden hechtdraad voor dubbele vaststelling van de katheter en het blokkeren van de bloedstroom van de milt ader en mesenteriale ader. Euthanatize de muis door verbloeding via perfusie onder verdoving. </li><li> Spoel de lever via zoutoplossing gedurende de gehele perfusie procedure om het vochtig te houden. Voeg 0,1 ml verharder in de MV-120 buis. Exchange heparine-zoutoplossing spuit met siliconen spuit. </li><li> Plaats een klem op de suprahepatic inferior vena cava om de uitstroom van de lever belemmeren. </li><li> Sluit de allonge aan katheter 2 en begin silicone perfusie met een perfusie snelheid van 0,2 ml / min gedurende ongeveer 2 minuten om een ​​objectieve levervaten volume te bereiken zoals gerapporteerd. Stop met silicone perfusie wanneer de schepen op het oppervlak blauw worden. </li></ol></li><li> monsterneming <ol><li> Ontleden lever ligamenten berokkende schade te voorkomen aan de lever. Explanteer de lever en zet het in formaline voor fixatie. </li></ol></li></ol> 4. Micro-CT (μCT) Scannen Om de geëxplanteerde lever monster scannen met behulp van μCT, zijn de volgende stappen die nodig zijn. <ol><li> Neem de lever monster uit de fixatie-oplossing. Plaats de lever op de μCT bed. Doe de μCT bed met de lever monster in de μCT. </li><li> Verwerven topogram voor aanvang van de scan. Gebruik een subscan voor de kleine lever monster en twee subscans voor grote steekproeven. </li><li> Selecteer een81, CT-protocol met een hoge resolutie (bijv HQD-6565-390-90). Dit protocol verwerft 720 projecties met 1032 x 1012 pixels bij een volledige omwenteling met de scantijd van 90 sec per sub-scan. Start de μCT scan. </li></ol> 5. Histologische seriecoupes <ol><li> Insluiten de lever model in paraffine als geheel na μCT scannen. Snijd hele paraffine monster in 4 pm secties, waardoor een reeks van 2000 tot 2500 delen. </li><li> Vlek secties met de juiste kleuring techniek te visualiseren moleculaire gebeurtenissen van belang, zoals Ki-67 als proliferatie marker en HMGB1 als een marker van ischemische schade. Bepaal de volgorde van de kleuring in ten opzichte van de wetenschappelijke vraag. </li><li> Gebruik een hele dia scanner om de gekleurde coupes digitaliseren. </li><li> Voer 3D-reconstructie van vasculaire boom (s) (al haalbaar) en visualiseren 3D-verdeling van de moleculaire gebeurtenissen met betrekking tot vasculaire boom (onderzoek in uitvoering). </li></ol>

<ol><li>Bearden, S. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+alignment+in+adult+mouse+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles.</a> Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).</li>
<li>Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+parameter+values+for+physiologically+based+pharmacokinetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.Ind.Health%22%5BJournal%5D)">Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models.</a> Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).</li>
<li>Dai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-Induced+Intracranial+Dolichoectasia+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice.</a> Neurosurgery. , (2015).</li>
<li>Ding, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+angiocrine+signals+from+sinusoidal+endothelium+are+required+for+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration.</a> Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).</li>
<li>Downey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ex-vivo+micro-computed+tomographic+imaging+of+blood+vessels+and+necrotic+regions+within+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors.</a> PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).</li>
<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2-dependent+infiltrating+macrophages+promote+angiogenesis+in+progressive+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+quantitative+measures+describing+micromorphology+and+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Pathol%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization.</a> Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).</li>
<li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci.Methods%22%5BJournal%5D)">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).</li>
<li>Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microCT-FMT+imaging+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis.</a> J.Vis.Exp. (100), (2015).</li>
<li>Jing, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiomorphometric+quantitative+analysis+of+vasculature+utilizing+micro-computed+tomography+and+vessel+perfusion+in+the+murine+mandible%5BTitle%5D)+AND+%22Craniomaxillofac.Trauma+Reconstr%22%5BJournal%5D)">Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible.</a> Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).</li>
<li>Melloul, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+magnetic+resonance+imaging%3A+an+efficient+tool+to+assess+liver+volume+and+intrahepatic+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy.</a> J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).</li>
<li>Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+histological+whole+slide+images+guided+by+vessel+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.Pathol.Inform%22%5BJournal%5D)">Registration of histological whole slide images guided by vessel structures.</a> J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).</li>
<li>Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vasculature+for+liver+surgical+planning%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.Med.Imaging%22%5BJournal%5D)">Analysis of vasculature for liver surgical planning.</a> IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).</li>
<li>Shergill, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+of+VEGF-+and+NO-dependent+angiogenesis+does+not+impair+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Regul.Integr.Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration.</a> Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).</li>
<li>Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide+2+increases+efficacy+of+distraction+enterogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis.</a> J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+and+imaging+techniques+to+study+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration.</a> Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).</li>
<li>Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Contrasterende de vasculaire boom door siliconen injectie en μCT scanning is geïntroduceerd in tumor modellen en neurologische ziekte modellen vaak naar de angiogene progressie 5,7,8,10 bestuderen. Verbeteringen in de methodologie van siliconen injectie werden gemaakt in de huidige studie voor het visualiseren en kwantificeren van vasculaire groei na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen. Er zijn een aantal kritische stappen aandacht nodig om goede perfusie kwaliteit. Allereerst w...

Leverregeneratie wordt vaak bepaald door de toename van de lever gewicht en volume en door beoordeling van de hepatocyt proliferatiesnelheid 16. Echter, wordt de lever regeneratie niet alleen inducerende parenchymale regeneratie, maar ook vasculaire regeneratie 6. Daarom moet de groei van vasculaire nader worden onderzocht met betrekking tot zijn rol in de progressie van leverregeneratie. Visualisatie van de lever vasculaire systeem is cruciaal voor het bevorderen van ons begrip van vasculaire regeneratie. Talrijke indirecte methoden ontwikkeld om de onderliggende moleculaire mechanismen van hepatische regeneratie vasculaire onderzoeken. Traditioneel detectie van cytokinen (vasculaire endotheliale groeifactor, VEGF) 14, chemokinen en hun receptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 zijn de steunpilaar voor het bestuderen van vasculaire regeneratie geweest. Echter, een 3D-model, met kwantitatieve analyse van de vasculatuur kritische anatomische toevoegenaan een beter begrip van de belangrijke relatie tussen parenchymale en vasculaire regeneratie krijgen. Om de lever vasculaire systeem, dat vereist contrasterende het vasculaire bomen te visualiseren, werden muizen geïnjecteerd met een radiopake siliconenrubber contrastmiddel direct in de portal of leverinsufficiëntie veneuze vasculaire boom. Na polymerisatie van de silicone en uitname van het orgaan, werden de lever monsters onderworpen aan μCT scannen met een CT-scanner. De scans resulteerde in voxel afbeelding representaties van de siliconen-injectie specimens 9. Voor kwaliteitscontrole, werd het vasculaire systeem voor het eerst gevisualiseerd in 3D met behulp van preklinische software. Segmentatie werd uitgevoerd door een drempel tussen het zachte weefsel intensiteit en de intensiteit vat. Het verkregen masker vat werd zichtbaar gemaakt met oppervlak rendering. De software werd ook rekening handmatig bepalen van twee parameters van Vascular groei: maximale scheepslengte en radius. Een preklinische software werd vervolgens gebruikt voor 3D-reconstructie van vasculaire bomen en nacalculatie van de toe- of afvoer van vasculaire gebieden 13. Daarnaast is deze software automatisch bepaald aantal parameters van vasculaire groei, zoals de totale lengte van alle zichtbare vasculaire structuren ook bekend als de totale ribbe of totale verblijf. De siliconen perfusie procedure werd uitgevoerd bij naïeve muizen en in muizen die onderging 70% gedeeltelijke hepatectomie (PH). Levers werden verzameld op verschillende observatie tijdstippen na resectie voor het analyseren van vasculaire en parenchymale leverregeneratie met behulp van de eerder genoemde visualisatie en kwantificering techniek. De hoofddoelen van deze film zijn: (1) tonen de delicate injectie-techniek vereist om optimale contrasterende en (2) tonen de mogelijke voordelen verkregen fr verwezenlijkenOM een gedetailleerde analyse van de resulterende monster met behulp van μCT en histologische seriecoupes. Na het bekijken van deze film wordt de lezer een beter begrip van hoe siliconeverbinding injecteren in een specifieke vaatstelsel en het nut en de toepasbaarheid van de techniek hebben.

<table><tbody><tr><td>PERFUSOR&reg; VI</td><td>B.BRAUN</td><td>87 222/0</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus&reg;-akku</td><td>Hirschmann</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>micro scissors</td><td>Fine Science Tools (F&middot;S&middot;L)</td><td>No. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>Fine Science Tools (F&middot;S&middot;L)</td><td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Micro clamps applicator</td><td>Fine Science Tools (F&middot;S&middot;L)</td><td>No. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Straight micro forceps</td><td>Fine Science Tools (F&middot;S&middot;L)</td><td>No. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Curved micro forceps</td><td>Fine Science Tools (F&middot;S&middot;L)</td><td>No. 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>needle-holder</td><td>Fine Science Tools (F&middot;S&middot;L)</td><td>No. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>B.Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe</td><td>B.Braun</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>extension and connection lines</td><td>B.Braun</td><td>4256000</td><td>30 cm, inner &oslash; 1.2 mm</td></tr><tr><td>6-0 silk (Perma-Hand Seide)</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8711H</td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; MV diluent</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; MV - 120</td><td>FLOW TECH, INC</td><td>MV - 120 (blue)</td><td></td></tr><tr><td>MV curing agent</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin 2500 I.E./5 ml</td><td>Rotexmedica</td><td>ETI3L318-15</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td>E15117/D DE</td><td></td></tr><tr><td>Imalytics Preclinical software</td><td>Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaVision</td><td>Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0-HT&nbsp;Digital slide scanner</td><td>Hamamatsu Electronic Press, Japan&nbsp;</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>Tomoscope Duo CT&nbsp;</td><td>CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany</td><td>TomoScope&reg;&nbsp;Synergy</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van vasculaire en parenchymale regeneratie na 70% gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Een gemodificeerde silicone injectieprocedure werd gebruikt voor visualisatie van de lever vaatstelsel. Deze bestond uit het in vivo injectie van de silicone verbinding, via een katheter 26 G, in het portaal of de vena hepatica. Na silicone injectie werden organen geëxplanteerd en voorbereid voor ex-vivo micro-CT (μCT) scannen. De siliconen injectie procedure is technisch uitdagend. Het bereiken van een succesvol resultaat vergt veel microchirurgische ervaring van de chirurg. Een van de uitdagingen van deze procedure houdt de bepaling van de adequate perfusiesnelheid de siliconenverbinding. De perfusiesnelheid van de silicone verbinding moet worden gedefinieerd op basis van de hemodynamische van het vaatstelsel van belang. Ongepast perfusie tarief kan leiden tot een onvolledige perfusie, kunstmatige dilatatie en scheuren van vasculaire bomen. De 3D reconstructie van het vasculaire systeem is gebaseerd op CT-scans en werd bereikt met behulppreklinische software zoals HepaVision. De kwaliteit van de gereconstrueerde vasculaire boom is direct gerelateerd aan de kwaliteit van siliconen perfusie. Vervolgens berekende vasculaire parameters voor vasculaire groei, zoals vasculaire totale volume werd berekend op basis van de vasculaire reconstructies. Contrasterende de vasculaire boom met siliconen toegestaan ​​voor verdere histologische work-up van het monster na μCT scannen. Het monster kan worden onderworpen aan seriële snijden, histologische analyse en objectglaasje scannen en daarna 3D reconstructie van het vasculaire bomen op basis van histologische afbeeldingen. Dit is een voorwaarde voor de detectie van moleculaire gebeurtenissen en hun verdeling met betrekking tot het vaatstelsel. Deze gemodificeerde siliconen injectieprocedure kan ook worden gebruikt voor het visualiseren en reconstrueren de vasculaire systemen van andere organen. Deze techniek heeft het potentieel uitgebreid worden toegepast op studies over vasculaire anatomie en groei van diverse dierlijke eenziektemodellen nd.

kwaliteitscriteria De kwaliteit van siliconen injectie kan worden beoordeeld met het blote oog tijdens de procedure. De kleine bloedvaten op het oppervlak van de lever te vullen geleidelijk aan met de blauwe verbinding. Als de normale vasculaire structuur werd waargenomen op het oppervlak lever, de siliconen rubber injectie kwaliteit was goed. Wanneer de perfusie volume onvoldoende was, werden de kleine bloedv...

Hulpmiddelen die worden gebruikt voor het visualiseren van vasculaire regeneratie vereisen methoden voor het contrasteren van de vasculaire bomen. Deze film toonde een delicate injectietechniek die werd gebruikt om een optimaal contrast van de vasculaire bomen te bereiken en illustreerde de potentiële voordelen die resulteren uit een gedetailleerde analyse van het resulterende specimen met behulp van µCT en histologische seriële secties.

Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Visualisatie van vasculaire en parenchymale regeneratie na 70% partiële hepatectomie bij normale muizen. Traditioneel wordt leverregeneratie beoordeeld door de toename van het levergewicht en -volume te meten, evenals door de bepaling van de proliferatiesnelheid van hepatocyten. Tegenwoordig zijn wij geïnteresseerd in vasculaire leverregeneratie bij muizen en willen we vasculaire groei visualiseren en kwantificeren.Hiermee stellen we de workflow vast voor het in beeld brengen van vasculaire regeneratie. De workflow bestaat uit vier stappen: het contrasteren van de vaatboom, het verkrijgen van CT-scans, 3D-reconstructie en de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van de resulterende beelden. De workflow begint met het contrasteren van de vaatboom.Eerst leggen we de lever bloot, hetzij een normale of een geresecteerde, waarna we het polymeriserende silicone contrastmiddel injecteren in respectievelijk de poortader of de leverader, afhankelijk van het vasculair systeem waarin we geïnteresseerd zijn. Vervolgens worden de geëxplanteerde levers gescand met een MicroCT. Na het scannen voeren we een 3D vasculaire reconstructie uit met behulp van de preklinische software van Imalytics.Als de technische kwaliteit van de resulterende beelden voldoende is, kan 3D-reconstructie worden uitgevoerd met HepaVision. Dit programma wordt in klinieken gebruikt voor de planning van hepatobiliaire chirurgie. Naast de 3D-visualisatie van de vasculaire boom maakt dit programma de visualisatie en berekening van het levervolume mogelijk, zowel van de totale lever als van elke lob, op basis van de aanvoerende en afvoerende vaten.Na de reconstructie kunnen we met behulp van computationele technieken aanvullende parameters bepalen die indicatief zijn voor vasculaire groei, zoals de lengte en diameter van een specifiek vat. Dit maakt een kwantitatieve beschrijving van de vasculaire groei mogelijk. Aan de andere kant kunnen met formaline gefixeerde Microfil-monsters in seriesecties worden gesneden.De seriesneden kunnen worden gekleurd en gedigitaliseerd met een whole slide scanner. Na rigide en elastische registratie van de seriesneden kunnen 3D-vasculaire bomen van zowel het portaalveen- als het hepatische veneuze systeem worden gereconstrueerd. In een toekomstige stap willen we de ruimtelijke distributie van moleculaire gebeurtenissen onderzoeken.Een voorbeeld van een moleculaire gebeurtenis van belang bij hepatische regeneratie is de verschijning van de proliferatiemarker Ki-67 in hepatocytkernen en de ruimtelijke distributie daarvan in de in 3D gereconstrueerde vaatbomen. Vervolgens geven we een gedetailleerde introductie over het uitvoeren van de Microfil-injectie. Het voorbereiden van de reagentia.Voor het Microfil-mengsel hebben we MV-verdunner, MV-compound (in ons geval de blauwe MV-120) en een uithardingsmiddel nodig. Daarnaast hebben we pipetten, een buisje en een pipetteerder nodig. Bereid 2 mL MV-120 voor in één buisje van 5 mL.Verdun het vervolgens door drie milliliter MV-verdunningsvloeistof toe te voegen. Meng deze door voorzichtig te schudden. Voor de heparine-zoutoplossing voegt u 1 milliliter heparine toe aan 10 milliliter zoutoplossing.Het voorbereiden van de operatietafel. Ten eerste is een microscoop nodig, ten tweede is een set verbruiksartikelen vereist. 6-0 zijden en 6-0 polypropyleen hechtdraden, spuiten van vijf milliliter en één milliliter, naalden van 30 gauge en 21 gauge, een verlengbuis voor het verbinden van de spuit en de katheter, een 26 gauge katheter met naaldinbrenger, wattenstaafjes en gaas.Ten derde zijn chirurgische instrumenten nodig. Micro-instrumenten, klemmen en een elektrische coagulator. Ten vierde is een perfusiepomp nodig.Het dier voorbereiden. Plaats de muis in de inductiekamer voor anesthesie en anestheseer de muis met 2% isofluraan en 0,3 milliliter per minuut zuurstof. Fixeer de geanestheseerde muis op de operatietafel met behulp van tapes, terwijl er een continue inhalatie van 2% isofluraan en 0,3 milliliter per minuut zuurstof plaatsvindt.Microfil-injectie, portaal veneus systeem. Maak een transversale incisie in de abdomen met een schaar voor de huidlaag en een elektrische coagulator voor de spierlaag. Verplaats de darmen naar de linkerzijde met wattenstaafjes en dek de darmen af met met zoutoplossing verzadigd gaas.Dissekeer de vena portae onder de microscoop. Plaats een 6-0 zijden hechtdraad onder de extrahepatische vena portae op een afstand van ongeveer één millimeter van de bifurcatie. Knoop deze losjes vast voor later gebruik.Injecteer de heparine-zoutoplossing via een peniele vene voor systemische heparinisatie gedurende vijf minuten. Deze animatie demonstreert de procedure voor de catheterplaatsing. Plaats eerst de 6-0 zijden hechting onder de extrahepatische poortader, voer vervolgens de 26 gauge catheter in de poortader in en fixeer deze met een klem.Ligeer de vooraf geplaatste hechting om de katheter te fixeren en de bloedstroom vanuit de miltvene en de mesenteriale vene te blokkeren. Hier demonstreren we de chirurgische procedure. Voer de 26 gauge katheter met naald in.Schuif de katheter verder in en trek tegelijkertijd de naald langzaam naar buiten. Fixeer de katheter met een klem. Vul de katheter volledig met heparine-zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen.Verbind de extensiebuis met de katheter en bevestig deze stevig. Zet de perfusiepomp aan. Start de perfusie met heparine-zoutoplossing met een stroomsnelheid van 0.4 milliliter per minuut.Observeer dat de rechterkwabben direct na de perfusie bleek worden. Spoel de lever met zoutoplossing om deze gedurende de gehele perfusieprocedure vochtig te houden. Euthanaseer de muis door exsanguinatie via perfusie onder anesthesie.Zet de heparineperfusie enkele minuten voort totdat de gehele lever bleek wordt. Voeg vóór de Microfil-perfusie 0,1 milliliter uithardingsmiddel toe aan het bereide Microfil-mengsel om de polymerisatieprocedure te versnellen. Laad het Microfil-mengsel in een spuit van vijf milliliter en in de verlengbuis.Verwijder de luchtbellen door de heparine-zoutoplossing in de katheter te injecteren, zoals eerder gedaan. Verbind de slang met de katheter en bevestig deze stevig. Start de Microfil-injectie met een stroomsnelheid van 0.2 milliliter per minuut gedurende ongeveer één tot twee minuten.Observeer hoe het blauwe middel zich langzaam verspreidt in de vertakkingen van de poortader. Stop de perfusie wanneer de blauwe vaatstructuur op het oppervlak van elke leverkwab verschijnt, zoals aangegeven door een rode cirkel. Laat de lever ten minste 15 minuten rusten voor de polymerisatie van de Microfil-verbinding.Microfil-injectie, hepatisch veneus systeem. De procedure volgt in essentie dezelfde stappen als de injectie in het portaal veneus systeem. Plaats een 6-0 zijden hechting onder de extrahepatische vena portae op een afstand van ongeveer één millimeter van de bifurcatie.Plaats vervolgens een katheter in de vena portae en fixeer deze met een klem. Plaats een tweede katheter in de vena cava inferior en fixeer deze eveneens met een klem. Ligeer de vooraf geplaatste hechting om de katheter te fixeren en de bloedstroom vanuit de vena lienalis en de vena mesenterica te blokkeren.Plaats een klem op de suprahepatische vena cava inferior om de uitstroom van de lever te blokkeren. Ligeer de zijtakken van de vena cava inferior, inclusief beide nierenvenen en het distale uiteinde van de vena cava inferior. Spoel de lever door met een heparine-zoutoplossing via katheter één.Perfuseer het hepatische veneuze systeem met Microfil-verbinding via katheter twee. Resultaten, Micro CT-reconstructie. We hebben 3D-vasculaire reconstructies verkregen met Imalytics-preklinische software na Micro CT-scanning.Vasculaire regeneratie in zowel de portale als de hepatische veneuze systemen manifesteerde zich als verlenging en verbreding van de belangrijkste vasculaire structuren in combinatie met vertakkingen van kleinere vaten. Op de tweede postoperatieve dag verlengden de vasculaire bomen van de resterende lobben zich. Tegen de zevende postoperatieve dag werden extra kleine vertakkingen van dezelfde hoofdportale vene en de hepatische vene zichtbaar.Resultaten, 3D kleurgecodeerde reconstructie van de hepatische vasculaire boom en de daarvan afhankelijke hepatische territoria. Elke leverkwab was eenvoudig te visualiseren in alle drie de dimensies na kleurgecodeerde reconstructie door HepaVision. Zoals aangegeven in de tabel werden de hepatische volumes van de totale lever en elke kwab bepaald, zoals hier getoond voor het hepatische veneuze systeem van een normale lever.Resultaten, seriesneden en reconstructie. Aan de andere kant werd het in formaline gefixeerde Microfil-monster onderworpen aan seriesneden. De gekleurde seriesneden werden gedigitaliseerd met behulp van een whole-slide-scanner en gebruikt voor de reconstructie van de vasculaire boom van beide systemen.Dit zijn dwarsdoorsneden van een stapel seriële coupes van een muizenlever vóór en na rigide en elastische registratie. Na computergestuurde registratie kunnen de portaalveneuze en hepatische veneuze systemen worden gereconstrueerd in één enkel 3D-model. Deze handmatig en computertechnisch tijdrovende stap behoeft verdere optimalisatie.De volgende stap, namelijk de visualisatie van de ruimtelijke distributie van moleculaire gebeurtenissen ten opzichte van de vasculaire bomen, is momenteel in ontwikkeling. Deze stap kan worden gezien als een fusie van Micro CT-informatie afgeleid van de gecontrasteerde vasculaire boom met histologische informatie, of als een 3D-visualisatie van puur histologische informatie. In dat geval zou de Micro CT-informatie dienen als kwaliteitscontrole voor de veeleisende, op histologie gebaseerde 3D-reconstructie.Zodra dit is bereikt, beschikken we over een instrument om leverregeneratie beter te kunnen onderzoeken. In het bijzonder de ruimtelijke verdeling van moleculaire gebeurtenissen en het hepatische parenchym met betrekking tot vasculaire regeneratie.

visualization-vascular-parenchymal-regeneration-after-70-partial

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We hebben een protocol voor het uitvoeren van gedeeltelijke hepatectomy (PHx) en cel transplantatie via milt in KNIPOOG beschreven. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/j) muizen. In dit protocol wordt een incisie gemaakt bloot en resect de linker kwab van de lever, gevolgd door een andere snede voor intrasplenic transplantatie van cellen.

Intrasplenic transplantatie van hepatocyten na gedeeltelijke Hepatectomy in KNIPOOG. SCID muizen

Hier presenteren we een nieuwe methode voor gedeeltelijke resectie van de linker hepatische kwab bij neonatale (dag 0) muizen. Dit nieuwe protocol is geschikt voor de studie van acute lever schade en letsel reactie in de neonatale instelling.

Gedeeltelijke lobulair Hepatectomy: Een chirurgische Model voor morfologische lever regeneratie

We stellen een nieuwe chirurgische techniek voor een in vivo één lever kwab perfusie model in rat als een voorwaarde voor de verdere studie van in vivo gedeeltelijke lever techniek in de toekomst.

Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

In dit protocol bespreken we de implementatie van een model van succesvolle orthotope levertransplantatie (OLT) bij muizen. Daarnaast worden ook adjuvantia besproken om de doorgankelijkheid van het transplantaat verder te analyseren na succesvolle OLT in een muis, met name met behulp van microcomputertomografie (microCT)-scans.

Succesvolle orthotope levertransplantatie bij muizen met behulp van microcomputertomografie-angiografie

Het is aangetoond dat het associëren van leverpartitie en poortaderligatie voor gefaseerde hepatectomie (ALPPS) resulteert in opmerkelijke leverregeneratie na enkele weken na de operatie in de eerste fase. Diermodellen die ALPPS hebben ondergaan, zijn ontwikkeld om het potentiële leverregeneratievermogen te onderzoeken en gunstige klinische resultaten te bereiken.

Een muismodel van de associërende leverpartitie en poortaderligatie voor gefaseerde hepatectomieprocedure met behulp van microscopie

Dit protocol biedt technische informatie voor vatreconstructie met behulp van de manchettechniek bij orthotope levertransplantatie bij muizen.

Vasculaire reconstructie met de manchettechniek bij orthotope levertransplantatie bij muizen

Organoïden die worden gegenereerd uit tumoren van patiënten worden orthotopisch in de lever van de muis geïnjecteerd. De resectie van niet-tumorachtig leverweefsel leidt tot een regeneratieve omgeving in het leverweefsel waar de tumor zich bevindt.

Een van patiënten afgeleide organoïde xenotransplantaatmodel voor hepatocellulaire kanker om de impact van leverregeneratie op tumorgroei te onderzoeken

Het muismodel van gedeeltelijke 2/3 (66%) hepatectomie is goed beschreven in de literatuur, maar meer uitgebreide hepatectomieën die het klein-voor-grootte-syndroom na levertransplantatie nabootsen, zijn zelden gebruikt. We beschrijven een uitgebreide hepatectomieprocedure van 78% in een muismodel die resulteert in ongeveer 50% postoperatieve letaliteit bij gezonde muizen.

Uitgebreide hepatectomie van 78% in een chirurgisch muismodel

Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om de morfologie van leverstellate cellen in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. Deze benadering combineert fluorescerende labeling van fibroblasten met behulp van muisgenetica, in situ leverperfusie-gebaseerde weefselvoorbereiding en een aangepaste iDISCO-weefselreinigingsmethode om optische transparantie te bereiken.

Mapping van de morfologie van hepatische stellate cellen in muismodellen van leverfibrose

Verken een workflow voor het visualiseren van vasculaire regeneratie in muizen na partiële hepatectomie met behulp van µCT en 3D-reconstructie. Deze methode biedt inzicht in vasculaire groei en leverregeneratie.

Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

Meer video's verkennen