Murine Hind Limb Long Bone Dissection en Bone Marrow Isolation

Het algemene doel van deze dissectie van lange beenderen en isolatie van beenmerg is om de lange beenderen snel en systematisch te verwijderen en het beenmerg te verzamelen voor verdere downstream-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de biologie van het beenmerg, kankermetastasen en immunologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het dissectieproces snel en gestandaardiseerd is en de procedure voor beenmergisolatie redelijk steriel is. Begin met het positioneren van de muis in rugligging.

Zet vervolgens alle vier de voetzoolkussentjes onder het enkelgewricht vast en spray de muis met 70% ethanol, waarbij de poten grondig worden natgemaakt. Maak daarna een kleine incisie rechts van de middellijn in de onderbuik, net boven de heup, en breid de incisie uit over het been en voorbij het enkelgewricht. Trek de huid terug.

Snijd vervolgens de quadricepsspier door die is verankerd aan het proximale uiteinde van het femur om de anterieure zijde van het dijbeen bloot te leggen, en spel de spier weg van het been met de speld in een hoek van 45 graden ten opzichte van de plank. Snijd met de schaar tegen de posterieure zijde van het femur de hamstrings los van het kniegewricht. Trek vervolgens de huid en de hamstringspieren die verankerd zijn aan het proximale uiteinde van het femur terug om de posterieure zijde van het bot bloot te leggen, en spel de hamstringspieren weg van het been door de speld in een hoek van 45 graden te plaatsen.

Pak met de pincet het distale uiteinde van het femur net boven het kniegewricht vast. Leid vervolgens de schaarbladen aan weerszijden van de femurschacht richting het heupgewricht. Nadat de femurkop is bereikt, draait u de schaar en beweegt u het bovenste blad direct over de femurkop om het femur te luxeren.

Pak nu de bovenkant van de femurschacht vast met de pincet en snijd het zachte weefsel weg van de femurkop om het dijbeen uit het acetabulum te bevrijden. Trek vervolgens het gehele been, inclusief het femur, de knie en de tibia, omhoog en weg van het lichaam, en snijd voorzichtig het bindweefsel en de spieren door die het been aan de huid bevestigen. Wanneer al het bindweefsel is verwijderd, overstrek dan het enkelgewricht en draai de schaar zoals zojuist gedemonstreerd om de tibia te luxeren.

Pak het distale uiteinde van de tibia vast en trek de tibia omhoog en weg van het lichaam en het spijkerbord, waarbij u er zorg voor draagt de pezen niet door te snijden. Verwijder vervolgens alle resterende bindweefsel dat aan het lange bot bij de knie is gehecht, alsofmede elk aanvullend spier- of bindweefsel dat aan het femur en de tibia is verbonden. Om het lange bot voor te bereiden op mergisolatie, pakt u het femur vast met de patella naar buiten en de femurkop naar beneden gericht.

Overstrek het kniegewricht en draai de schaar om de tibia uit het femur te luxeren. Verwijder vervolgens al het bindweefsel dat het femur en de tibia met elkaar verbindt. Pak daarna het femur vast met de anterieure zijde van u af en de femurkop naar beneden gericht, en geleid de schaar langs de femurschacht omhoog naar de condylen.

Draai de schaar voorzichtig heen en weer om de condylen, de patella en de epifyse te verwijderen, zodat de metafyse bloot komt te liggen. Gebruik vervolgens de pincet, de schaar en Kimwipes om eventueel overgebleven spier- of bindweefsel dat aan het femur vastzit te verwijderen. Pak daarna de tibia vast, waarbij de anterieure zijde van u af is gericht en het enkeluiteinde naar beneden wijst.

Als de tibiale epifyse intact is, worden de scharen langs de tibiaschacht naar de condylen geleid en vervolgens voorzichtig heen en weer gedraaid om de condylen en de epifyse te verwijderen, waardoor de tibiale metafyse wordt blootgelegd. Verwijder vervolgens alle resterende spier- of bindweefsels die aan de tibia vastzitten, zoals zojuist gedemonstreerd. Om het beenmerg te oogsten, wordt eerst een naald van 18 gauge door de bodem van een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter geduwd.

Plaats vervolgens de lange beenderen met het knie-uiteinde naar beneden in de buis en sluit het deksel. Plaats de 0,5 milliliter microcentrifugebuis in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer de buizen in een microcentrifuge bij een kracht groter dan of gelijk aan 10 000 ×g gedurende 15 seconden. Controleer door middel van visuele inspectie of het beenmerg uit de beenderen is geslingerd.

De botten moeten wit ogen en in de grotere buis moet een groot pellet zichtbaar zijn. Gooi vervolgens de botten in de 0,5 milliliter microcentrifugebuis weg en suspendeer het beenmerg in de juiste oplossing voor de gewenste downstream-analyse. Deze snelle dissectietechniek is geschikt voor diverse downstream-analyses, waaronder histomorfometrie en histologie.

Zoals aangetoond door deze representatieve histomorfometrische micro-CT 3D-reconstructie, blijven zowel het spongieuze bot als de corticale schil behouden, wat een nauwkeurige kwantificering van de gestandaardiseerde structurele parameters voor bot-histomorfometrie mogelijk maakt. In deze representatieve histologische sectie van een met H en E gekleurd, in formaline gefixeerd en gedecalcificeerd tibia kan worden waargenomen dat de integriteit van zowel het gecalcificeerde bot als het cellulaire beenmerg voor histologische analyse behouden blijft. Bovendien is het met deze procedure geïsoleerde beenmerg geschikt voor vele downstream-applicaties, waaronder de primaire celcultuur van osteoclasten of osteoblasten.

Zodra de techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in ongeveer zeven minuten worden voltooid, vanaf de dissectie van het pijpbeen tot de isolatie van het beenmerg. Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om de muis zodanig te positioneren dat de dissectie eenvoudig kan worden uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals FACS of andere processen voor individuele cellen, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden over veranderingen in de beenmergcelpopulaties.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u snel de lange beenderen van muizen kunt dissekeren en het beenmerg door middel van centrifugatie kunt isoleren.