Murine Hind Limb Long Bone Dissection en Bone Marrow Isolation

Het algemene doel van deze procedure voor het dissekeren van lange botten en het isoleren van beenmerg is om snel en systematisch de lange botten te verwijderen en het beenmerg te verzamelen voor verdere downstream analyse. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden met betrekking tot beenmergbiologie, kankermetastase en immunologie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het dissectieproces snel en gestandaardiseerd is, en dat de isolatieprocedure van het beenmerg redelijk steriel is. Begin door de muis in de rugligging te plaatsen.

Speld vervolgens alle vier de pootkussentjes onder het enkelgewricht vast en spuit de muis met 70% ethanol, waarbij de poten grondig worden besproeid. Maak vervolgens een kleine incisie rechts van de middellijn in de onderbuik net boven het heupgewricht en verleng de incisie langs het been en voorbij het enkelgewricht. Trek de huid terug.

Snijd vervolgens de quadricepsspier door die aan het proximale uiteinde van het dijbeen is verankerd om de voorkant van het dijbeen bloot te leggen en spel de spier uit het been vast met de speld in een hoek van 45 graden ten opzichte van het bord. Snijd met de schaar tegen de achterkant van het dijbeen de hamstrings los van het kniegewricht. Trek vervolgens de huid en hamstringspieren die aan het proximale uiteinde van het dijbeen zijn verankerd, terug om de achterkant van het bot bloot te leggen en spel de hamstringspieren uit het been vast, waarbij de speld in een hoek van 45 graden wordt geplaatst.

Grijp met de pincetten het distale uiteinde van het dijbeen net boven het kniegewricht. Leid vervolgens de schaarbladen aan beide kanten van de schacht van het dijbeen naar het heupgewricht. Nadat u de dijkop hebt bereikt, draait u de schaar, waarbij u het bovenste mes direct over de dijkop beweegt om het dijbeen te disloceren.

Grijp nu het bovenste uiteinde van de schacht van het dijbeen met de pincetten en snijd het zachte weefsel weg van de dijkop om het dijbeen los te maken van het heupgewricht. Trek vervolgens het hele been, inclusief het dijbeen, de knie en het scheenbeen, omhoog en weg van het lichaam en snijd voorzichtig het bindweefsel en de spieren door die het been aan de huid hechten. Wanneer al het bindweefsel is verwijderd, overstrekt u het enkelgewricht en draait u de schaar zoals net is gedemonstreerd om het scheenbeen te disloceren.

Grijp het distale uiteinde van het scheenbeen en zorg ervoor dat u de pezen niet doorsnijdt, trek het scheenbeen omhoog en weg van het lichaam en het speldbord. Verwijder vervolgens al het overgebleven bindweefsel dat aan het lange bot is bevestigd op de knie en eventueel aanvullend spier- of bindweefsel dat aan het dijbeen en het scheenbeen is bevestigd. Om het lange bot voor beenmergisolatie voor te bereiden, grijpt u het dijbeen met de patella naar buiten en de dijkop naar beneden gericht.

Overstrek het kniegewricht en draai de schaar om het scheenbeen uit het dijbeen te disloceren. Verwijder vervolgens al het bindweefsel dat het dijbeen en scheenbeen bij elkaar houdt. Grijp vervolgens het dijbeen met de voorkant naar buiten en de dijkop naar beneden gericht en leid de schaar langs de schacht van het dijbeen naar de condylen.

Draai voorzichtig de schaar heen en weer om de condylen, de knieschijf en de epifyse te verwijderen en de metafyse bloot te leggen. Vervolgens gebruikt u de pincetten, schaar en Kimwipes om eventueel aanvullend spier- of bindweefsel dat aan het dijbeen is bevestigd te verwijderen. Grijp vervolgens het scheenbeen met de voorkant naar buiten en de enkeleind naar beneden gericht.

Als de epifyse van het scheenbeen intact is, leidt u de schaar langs het scheenbeen omhoog naar de condylen en draait u de schaar voorzichtig heen en weer om de condylen en epifyse te verwijderen en de metafyse van het scheenbeen bloot te leggen. Verwijder vervolgens al het aanvullend spier- of bindweefsel dat aan het scheenbeen is bevestigd, zoals net is gedemonstreerd. Om het beenmerg te verzamelen, duwt u eerst een naald van 18 gauge door de bodem van een microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter.

Plaats vervolgens de lange botten in de buis, met de knieuiteinde naar beneden, en sluit het deksel. Plaats het microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en centrifugeert de buisjes in een microcentrifuge gedurende 15 seconden bij minimaal 10.000 keer g. Controleer of het beenmerg uit de botten is gecentrifugeerd door middel van visuele inspectie.

De botten moeten wit lijken en een groot pellet moet zichtbaar zijn in de grotere buis. Gooi vervolgens de botten in het microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter weg en suspendeer het beenmerg in de juiste oplossing voor de gewenste downstream analyse. Deze snelle dissectietechniek is geschikt voor een aantal downstream analyses, waaronder histomorphometrie en histologie.

Inderdaad, zoals gedemonstreerd door deze representatieve histomorphometrische micro-CT 3D reconstructie, worden zowel het sponsachtige bot als de corticale schaal behouden, waardoor een nauwkeurige kwantificering van de gestandaardiseerde structurele parameters voor beenhistomorphometrie mogelijk is. In deze representatieve histologische sectie van een H en E gekleurde, formeel gefixeerde en gedecalcificeerde tibia kan de behouden integriteit van zowel het verkalkte bot als het cellulaire beenmerg voor histologische analyse worden waargenomen. Verder is het door deze procedure geïsoleerde beenmerg geschikt voor veel downstream toepassingen, waaronder de primaire celcultuur van osteoclasten of osteoblasten.

Eenmaal onder de knie, kan de techniek in ongeveer zeven minuten worden voltooid, van de dissectie van lange botten tot het isoleren van het beenmerg, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om de muis zodanig te plaatsen dat de dissectie gemakkelijker wordt. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals FACS of andere eencellijzen, worden uitgevoerd om