Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardig DNA en RNA te isoleren uit wissels en vervolgens hun bacterieel samenstelling te bepalen met behulp van 16S rRNA-gen sequencing. Deze methode kan een onderzoeker helpen om te identificeren welke bacteriën in een bepaald humaan monster aanwezig zijn en om associaties te bepalen tussen specifieke bacteriën en eigenschappen van de gastheer of ziektetoestand. Hoewel deze methode is ontworpen om inzicht te geven in humane vaginale bacteriële gemeenschappen, kan de methode ook worden toegepast om bacteriële gemeenschappen te bestuderen van andere lichaamsdelen, zoals de neusholtes, mond, huid en rectum en van andere organismen.

Let op dat deze video de lastigere delen van het protocol benadrukt en niet de sequencing-gedeelte of de sequencing-analyse behandelt. Brittany Bowman, een technicus uit mijn laboratorium, zal het demonstreren. Begin deze procedure met ectocervicale wissels die zijn verzameld en op nat ijs zijn bewaard zoals beschreven in het bijbehorende document.

In voorbereiding op de extractie van nucleïnezuur, maak alle oppervlakken van de kap en alle items die in de kap worden gebracht schoon met bleekmiddel gevolgd door een ontsmettingsmiddel dat RNases, DNases en DNA verwijdert. Plaats in de kap voor elk monster een kralenbuis. Voeg aan elke buis 500 microliter NaCl-Tris-EDTA-buffer toe, 210 microliter 20%SDS en 500 microliter fenol chloroform isoamylalcohol.

Zorgvuldige behandeling van de wissels is cruciaal om duidelijke resultaten te verkrijgen met dit protocol. Het vergt een beetje oefening om de wissel over te brengen zonder hem te laten vallen en het is gemakkelijker als je een holle schachtwissel zoals deze gebruikt. Gebruik steriele pincetten om de wissel over te brengen van het transportbuisje naar de kralenbuis.

Wrijf de wisselkop grondig gedurende ten minste 30 seconden tegen de interne wanden van de buis. Plaats de buis op ijs. Vervolgens wissels veranderen en herhaal de wisselprocedure met het volgende monster.

Zodra alle monsters krachtig zijn gewreven, laat ze dan minimaal 10 minuten op ijs afkoelen. Nadat 10 minuten zijn verstreken om de wissel te verwijderen, houd de greep vast met steriele pincetten en druk met een schone P200-tip de kop tegen de binnenkant van de buiswand. Dit proces zal vloeistof van de wissel bevrijden en de herstel van nucleïnezuur verhogen.

Plaats de kralenbuis in de kralenmachine en homogeniseer het monster gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de kralenbuis bij 6.000 gs en vier graden Celsius gedurende drie minuten om de deeltjes te pelleten en de waterige en fenol fases te scheiden. Na het centrifugeren zijn meestal drie fases zichtbaar.

De bovenste laag is de waterige fase, die DNA en RNA bevat. De onderste laag is de organische fase, die lipiden en afval van de cellen en wissels bevat. De dunne witte middelste laag, genoemd de interfase, bevat eiwitten.

Breng de waterige fase, ongeveer 500 tot 600 microliter, over naar een steriele 1,5-milliliterbuis. Voeg een gelijk volume fenol chloroform isoamylalcohol toe. Meng door middel van inversie en kort vortexen.

Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten. Breng na het centrifugeren de waterige fase over naar een nieuwe steriele 1,5-milliliterbuis. Zorg ervoor dat u geen materiaal uit de interfase of de onderliggende fenol fase overbrengt.

Noteer het overgebrachte volume en bewaar de fenol fase voor toekomstige eiwitisolatie. Voeg vervolgens 0,8 volume isopropanol en 0,1 volume drie molaar natriumacetaat toe. Meng grondig door middel van inversie en kort vortexen.

Precipiteer de nucleïnezuur door de buis te koelen bij 20 graden Celsius gedurende ten minste twee uur en zolang als een nacht. Volg de precipitatie door de buis gedurende 30 minuten te centrifugeren. Na het centrifugeren, gebruik voorzichtig een pipet om het supernatant te verwijderen, waarbij het pellet intact blijft.

Voeg 500 microliter 100% ethanol toe. Los het pellet los met voorzichtig vortexen of pipetten zonder het pellet aan te raken. Centrifugeer gedurende vijf minuten.

Gebruik een P10 pipet om zoveel mogelijk ethanol te verwijderen en weg te gooien zonder het pellet te verstoren. Laat het pellet 15 minuten bij kamertemperatuur drogen. Breng het pellet opnieuw op in 20 microliter UltraPure 0,1X-Tris-EDTA-buffer.

Laat het monster gedurende 10 minuten op ijs afkoelen en pipet herhaaldelijk om volledige resuspensie te garanderen. Meet de concentratie van nucleïnezuur met behulp van een spectrofotometer. Indien gewenst, scheid DNA van RNA met behulp van een kolomopruimingskit volgens het protocol van de fabrikant.

De PCR-opstelling is een cruciale stap in deze procedure. Het is erg belangrijk om besmetting te minimaliseren door de steriliteit van de reagentia, de PCR-kap en de handschoenen te waarborgen. Werk snel maar voorzichtig en gebruik de juiste techniek bij het verplaatsen van items naar binnen en naar buiten van de kap.

Plaats een schone tafelkoeler voor microcentrifugebuisjes en een PCR-plaatkoeler in de kap. Label 8-well stripbuisjes met individuele doppen en plaats ze in de PCR-koeler. Amplificatie moet in drievoud worden uitgevoerd en een watercontrole zonder sjabloon moet voor elke primerpaar worden opgenomen.

Plaats een microcentrifugebuisje in de koeler voor de mastermix. Combineer vervolgens voor elk monster UltraPure water, 5X HF-buffer, DNTP's, 515F voorwaarts primer en 3%DMSO zoals beschreven in het bijbehorende document. Voeg vervolgens polymerase toe aan de mastermix en meng door middel van pipetten.

Voeg in het eerste putje 90 microliter van de mastermix en twee microliter van de omgekeerde primer toe, meng goed. Voeg vervolgens in het vierde putje, dat dient als controle zonder sjabloon, 23 microliter van de mastermix en twee microliter water toe en meng. Voeg vervolgens zes microliter van het juiste monster toe aan het eerste putje.

Meng grondig en breng 25 microliter over naar het tweede putje. Verander tips, breng vervolgens nog eens