Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

Visualisatie van vasculaire en parenchymale regeneratie na 70% gedeeltelijke hepatectomia bij normale muizen. Traditioneel wordt leverregeneratie beoordeeld door het meten van de toename van levergewicht en -volume, evenals door bepaling van de proliferatiesnelheid van hepatocyten. Tegenwoordig zijn we geïnteresseerd in vasculaire leverregeneratie bij muizen en willen we vasculaire groei visualiseren en kwantificeren.

Daarom stellen we de workflow voor beeldvorming van vasculaire regeneratie vast. De workflow bestaat uit vier stappen: contrastering van de vaatboom, verwerving van CT-scans, 3D-reconstructie en kwantitatieve en kwalitatieve analyse van de resulterende beelden. De workflow begint met het contrasteren van de vaatboom.

Eerst ontbloten we de lever, hetzij een normale of een gereseceerde, vervolgens injecteren we de polymeriserende silicone contrastverbinding in ofwel de poortader of de leverader, afhankelijk van het vasculaire systeem van belang. Vervolgens worden de explantate lever gescand in een MicroCT. Na het scannen voeren we een 3D vasculaire reconstructie uit met behulp van Imalytics preclinical software.

Als de technische kwaliteit van de resulterende beelden goed genoeg is, kan 3D reconstructie worden uitgevoerd met behulp van HepaVision. Dit programma wordt in klinieken gebruikt voor het plannen van hepatobiliaire chirurgie. Naast de 3D visualisatie van de vaatboom, staat dit programma visualisatie en berekening van het levervolume toe, van de totale lever en elke lob, op basis van de toevoerende en afvoerende vaten.

Na reconstructie kunnen we aanvullende parameters bepalen die indicatief zijn voor vasculaire groei, zoals de lengte en diameter van een specifiek vat, met behulp van computationele technieken. Dit zal een kwantitatieve beschrijving van vasculaire groei mogelijk maken. Aan de andere kant kunnen formaline gefixeerde Microfil monsters in seriële secties worden gesneden.

De seriële secties kunnen worden gekleurd en gedigitaliseerd met behulp van een whole slide scanner. Na rigide en elastische registratie van seriële secties kunnen 3D vasculaire bomen van zowel portaalveneuze als hepatische veneuze systemen worden gereconstrueerd. In een toekomstige stap willen we de ruimtelijke verdeling van moleculaire gebeurtenissen verkennen.

Een voorbeeld van een moleculaire gebeurtenis van belang in hepatische regeneratie is het verschijnen van de proliferatiemarker Ki-67 in hepatocytenkernen en de ruimtelijke verdeling ervan in de 3D gereconstrueerde vasculaire bomen. Vervolgens geven we een gedetailleerde introductie van hoe de Microfil injectie wordt uitgevoerd. Het voorbereiden van de reagentia.

Voor het Microfil compound mengsel hebben we MV diluent, MV compound, in ons geval de blauwe MV-120, en het uithardingsmiddel nodig. We hebben ook pipetten, buisje en een pipettor nodig. Bereid twee milliliter MV-120 in één vijf-milliliter buisje.

Verdun het door er drie milliliter MV diluent aan toe te voegen. Meng ze voorzichtig door schudden. Voor heparine zoutoplossing, voeg 1 milliliter heparine toe aan 10 milliliter zoutoplossing.

Voorbereiden van de operatietafel. Eerst hebben we een microscoop nodig, ten tweede is een set verbruiksartikelen nodig. 6-0 zijden en 6-0 polypropyleen hechtingen, vijf milliliter en één milliliter spuiten, 30 gauge en 21 gauge naalden, verlengbuis voor het verbinden van spuit en katheter, 26 gauge katheter met naaldinvoeg, wattenstaafjes en gaas.

Ten derde zijn chirurgische instrumenten nodig. Micro instrumenten, klemmen en elektrische coagulator. Ten vierde is een perfusiepomp nodig.

Voorbereiden van het dier. Plaats de muis in de anesthesie-inductiekamer en anesthesieer de muis met 2%isofluraan en 0,3 milliliter per minuut zuurstof. Bevestig de anesthesieerde muis op de operatietafel met behulp van tapes, met continue inhalatie van 2%isofluraan en 0,3 milliliter per minuut zuurstof.

Microfil injectie, portaal veneus systeem. Maak een transversale incisie op de buik met behulp van een schaar voor de huidlaag en een elektrische coagulator voor de spierlaag. Verplaats de darmen naar de linkerkant met behulp van wattenstaafjes en bedek de darmen met in zoutoplossing gedrenkt gaas.

Dissecteer de poortader onder de microscoop. Plaats een 6-0 zijden hechting onder de extrahepatische poortader op ongeveer één millimeter afstand van de bifurcatie. Bind deze losjes voor later gebruik.

Injecteer de heparine zoutoplossing via een penisvene voor systemische heparinisatie gedurende vijf minuten. Deze animatie zal de procedure van katheter inbrenging demonstreren. Plaats eerst de 6-0 zijden hechting onder de extrahepatische poortader, voer vervolgens de 26 gauge katheter in de poortader in en fixeer deze met behulp van een klem.

Ligatuur de voorgeplaatste hechting voor het fixeren van de katheter en het blokkeren van de bloedstroom van de miltvene en de mesenteriale vene. Hier zullen we de chirurgische procedure demonstreren. Voer de 26 gauge katheter met naald in.

Voer de katheter verder in en verplaats de naald langzaam tegelijkertijd. Fixeer de katheter met behulp van een klem. Vul de katheter volledig met heparine zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen.

Verbind de verlengbuis met de katheter en fixeer ze stevig. Schakel de perfusiepomp in. Start heparine zoutoplossing perfusie met een stroomsnelheid van 0,4 milliliter per minuut.

Observeer de rechter lobben die onmiddellijk na perfusie bleek worden. Spoel de lever met zoutoplossing om deze gedurende de hele perfusieprocedure vochtig te houden. Euthanasie de muis door exsanguinatie via perfusie onder anesthesie.

Vervolg heparine perfusie gedurende enkele minuten totdat de hele lever bleek wordt. Voeg voor Microfil perfusie 0,1 milliliter uithardingsmiddel toe aan het bereide Microfil compound om het polymerisatieproces te versnellen. Laad Microfil compound in een vijf-milliliter spuit en verlengbuis.

Verwijder de luchtbellen door de heparine zoutoplossing in de katheter te injecteren, hetzelfde als eerder. Verbind de buis met de katheter en fixeer deze stevig. Start Microfil injectie met een stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut gedurende ongeveer een tot twee minuten.

Observeer het blauwe middel dat zich langzaam verspreidt in de takken van de