Name: Murine Hind Limb Long Bone Dissection en Bone Marrow Isolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Leer een snelle en gestandaardiseerde methode voor dissectie van lange botten en isolatie van beenmerg bij muizen met centrifugatie. Deze techniek behoudt de integriteit van het weefsel voor histologische analyse en celkweek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NCI-subsidienummers U54CA143803, CA163124, CA093900 en CA143055 aan K.J.P. De auteurs danken de huidige en voormalige leden van het Weilbaecher-lab, in het bijzonder Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla en Hongju Deng, en leden van het Brady Urological Institute, in het bijzonder leden van het Pienta-laboratorium voor kritische lezing van het manuscript.

Alle dierlijke werk werd in overeenstemming met de in de Guide geschetst voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health aanbevelingen goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Hind Limb Long Bone Dissection <ol><li> Euthanaseren de muis in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. </li><li> Plaats de muis in een liggende positie en bevestig door pinning alle vier de poten door de muis voetzooltjes onder het enkelgewricht. </li><li> Spuit de muis met 70% ethanol, goed dousing de benen. </li><li> Maak een kleine incisie aan de rechterkant van de middellijn in de onderbuik, net boven de heup. </li><li> Verleng de incisie langs de been en langs het enkelgewricht. </li><li> Trek de huid en snijd de quadriceps spieren verankerd aan proximaal uiteinde van het femur op de voorste zijde van het dijbeen bloot te leggen en pin uit het been, het plaatsen van de pen in een hoek van 45 graden van het bord. </li><li> Met het blade van de schaar tegen de dorsale zijde van het dijbeen, snijd de hamstrings van het kniegewricht. </li><li> Trek de huid en de hamstrings verankerd aan het proximale einde van het dijbeen naar de achterste zijde van het dijbeen bloot te leggen en pin uit het been, het plaatsen van de pen in een hoek van 45 graden van het bord. </li><li> Met de tang, houdt het distale uiteinde van het femur, net boven het kniegewricht. Leid de bladen van de schaar op beide zijden van de femorale schacht naar het heupgewricht, zorg dat in de femur zelf te snijden. </li><li> Na het bereiken van de heupkop, aangegeven door de schaar iets openen, draai de schaar met het bovenblad van de schaar bewegen direct over de heupkop naar het dijbeen ontwrichten, en let op het bot onder de heupkop niet te breken. </li><li> Pak de bovenkant van de femorale as met de tang, snijd het zachte weefsel weg van de femurkop om deze uit het acetabulum. </li><li> Trek de hele been bot, met inbegripfemur, knie en scheenbeen, en weg van het lichaam, zorgvuldig wegsnijden van het bindweefsel en spieren verbinden het been aan de huid. </li><li> Soms gedwongen het enkelgewricht en weer gebruik maken van de schaar in een draaiende beweging aan het scheenbeen ontwrichten. </li><li> Grijpen de distale einde van het scheenbeen, zorg ervoor dat u de pezen verbreken, trekt u de tibia omhoog en weg van het lichaam en het prikbord. </li><li> Snijd de resterende bindweefsel vastmaken van het pijpbeen de muis bij de knie. </li><li> Verwijder extra spier- of bindweefsel bevestigd aan het femur en de tibia. </li><li> Voor alle toepassingen die het been nodig hebben om intact (histologie, histomorfometrie, biomechanische testen, enz.) Blijven doorgaan met standaard in-house protocollen (zoals in 4-7). Beenmerg te isoleren, gaat u verder met deel 2. </li></ol> 2. Lange Bone Voorbereiding van Bone Marrow Isolation <ol><li> Met behulp van de tang, pakt het dijbeen met de knieschijf afgekeerd eennd het proximale einde (heupkop) naar beneden. </li><li> Soms gedwongen het kniegewricht en gebruik de schaar in een draaiende beweging van de tibia en femur ontwrichten. </li><li> Snijd elke bindweefsel houdt het bovenbeen en onderbeen samen. </li><li> Met behulp van de tang, pakt het dijbeen met de voorste afgekeerde zijde en het proximale uiteinde (heupkop end) naar beneden. </li><li> Leid de schaar de femurschacht aan de condylen. </li><li> Voorzichtig draai de schaar heen en weer naar de knobbels, de knieschijf te verwijderen, en de epifyse naar de metafyse bloot te leggen. </li><li> Verwijder extra spier- of bindweefsel bevestigd aan het femur via forceps, scharen en Kimwipes. </li><li> Met behulp van de tang, pak de tibia met de voorste afgekeerde zijde en het distale einde (enkel end) naar beneden. </li><li> Als het scheenbeen epiphysis intact is, begeleiden de schaar de tibia schacht naar de condylen. </li><li> Voorzichtig draai de schaar heen en weer om de knobbels te verwijderen en epifyse naar de metaph bloottion. </li><li> Verwijder extra spier- of bindweefsel aan de tibia behulp forceps, scharen en Kimwipes. </li></ol> 3. Bone Marrow Isolation <ol><li> Duw een 18 G naald door de bodem van een 0,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Plaats de lange botten (maximaal 2 scheen- en 2 tibiae) in de buis, knie-end naar beneden eind naar beneden en sluit het deksel. </li><li> Nest de 0,5 ml microcentrifugebuis in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de buizen bij geneste ≥10,000 xg in een microcentrifuge 15 seconden. </li><li> Controleer of het beenmerg is gekomen uit de botten werden gesponnen door visuele inspectie. De botten moeten verschijnen wit en er moet een grote visuele pellet in de grotere buis. </li><li> Gooi de 0,5 ml microcentrifugebuis met de beenderen. </li><li> Suspendeer het beenmerg in geschikte oplossing (bijvoorbeeld PBS, kweekmedia FACS buffer) en vult experimentele protocol (DNA, RNA of eiwit isolatie,FACS-analyse, of primaire celkweek). </li></ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We presenteren een eenvoudige en efficiënte methode voor het verwijderen van achterste lange botten van muizen en de daaropvolgende isolatie van beenmerg. Deze methode behoudt de hoge structurele en cellulaire integriteit van de botten en het beenmerg en heeft een lage verwerkingstijd, waardoor de kans op door de gebruiker veroorzaakte breuk of botbeschadiging die downstream analyses kunnen beïnvloeden, wordt geminimaliseerd. Bovendien vereist de centrifugatiemethode voor het isoleren van beenmerg geen snijden van het bot om het beenmergruiimte of -vloeistof bloot te leggen om het beenmerg te spoelen, waardoor potentiële besmettingspunten worden verminderd. Bovendien is de centrifugetechniek relatief hoogdoorvoerig met minder hands-on tijd dan andere methoden, waardoor de verwerkingstijd wordt verkort.
Hoge variatie is inherent aan in vivo muisstudies vanwege de hoge fenotypische variatie tussen muizen. Om de onderzoeksimpact van dure en arbeidsintensieve muisstudies te maximaliseren, is het van cruciaal belang om technische experimentele fouten9,10 te minimaliseren. De tijd van dierenafslachting tot downstream analyse of weefselfixatie introduceert experimentele variatie die subtiele veranderingen kan overwinnen en grote verschillen tussen groepen kan verminderen. Daarom is snelle verwerking van monsters essentieel voor nauwkeurige gegevensanalyse. De hier beschreven technieken voor het dissecteren van lange botten en het isoleren van beenmerg zijn geoptimaliseerd voor snelle verwerking van dieren en monsters om technische variatie te verminderen.
Dit protocol kan breed worden toegepast op vele onderzoeksgebieden, inclusief onderzoek naar het botweefsel zelf of het ondervragen van de cellen van het beenmerg. Bovendien zal deze eenvoudige aanpak voor het dissecteren van lange botten onderzoekers op aanverwante gebieden in staat stellen om direct beenbijdragen te ondervragen om onze kennis van beenmergdisfunctie in anderszins onderbelichte pathologieën uit te breiden.

De studie van lange botten en de cellen van het beenmerg staat centraal in een groot aantal onderzoeksdisciplines, waaronder, maar niet beperkt tot, botbiologie, kankerbiologie, immunologie, hematologie en biomechanica. Het bot is een zeer dynamisch orgaan dat samen met het kraakbeen het skelet vormt om mechanische ondersteuning te bieden tegen belasting en bescherming van de inwendige organen. Bovendien zijn de minerale componenten van bot een opslagplaats voor de kritische signaalmoleculen calcium en fosfor, evenals andere factoren1. Ten slotte herbergen botten het beenmerg en bieden, samen met metabolisch actieve botvormende osteoblasten en botresorbering veroorzakende osteoclasten, de stamcelnich die nodig is voor het onderhoud van hematopoëtische en lymfoïde celpopulaties.
Bot en beenmerg worden aangetast bij veel aandoeningen, wat vaak leidt tot beenmergdisfunctie, ernstige botpijn en pathologische fracturen. Bot is een veelvoorkomende plaats voor metastase in veel solide tumoren, met name borstkanker en prostaatkanker, waarbij tumorcellen direct de beenmergniche aangaan om de vicieuze cirkel van botmetastase en verdringing van hematopoëtische stamcellen te initiëren2,3. Hematopoëtische maligniteiten, waaronder myeloom en leukemie, worden gekenmerkt door beenmergdisfunctie en regulering van gezond botremodellering1. Andere niet-maligne skeletaandoeningen zijn ook actieve onderzoeksgebieden, zoals artrose, osteoporose, scoliose en rachitis. Zelfs bij een anderszins gezond individu leidt biomechanisch falen in een bot tot een pijnlijke fractuur. Al deze aandoeningen vertegenwoordigen actieve onderzoeksgebieden met als doel nieuwe preventieve maatregelen en behandelingsregimes te identificeren om morbiditeit en mortaliteit te verminderen.
Om de veelvoud aan rollen van het bot en het beenmerg te onderzoeken, zowel onder fysiologische als pathologische omstandigheden, is het van cruciaal belang dat onderzoekers beschikken over een eenvoudige en efficiënte gestandaardiseerde methode voor het dissekeren van de lange muisbotten voor snelle verwerking van grote in vivo experimenten. Het hier beschreven dissectieprotocol is geschikt voor alle lange botanalyses, waaronder ex vivo beeldvorming, histologie, histomorfometrie en sterkteverificatie, onder anderen. Evenzo is een gestandaardiseerde beenmergisoleermethode met hoge beenmergcellenherstel en lage intergebruikersvariabiliteit belangrijk voor experimentele analyse zoals fluorescein-geactiveerde celsortering (FACS) of kwantitatieve PCR (qPCR) evenals downstream-toepassingen zoals primaire celcultuur van beenmergcellen.

<table><tbody><tr><td>Pinboard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16 G naald</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge buisje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Microcentrifuge buisje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine hind limb long bone dissection en bone marrow isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Onderzoek naar het bot en het beenmerg is van cruciaal belang in vele onderzoeksgebieden, waaronder fundamentele botbiologie, immunologie, hematologie, kankermetastase, biomechanica en stamcelbiologie. Ondanks het belang van het bot in gezonde en pathologische toestanden, is het echter een grotendeels onderbelicht orgaan vanwege een gebrek aan gespecialiseerde kennis van botdissectie en beenmergisolatie. Muizen zijn een veelgebruikt modelorganisme om effecten op bot en beenmerg te bestuderen, wat een gestandaardiseerde en efficiënte methode vereist voor de dissectie van lange botten en isolatie van beenmerg voor de verwerking van grote experimentele cohorten. We beschrijven een eenvoudige dissectieprocedure voor het verwijderen van het dijbeen en scheenbeen die geschikt is voor downstream toepassingen, inclusief maar niet beperkt tot histomorphologische analyse en sterktetesten. Daarnaast beschrijven we een snelle procedure voor de isolatie van beenmerg uit de lange botten via centrifugatie met beperkte handelingstijd, ideaal voor celsortering, primaire celcultuur of DNA-, RNA- en eiwitextractie. Het protocol is gestroomlijnd voor snelle verwerking van monsters om experimentele fouten te beperken en is gestandaardiseerd om gebruikersvariabiliteit te minimaliseren.

De hier beschreven protocol geoptimaliseerd voor snelle ontleding van de muis femur en tibia met minimale schade aan het botweefsel. Deze techniek is geschikt voor een aantal downstream analyses, waaronder biomechanica studies, histomorfometrie (Figuur 1 A - B) en histologie (figuur 1C) 4,7. De representatieve histomophometric micoCT 3D reconstructie (Figuur 1 A - B) toont aan dat zowel de poreuze bot en corticale mantel worden gesteld dat een accurate kwantificering van de gestandaardiseerde structurele parameters voor bothistomorfometrie, zoals trabeculaire aantal, dikte en afstand; volume bot; en corticale dikte, naast andere maatregelen 8. De vertegenwoordiger histologisch deel toont een H &amp; E gekleurde formaline gefixeerde en ontkalkt tibia (figuur 1C). De afbeelding toont de integriteit van zowel de verkalkte béén en cellulaire beenmerg voor histologische analyse. Het beenmerg isolatie procedure behoudt de steriliteit van het beenmerg ruimte, heeft een lage handling ter beperking van verontreiniging, en doet het snijden van de lange bot niet nodig, waardoor het verlies van beenmerg opbrengst verminderen. Het beenmerg is geschikt voor vele verdere toepassingen, waaronder flowcytometrie 5 en PCR-analyses. Bovendien kan deze werkwijze worden gebruikt om beenmerg te primaire celkweek van beenmergcellen, waaronder osteoclasten en osteoblasten (Figuur 2A - B) isoleren 4,6. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" /> Figuur 1. Histomorfometrische en histologische analyses van muis pijpbeen. Driedimensionale microCT reconstructie van een muis tibia toont (A) de buitenste corticale schil en (B </s<html> trong&gt;) trabeculair bot (schaal bar = 0,5 mm). (C) histologische H &amp; E kleuring van een ontkalkt en deelbaar tibia (4x). Afbeeldingen met dank aan Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" /> Figuur 2. Primaire Bone Marrow Cultuur van de Cel voor differentiatie van osteoclasten en osteoblasten. (A) TRAP kleuring voor meerkernige osteoclasten na 7 dagen in osteoclastogenic media (4x). (B) Alkaline fosfatase (paarse kleur) voor osteoblasten en alizarinerood (rode kleur) vlek voor mineralisatie na 21 dagen in osteogene media. Afbeeldingen met dank aan Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier presenteren we een protocol voor de dissectie van lange achterbeenbotten (dijbeenderen en scheenbeenderen) van de laboratoriummuis. We beschrijven verder een snelle techniek voor beenmergisolatie uit deze botten die centrifugatie gebruikt voor het verwijderen van beenmerg uit de beenmergholte.

Murine Hind Limb Long Bone Dissection en Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Het algemene doel van deze dissectie van lange beenderen en isolatie van beenmerg is om de lange beenderen snel en systematisch te verwijderen en het beenmerg te verzamelen voor verdere downstream-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de biologie van het beenmerg, kankermetastasen en immunologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het dissectieproces snel en gestandaardiseerd is en de procedure voor beenmergisolatie redelijk steriel is. Begin met het positioneren van de muis in rugligging.Zet vervolgens alle vier de voetzoolkussentjes onder het enkelgewricht vast en spray de muis met 70% ethanol, waarbij de poten grondig worden natgemaakt. Maak daarna een kleine incisie rechts van de middellijn in de onderbuik, net boven de heup, en breid de incisie uit over het been en voorbij het enkelgewricht. Trek de huid terug.Snijd vervolgens de quadricepsspier door die is verankerd aan het proximale uiteinde van het femur om de anterieure zijde van het dijbeen bloot te leggen, en spel de spier weg van het been met de speld in een hoek van 45 graden ten opzichte van de plank. Snijd met de schaar tegen de posterieure zijde van het femur de hamstrings los van het kniegewricht. Trek vervolgens de huid en de hamstringspieren die verankerd zijn aan het proximale uiteinde van het femur terug om de posterieure zijde van het bot bloot te leggen, en spel de hamstringspieren weg van het been door de speld in een hoek van 45 graden te plaatsen.Pak met de pincet het distale uiteinde van het femur net boven het kniegewricht vast. Leid vervolgens de schaarbladen aan weerszijden van de femurschacht richting het heupgewricht. Nadat de femurkop is bereikt, draait u de schaar en beweegt u het bovenste blad direct over de femurkop om het femur te luxeren.Pak nu de bovenkant van de femurschacht vast met de pincet en snijd het zachte weefsel weg van de femurkop om het dijbeen uit het acetabulum te bevrijden. Trek vervolgens het gehele been, inclusief het femur, de knie en de tibia, omhoog en weg van het lichaam, en snijd voorzichtig het bindweefsel en de spieren door die het been aan de huid bevestigen. Wanneer al het bindweefsel is verwijderd, overstrek dan het enkelgewricht en draai de schaar zoals zojuist gedemonstreerd om de tibia te luxeren.Pak het distale uiteinde van de tibia vast en trek de tibia omhoog en weg van het lichaam en het spijkerbord, waarbij u er zorg voor draagt de pezen niet door te snijden. Verwijder vervolgens alle resterende bindweefsel dat aan het lange bot bij de knie is gehecht, alsofmede elk aanvullend spier- of bindweefsel dat aan het femur en de tibia is verbonden. Om het lange bot voor te bereiden op mergisolatie, pakt u het femur vast met de patella naar buiten en de femurkop naar beneden gericht.Overstrek het kniegewricht en draai de schaar om de tibia uit het femur te luxeren. Verwijder vervolgens al het bindweefsel dat het femur en de tibia met elkaar verbindt. Pak daarna het femur vast met de anterieure zijde van u af en de femurkop naar beneden gericht, en geleid de schaar langs de femurschacht omhoog naar de condylen.Draai de schaar voorzichtig heen en weer om de condylen, de patella en de epifyse te verwijderen, zodat de metafyse bloot komt te liggen. Gebruik vervolgens de pincet, de schaar en Kimwipes om eventueel overgebleven spier- of bindweefsel dat aan het femur vastzit te verwijderen. Pak daarna de tibia vast, waarbij de anterieure zijde van u af is gericht en het enkeluiteinde naar beneden wijst.Als de tibiale epifyse intact is, worden de scharen langs de tibiaschacht naar de condylen geleid en vervolgens voorzichtig heen en weer gedraaid om de condylen en de epifyse te verwijderen, waardoor de tibiale metafyse wordt blootgelegd. Verwijder vervolgens alle resterende spier- of bindweefsels die aan de tibia vastzitten, zoals zojuist gedemonstreerd. Om het beenmerg te oogsten, wordt eerst een naald van 18 gauge door de bodem van een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter geduwd.Plaats vervolgens de lange beenderen met het knie-uiteinde naar beneden in de buis en sluit het deksel. Plaats de 0,5 milliliter microcentrifugebuis in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer de buizen in een microcentrifuge bij een kracht groter dan of gelijk aan 10 000 ×g gedurende 15 seconden. Controleer door middel van visuele inspectie of het beenmerg uit de beenderen is geslingerd.De botten moeten wit ogen en in de grotere buis moet een groot pellet zichtbaar zijn. Gooi vervolgens de botten in de 0,5 milliliter microcentrifugebuis weg en suspendeer het beenmerg in de juiste oplossing voor de gewenste downstream-analyse. Deze snelle dissectietechniek is geschikt voor diverse downstream-analyses, waaronder histomorfometrie en histologie.Zoals aangetoond door deze representatieve histomorfometrische micro-CT 3D-reconstructie, blijven zowel het spongieuze bot als de corticale schil behouden, wat een nauwkeurige kwantificering van de gestandaardiseerde structurele parameters voor bot-histomorfometrie mogelijk maakt. In deze representatieve histologische sectie van een met H en E gekleurd, in formaline gefixeerd en gedecalcificeerd tibia kan worden waargenomen dat de integriteit van zowel het gecalcificeerde bot als het cellulaire beenmerg voor histologische analyse behouden blijft. Bovendien is het met deze procedure geïsoleerde beenmerg geschikt voor vele downstream-applicaties, waaronder de primaire celcultuur van osteoclasten of osteoblasten.Zodra de techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in ongeveer zeven minuten worden voltooid, vanaf de dissectie van het pijpbeen tot de isolatie van het beenmerg. Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om de muis zodanig te positioneren dat de dissectie eenvoudig kan worden uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals FACS of andere processen voor individuele cellen, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden over veranderingen in de beenmergcelpopulaties.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u snel de lange beenderen van muizen kunt dissekeren en het beenmerg door middel van centrifugatie kunt isoleren.

murine-hind-limb-long-bone-dissection-and-bone-marrow-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

This video describes a detailed protocol to isolate fresh whole bone marrow from the mouse's hind limbs to investigate whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia.

Bone Marrow Harvest from Mouse Hind Limb

In this video, we demonstrate the isolation and culture of bone marrow stromal cells from the long bones of mice. The isolated adherent BMSCs can be used for further analysis.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

Dit protocol beschrijft een procedure voor seriële bemonstering van femur beenmerg (BM) zonder dat muizen hiervoor worden geofferd. Deze procedure vergemakkelijkt longitudinale studies van de samenstelling van beenmerg van muizen in de loop van de tijd en biedt seriële toegang tot cellen binnen het beenmerg voor ex vivo en transplantatiestudies.

Femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Het succes van single-cell/single-nuclei transcriptomics en multi-omics hangt grotendeels af van de kwaliteit van cellen/kernen. Daarom moet het isoleren van cellen/kernen uit weefsel en hun zuivering sterk gestandaardiseerd zijn. Dit protocol beschrijft de bereiding van kernen uit de hersenen en het beenmerg voor stroomafwaartse single-nuclei multioomanalyse.

Hoogwaardige voorbereiding van hersen- en beenmergkernen voor multioomtesten met één kern

Hier wordt een op fosfoflowcytometrie gebaseerde methode beschreven om de signalering stroomafwaarts van de mTORC1-, JAK/STAT5- en MAPK-routes te analyseren in acute menselijke myeloïde leukemiecellen die xenotransplanteerd zijn in muizen en verkregen uit beenmergaspiraten. p-STAT5-, p-4EBP1-, p-RPS6- en p-ERK1/2-niveaus worden tegelijkertijd gemeten met behulp van een spectrale flowcytometer van de volgende generatie met hoge gevoeligheid.

Intracellulaire fosfoflowcytometrie van acute myeloïde leukemie Patiënt-afgeleide xenotransplantaties

Leer een snelle en gestandaardiseerde methode voor dissectie van lange botten en isolatie van beenmerg bij muizen met centrifugatie. Deze techniek behoudt de integriteit van het weefsel voor histologische analyse en celkweek.

Murine Hind Limb Long Bone Dissection en Bone Marrow Isolation

Meer video's verkennen