Procedure Om de efficiëntie van Flocculanten Evalueer voor de opheffing van de gedispergeerde deeltjes van plantenextracten
9 april 2016
De hier gepresenteerde ontwerpprocedure voor experimenten maakt de evaluatie van verschillende flocculanten mogelijk op basis van hun vermogen om verspreide deeltjes in plantenextracten te bundelen, waardoor de troebelheid en de kosten van downstreamverwerking worden verminderd.
Het algemene doel van het volgende experiment is om flocculanten te identificeren die de verwijdering van gedispergeerde deeltjes uit plantenextracten kunnen verbeteren. Dit wordt bereikt door een experimenteel ontwerp op te stellen om de meest effectieve polymeren en parameters te identificeren die de aggregatie van deze gedispergeerde deeltjes beheersen. De tweede stap definieert de workflow, die overeenkomt met de processtappen die worden gebruikt in een grootschalige toepassing.
Vervolgens worden bladextracten voor flocculanten onder verschillende omstandigheden voorbereid en geanalyseerd om de troebelheid en de productterugwinning te meten. De resultaten tonen de optimale flocculatieomstandigheden en polymeren op basis van een evaluatie via een design of experiments-model, kortweg DoE. Het belangrijkste voordeel van deze techniek vergeleken met traditionele klaring middels enkel dieptefiltratie, is dat de filtercapaciteit meervoudig kan worden verhoogd, waardoor de totale proceskosten dalen.
Flocculatie kan de effectieve diameter van deeltjes vergroten en hun verwijdering door middel van centrifugatie of filtratie vergemakkelijken. Daarom moeten eerst de omgevingsprocesparameters worden geïdentificeerd die relevant zijn voor de flocculatieprocedure. Doorgaans zijn er verschillende van dergelijke parameters.
Een DoE-benadering is daarom gepast, gezien het gebrek aan mechanistische modellen. De DoE wordt opgezet door parameters te selecteren op basis van literatuurgegevens en voorkennis. Typische parameters omvatten de incubatietijd alsook het polymeertype en de concentratie.
De experimentele resultaten die worden gebruikt om de efficiëntie van de flocculatie te evalueren, zoals de filtreerbaarheid, worden voorafgaand aan het experiment gedefinieerd. Deze informatie wordt vervolgens ingevoerd in een DoE-type dat geschikt is voor het aantal te onderzoeken factoren en de mate van reeds opgedane kennis over het systeem. Er wordt een workflow ontwikkeld die alle stappen omvat die relevant zijn voor de flocculatie en de verwerking van plantenextracten op laboratoriumschaal.
Het aliquotvolume moet klein genoeg zijn om een hoge monsterdoorvoer mogelijk te maken. De prestaties van de laboratoriumapparatuur moeten correleren met die van de apparaten op proceschaal. Planten worden gekweekt op een manier die representatief is voor het uiteindelijke proces.
Alle hulpmiddelen worden voorbereid voordat de extractie- en flocculatie-experimenten worden gestart. De stockoplossingen van de flocculanten worden zorgvuldig bereid, waarbij rekening wordt gehouden met eventuele eerdere verdunning door de fabrikant. Het kiezen van dezelfde stockconcentratie voor alle flocculanten vereenvoudigt het daaropvolgende pipetteren, waardoor de kans op fouten wordt verkleind.
De buffercomponenten, pH en geleidbaarheid voor elke verse voorraadoplossing van het flocculatiemiddel worden zo voorbereid dat ze overeenkomen met de condities van de extracten. Het DoE-schema wordt omgezet in een pipetteerschema waarin de volumes van de voorraadoplossingen staan aangegeven die aan de plantextractmonsters moeten worden toegevoegd. Plantextractmonsters worden bereid uit geoogste tabbladeren met behulp van de buffers die overeenkomen met de condities die in het DoE worden getest.
Tijdens het roeren van het extract worden aliquoten voorbereid die overeenkomen met het vooraf gedefinieerde volume. Dit garandeert een homogene partikelverdeling in alle monsters. Aan elke aliquot wordt extractiebuffer toegevoegd, zodat elk monster hetzelfde volume heeft zodra een flocculant-stockoplossing is toegevoegd.
Het volume van de stamoplossing zoals gedefinieerd in de DoE wordt opeenvolgens aan het monster toegevoegd, conform de gerandomiseerde uitvoervolgorde. Het polymeer wordt homogeen door het monster verdeeld door de buis direct na toevoeging van het polymeer te schudden, wat er ook voor zorgt dat de flocculatieresultaten reproduceerbaar zijn. De methode kan eenvoudig worden aangepast om combinaties van flocculanten of de herhaalde toevoeging van dezelfde flocculant te testen.
Dit moet echter worden geïmplementeerd in het DoE. Vlokvorming vereist doorgaans een incubatietijd van drie tot 30 minuten. Het is noodzakelijk om de in het DoE gedefinieerde incubatietijden strikt na te leven om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Om de prestaties van het flocculatiemiddel te evalueren, kan ofwel de bezinkingssnelheid van de vlokken, ofwel de troebelheid van de filtraten en de filtercapaciteiten worden gebruikt. Het is daarnaast belangrijk om te bevestigen dat de polymeren niet interfereren met producten zoals eiwitten. Zodra de datakwaliteit is bevestigd, kunnen de gegevens worden overgebracht naar de DoE-software.
De experimentele gegevens worden geanalyseerd met de in de DoE-software ingebouwde hulpmiddelen, waaronder tools voor datatransformatie, factorselectie en kwaliteitscontrole. Naast het gebruik van deze hulpmiddelen moet het uiteindelijke model ook overeenstemmen met de basiswetten van de fysica en thermodynamica. Zodra de modelkwaliteit is bevestigd, kan het model worden gebruikt om de optimale omstandigheden voor flocculatie te voorspellen.
Op basis van de modelvoorspellingen kan de ontwerpruimte worden beperkt tot de meest relevante regio, waarvoor een nieuw DoE kan worden opgezet door de eerder beschreven procedure te herhalen. De resultaten kunnen vervolgens worden bevestigd op pilot- of productieschaal. In deze representatieve studie werd de prestatie van 23 verschillende synthetische en vier natuurlijke flocculanten getest op hun vermogen om tabbladextracten te flocculeren met behulp van een DoE-benadering.
Hierbij is rekening gehouden met polymeerspecifieke parameters zoals polymeerconcentratie en -type, maar ook met procesparameters, zoals incubatietijd, temperatuur, buffer-pH en geleidbaarheid. Met een reeks van vier geneste IV-optimale ontwerpen, bestaande uit in totaal ongeveer 200 extractaliquots van 20 mL, stelden we vast dat Polymin P de meest effectieve flocculant was voor tabaksextracten in het pH-bereik van vier tot acht, mits de temperatuur tussen de vier en 30 °C lag. Een incubatietijd van 15 minuten was voldoende voor flocculatie, maar de effectiviteit nam af bij geleidbaarheden groter dan 40 mS per cm.
De DoE-benadering toonde echter aan dat Catiofast VSH complementair was aan Polymin P, waarbij een effectieve flocculatie werd bereikt bij geleidbaarheden groter dan 40 mS per cm. Wanneer deze flocculanten werden geïntroduceerd in de downstream-verwerking van tabakextracten, nam de capaciteit van de ingezette dieptefilters 3,2 tot 5,7-voudig toe, waardoor de productiekosten voor deze stap dienovereenkomstig afnamen. We hebben bevestigd dat de flocculanten de recovery van doeleiwitten niet verminderden, waaronder een monoklonaal antilichaam, een fluorescentie-eiwit, een lectine en verschillende vaccinkandidaaten.
De optimale flocculatiecondities werden ook bevestigd in een batch op pilotschaal van 100 L. De resultaten van de DoE werden daarnaast succesvol overgedragen naar tabaksextracten die waren bereid met een schroefpers in plaats van een homogenisator met messen, wat onderstreept hoe breed toepasbaar de verzamelde informatie is. We hebben de methode ook aangepast om combinaties van flocculanten te testen die even goed werkten.
Na het bekijken van deze video zou u moeten begrijpen hoe u flocculatie-experimenten voor plantenextracten opzet met behulp van een DoE-benadering.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een design-of-experiments-benadering om verschillende flocculanten te evalueren op hun effectiviteit bij het aggregeren van gedispergeerde deeltjes in plantenextracten. Het doel is om de troebelheid te verminderen en de efficiëntie van downstream-verwerking te verhogen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschapsgebied
- Biotechnologie
- Milieuwetenschappen
- Procesengineering
Achtergrond
- Flocculanten zijn stoffen die de klontering van deeltjes bevorderen.
- Het verminderen van de troebelheid is cruciaal voor het verbeteren van de kwaliteit van plantenextracten.
- Traditionele methoden voor klaring kunnen inefficiënt en kostbaar zijn.
- Design of experiments (DoE) maakt een systematische evaluatie van meerdere variabelen mogelijk.
Doel van de studie
- Het identificeren van effectieve flocculanten voor het verwijderen van gedispergeerde deeltjes uit plantenextracten.
- Het optimaliseren van de condities voor flocculatie.
- Het evalueren van de kosteneffectiviteit van de voorgestelde methode in vergelijking met traditionele technieken.
Gebruikte methoden
- Experimenteel ontwerp voor de beoordeling van verschillende flocculanten.
- Bereiding van bladextracten onder verschillende omstandigheden.
- Meting van de troebelheid en productterugwinning.
- Analyse van de resultaten met behulp van een design of experiments-model.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van optimale flocculatiecondities.
- Evaluatie van de meest effectieve polymeren voor aggregatie.
- Demonstratie van een verhoogde filtercapaciteit in vergelijking met dieptefiltratie.
- Vermindering van de totale verwerkingskosten door verbeterde efficiëntie.
Conclusies
- De design-of-experiments-benadering identificeert effectief geschikte flocculanten.
- Optimale condities kunnen het clarificatieproces aanzienlijk verbeteren.
- Deze methode biedt een kosteneffectief alternatief voor traditionele filtratietechnieken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het helder maken van plantextracten is een kritieke bottleneck in de downstreamprocessing van biologische geneesmiddelen op plantbasis, waarbij een hoge troebelheid de filtratie- en centrifugatiekosten verhoogt en de doorvoersnelheid vermindert. Deze design-of-experiments (DoE)-benadering maakt een snelle, empirische screening van flocculanten mogelijk om de vaste-vloeistofscheiding te optimaliseren zonder te vertrouwen op mechanistische modellen, wat direct bijdraagt aan kostenreductie en de schaalbaarheid van processen in de biofarmaceutische productie. Door robuuste combinaties van polymeren en condities te identificeren die de productherwinning behouden, verhoogt deze methode het voorspellende vertrouwen in de unit operations voor het helder maken en faciliteert het de technologietransfer van laboratorium- naar pilotschaal.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt empirisch onderzoek naar flocculatiemechanismen in complexe plantmatrices mogelijk waar theoretische modellen ontbreken.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle screening van polymeerbibliotheken onder fysiologisch relevante omstandigheden om risico's in clarificatiestrategieën vroegtijdig in de procesontwikkeling te minimaliseren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve gegevens over troebeling en filtratiecapaciteit om de prestaties van flocculanten te rangschikken over meerdere procesvariabelen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling van flocculatie via pipetteerschema's afgeleid van DoE, wat de reproduceerbaarheid verbetert en operatorafhankelijke variabiliteit vermindert.
- Strategische waarde: Identificeert complementaire paren flocculanten (bijv. Polymin P en Catiofast VSH) die de operationele geleidbaarheidsbereiken uitbreiden, waardoor de flexibiliteit van het platform toeneemt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft het herstel van het doeleiwit (inclusief monoklonale antilichamen en vaccinkandidaten) onder geoptimaliseerde flocculatiecondities, waardoor de productintegriteit wordt gewaarborgd.
- Operationele waarde: Demonstreert de succesvolle overdracht van DoE-geoptimaliseerde condities van laboratoriumschaal (20 mL) naar batches op pilotschaal (100 L), wat bijdraagt aan een schaalbare tech transfer.
- Strategische waarde: Vermindert de frequentie van het vervangen van dieptefilters door de capaciteit met 3,2 tot 5,7 keer te verhogen, wat de productiekosten verlaagt en de procescontinuïteit verbetert.
Pipeline- en workflowintegratie
Deze methode past binnen de downstream clarificatiefase van de productie van biologische geneesmiddelen op plantbasis, waarbij de brug wordt geslagen tussen de vroege extractbereiding en dieptefiltratie door de kwaliteit van de voedingsstroom te verbeteren en de looptijden van filters te verlengen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests met betrekking tot polymeer-deeltjesinteracties in complexe extracten door systematische variatie van pH, geleidbaarheid, temperatuur en incubatietijd.
- Screening: Levert assay-klare resultaten, waaronder troebelingsreductie en filtraathelderheid, waardoor een directe vergelijking van de effectiviteit van flocculanten onder gedefinieerde omstandigheden mogelijk is.
- Analytics: Biedt modelgebaseerde voorspellingen van optimale flocculatiecondities, waardoor teams de design space kunnen beperken en bevestigende experimenten kunnen prioriteren.
- Translationeel Onderzoek: Garandeert continuïteit van discovery naar preklinische productie door te valideren dat flocculatie de opbrengst of kwaliteit van doelmoleculen niet in gevaar brengt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar DoE-framework dat aanpasbaar is aan andere plantensoorten, weefsels of extracttypes, wat standaardisatie tussen projecten bevordert.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de efficiëntie van de klaring door de selectie van flocculanten te koppelen aan meetbare procesresultaten, zoals filtercapaciteit en troebelheid.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde incubatietijden, gecontroleerde toevoeging van reagentia en een experimentele uitvoering op basis van DoE.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de benutting van de bestaande filtratie-infrastructuur te maximaliseren en de belasting door verbruiksartikelen te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde voortgang van plant-afgeleide kandidaten mogelijk door knelpunten en variabiliteit in de downstream-verwerking te minimaliseren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in experimenteel ontwerp (DoE), troebelheidsmeting en polymerafhandeling.
- Afhankelijk van toegang tot DoE-software, centrifuges of filtratiesystemen en analytische instrumenten voor de bepaling van partikelgrootte of troebelheid.
- Vereist afstemming tussen de teams bioprocesengineering en analytische ontwikkeling voor een consistente definitie van parameters.
- Omvat aanpassingen bij het overschakelen tussen plantensoorten, weefseltypen of extractiemethoden (bijv. homogenisatie via een messen- of schroefpers).
- Beperkt door het empirische karakter van DoE, waarbij optimale condities binnen de geteste bereiken worden geïdentificeerd, maar zonder hervalidatie niet kunnen worden geëxtrapoleerd buiten de ontwerpruimte.
