Name: Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Leer IR-MALDESI massaspectrometrie imaging voor gehele lichaamsweefselanalyse bij neonatale muizen. Deze methode maakt gelijktijdige detectie van endogene en exogene analyten in meerdere organen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken professor H. Troy Ghashghaei van het NCSU Department of Molecular Biomedical Sciences voor het verstrekken van het hele muizenweefsel. De auteurs zijn ook zeer dankbaar voor de financiële ondersteuning ontvangen van National Institutes of Health (R01GM087964), de W.M. Keck-stichting en North Carolina State University.

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen voor het uitvoeren van IR-MALDESI MSI experimenten. Diepgaande informatie over geoptimaliseerde geometrie van de IR-bron MALDESI en synchronisatie met de laser, podium en massaspectrometer 5,6 elders te vinden. Dierlijk weefsel monsters die in dit protocol zijn verkregen volgens Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en North Carolina State University regelgeving. 1. Tissue Voorbereiding <ol><li> Bereid een isopentaan / droog ijsbad door het plaatsen van ~ 200 ml isopentaan in een schone beker in een secundaire container droog ijs in een zuurkast. Gebruik beschermende handschoenen en een veiligheidsbril te allen tijde bij het hanteren van de isopentaan / droog ijsbad en het weefsel. <ol><li> Euthanaseren 2 dagen oude geheel neonatale muis pup door Avertin overdosis (7,5 mg / g lichaamsgewicht), en dan bevriezen het weefsel in de isopentaan / droog ijsbad om weefsel structuur te behouden. Gebruik een pre-cleaned pincet te plaatsen en verwijderen van de muis pup in cryomold van de isopentaan / droog ijsbad. Bewaar de flash-ingevroren weefsel bij -80 ° C tot analyse. </li></ol></li><li> Het gebruik van beschermende handschoenen, breng dan een laag van een optimale snij-temperatuur (LGO) montage medium op een 40 mm cryostaat specimen disc. Plaats voorzichtig de bevroren hele muis op de oktober gecoate monsterhouder de muis zich te houden aan de schijf in de gewenste richting te snijden. Let op: oktober wordt uitsluitend gebruikt om het weefsel aan het monster disc houden voor het snijden. Niet volledig insluiten weefsel in oktober en vermijd teveel als oktober is bekend dat schadelijke gevolgen voor MSI analyse te hebben. Andere media, zoals gelatine, kan gebruikt worden om cryo-insluiten alvorens te snijden weefsel is 9. </li><li> Plaats de disc (met oktober en sectie weefsel) op Peltier monsterhouder in cryostaat en druk Peltier-knop. Wacht 10 minuten voor monster thermisch evenwicht komen. </li><li> Plaats de monsters schijf (met het weefsel aangebracht op) aan de binnenkant van de schijfhouder en gezicht het weefsel naar het gewenste vlak voor analyse. Snijd het weefsel in stukken met de gewenste dikte bij -20 ° C met de rotatiemicrotoom gehuisvest in de cryostaat 10. Opmerking: Voor het hele lichaam analyseert, snijd de weefsel in 25 urn dikke secties om het weefsel integriteit te behouden. Voor de kleinere regio&#39;s (bv, lever, hersenen, nieren), snijd de weefsel in 10 urn dikke secties. <ol><li> Gebruik de anti-roll glasplaat aan de gesneden weefselsectie voorkomen rollen. Gebruik de cryostaat zuigslang en borstels om ongewenste weefsel vuil te verwijderen. Zodra het weefsel wordt doorgesneden, gebruik dan de beschermkap van de scherpe microtoom mes te dekken om lichamelijk letsel te voorkomen. </li></ol></li><li> Orient muis sectie preparaatplateau en dooi-monteren op een vooraf gereinigde microscoopglaasje door aanpassing van de schuif zo dicht mogelijk bij de weefselcoupe, zonder te raken 10. Opmerking: Voor kwantitatieve MSI experimenten, de vacht van de dia met een interne standaard met behulp van een geautomatiseerd pneumatische spuit voorafgaand aan de montage van het weefsel, en dooi-mount de sectie weefsel aan de gecoate dia 11. </li><li> Verwijder de microtoom mes gebruikt voor het snijden van het weefsel met behulp van het mes uitstoter, en veilig het mes in de juiste &quot;scherpe afval&quot; container weggooien. </li><li> Houd het glaasje in de cryostaat tot Step 3.2 tot cryopreservatie van het weefsel te handhaven. </li></ol> 2. IR-MALDESI Voorbereiding / Calibration <ol><li> Schakel de mid-infrarood laser en start de laser controle applicatie op de computer. Kies de gewenste golflengte met behulp van de laser controle verzoek van de fabrikant. IR-MALDESI experimenten worden typisch uitgevoerd bij 2940 nm. Opmerking: Recente experimenten hebben de afhankelijkheid van de mid-infrarood laser golflengtes en het ijs matrix met opgemerkt verschillen die lijken te analyseren specifiek 8 te zijn onderzocht. </li><li> Zet het herte controller, start het aangepaste user control-programma (RASTIR), en het ijken van het podium positie met behulp van de home-knop. </li><li> Bereid electrospray oplossing. Gewoonlijk gebruiken een 50:50 (v / v) methanol / water met 0,2% mierenzuur voor elektrospray oplosmiddel in positieve-ion modus. Selecteer de electrospray oplosmiddelsamenstelling volgens het experiment. Gebruik bijvoorbeeld 5 mM ammoniumhydroxide als elektrospray modifier voor de beeldvorming toepassingen in negatieve ionen-modus. Opmerking: Voor de polariteit schakelen IR-MALDESI MSI, gebruiken 1 mM azijnzuur als modifier. Deze modifier is optimaal voor het verkrijgen van een stabiele en reproduceerbare signaal in zowel positieve- en negatieve-ion modi 12 gevonden. </li><li> Vul een 1 ml spuit met elektrospray oplosmiddel en spoel de silica capillair met nieuwe oplosmiddel. </li><li> Lijn ESI emitter op as MS inlaat met de bron parameters zoals ESI-spot afstand spot-inlaat afstand monsterhoogte, en oplosmiddel stroomsnelheid die geoptimaliseerd via statistische DO<html> E voor analyse van weefselsecties 6. Let op: Zie figuur 1 voor een schematische beeltenis van deze parameters en geoptimaliseerd waarden voor MSI weefsel secties. </li><li> Start de electrospray en de stabiliteit ervan (&gt; 10 min) door het bewaken van de totale ionenstroom (TIC), dat op dit moment uitsluitend uit ambient verbindingen te evalueren. Typisch, een TIC variatie van &lt;10% op 10-15 min is een goede indicatie van de stabiliteit. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53942/53942fig1.jpg" /> Figuur 1. IR-MALDESI schematisch en parameters. (A) Schematische voorstelling van IR-MALDESI source setup (niet op schaal) en de instelbare parameters. (B) Geoptimaliseerd parameterwaarden voor beeldvorming van weefsel secties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53942/53942fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> title &quot;&gt; 3. Afzetting van Ice Matrix <ol><li> Let op: Schakel de elektrospray alvorens monster op het podium. </li><li> Plaats de dooi gemonteerd weefsel op de IR-MALDESI monster plaat binnen het camerabeeld. </li><li> Zorg ervoor dat de handen vrij zijn van de ESI zender en de elektrospray opnieuw op. </li><li> Sluit de toegangsdeur van de IR-bron en zuivering MALDESI behuizing met droge stikstof om condensatie van water op het oppervlak van het weefsel te voorkomen. Zodra de relatieve vochtigheid in de kast bereikt &lt;3%, zet de DC-voeding (~ 12 V) aan de Peltier plaat, waarbij het monster plaat zal afkoelen. Opmerking: Het koelproces het Peltier-gekoelde fase toelichting gegeven 13. </li><li> Koel het stadium -9 ° C, en laat de gemonteerde weefsel thermisch evenwicht (~ 5-10 min) komen. </li><li> Stop stikstofspoeling en het weefsel de relatieve omgevingsvochtigheid bloot door het openen van de deur bron. Een dun laagje ijs wordt afgezet op de cold oppervlak van de Peltier podium en gemonteerd weefselsectie door desublimatie van water uit de lucht. Opmerking: Als de relatieve vochtigheid in het lab is dan 10-15%, plaats een beker warm water in de behuizing om de vorming van ijs matrixlaag vergemakkelijken. </li><li> Nadat het ijs matrixlaag gevormd, sluit de toegangsdeur en stroom droge stikstof opnieuw opstarten om de relatieve vochtigheid te verminderen tot 10 ± 2%. Stel het stikstofdebiet de relatieve vochtigheid op dit niveau te houden, empirisch gevonden dat het evenwicht van ijsvorming en sublimatie een constante ijslaag handhaven gedurende het experiment 6 zijn. </li></ol> 4. Massaspectrometrie Imaging Data Acquisition <ol><li> Met behulp van de RASTIR GUI (figuur 2), verplaats het podium om de analyse positie door te klikken op de &quot;LASER positie&quot; knop. Met de instelling van de laser diode te zorgen voor een off-weefselgebied wordt weggenomen. Vuur een laser schot in een off-weefsel region de laser verschoven ten opzichte cameramening kalibreren. Klik op de &quot;Laser Test Fire&quot; knop om de laser positie te werken. </li><li> Ga terug naar &quot;CAMERA stand&quot; en de laser positie in RASTIR te werken door het plaatsen van de laseruitlijning vizier op de laser ablatie spot (Afbeelding 2-1). </li><li> Klik op de regio van belang (ROI) knop en pas de grootte en positie van de ROI voor de sectie weefsel wordt geanalyseerd (Figuur 2-2). Input geschikte experimentele parameters zoals de grootte stap in de X- en Y-richting (in mm) (Afbeelding 2-3), en de naam van het bestand MSI in het &quot;Project Name&quot; (Afbeelding 2-4). <ol><li> Bij het tekenen van een ROI omvatten een deel van off-weefsel dat dient als controle. Gebruik deze off-weefsel sectie voor piek picking (Stap 5.4). Opmerking: De desorptie diameter (spot grootte) van de laser op weefsel is ongeveer 150 pm; echter kunnen hogere ruimtelijke resolutie worden verkregen door using de oversampling methode 14,15. </li></ol></li><li> Selecteer de juiste laser frequentie uit het uitklapmenu, het aantal laserpulsen per voxel (integer waarden), en de vertraging tussen de laser trekker en massaspectrometer signaal acquisitie (Afbeelding 2-5). Typisch gebruik maken van twee laserpulsen per voxel bij 20 Hz tot materiaal volledig desorberen in een IR-MALDESI MSI experimenten, met een 10 msec vertragingstijd om ionen gegenereerd om de massa-analysator te bereiken voor de meting 5 mogelijk te maken. Opmerking: Kies de hoogste herhalingsfrequentie dat de laser in staat is om te werken bij. Het werd onlangs aangetoond dat het gebruik van hogere herhalingsfrequentie analyseren aantoonbaarheid 16 zal verbeteren. </li></ol><img alt="figuur 2" src="/files/ftp_upload/53942/53942fig2.jpg" /> Figuur 2. gebruikersinterface voor IR-MALDESI MSI werking. Screenshot van de RASTIR Scan Controle programma wordt gepresenteerd. De stappen voor het performing een MSI experiment zijn: (1) het lokaliseren van de laser spot, (2) een ROI tekenen, (3) de omvang stadium stap (in mm) te kiezen, (4) het geven van een naam aan het bestand, (5) het kiezen van de juiste nummer pulsen per voxel, samen met de gewenste herhalingsfrequentie, en (6) het controleren van de lijst voor de beeldvorming en MS setup. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53942/53942fig2large.jpg" target="_blank">klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="5"><li> Kies massaspectrometer parameters zoals ionisatie mode, elektrospray voltage, oplosmiddel stroomsnelheid, capillaire temperatuur, en de injectie tijd in de massaspectrometer software. Zie Tabel 1 voor een voorbeeld van de parameters die in het hele lichaam IR-MALDESI MSI. Opmerking: Als gevolg van de complexiteit van biologische monsters en gebrek aan scheidingsmethoden in MSI analyse, wordt de IR-MALDESI source gekoppeld met een hoog oplossend vermogen en een hoge nauwkeurigheid van massa instrument. Een overname methode kan worden geladen voor analyses zoals parallelle reactie controle (PRM) 7 of polariteit schakelen MSI 12. </li><li> Zodra alle parameters (laser, podium, en massaspectrometer) zijn gekozen, plaatst u de MS in de &#39;handshake&#39; mode voor synchronisatie en start MS acquisitie. </li><li> Met behulp van RASTIR imaging software, controleert alle stappen in checklist (figuur 2-6) worden aangevuld door het controleren van dozen, en laadt het programma. Wanneer het programma is geladen, zal de &quot;Run&quot; knop beschikbaar zijn. Druk op Uitvoeren om MSI signaal overname te starten. </li><li> Na voltooiing van de beeldvorming experiment, stop massaspectrometer acquisitie en zet het instrument in de standby-modus. Schakel stikstofspoeling de behuizing, schakel stroomtoevoer naar Peltier plaat, en zet het podium controller en laser. </li><li> Open de deur, verwijder de elektrospray emitter tip vanuit de bron behuizing en verwijder de verlengde verwarmde metalen MS inlaat met behulp van beschermende handschoenen. Let op: De verlengde<html> metal MS inlaat zal zeer heet zijn. </li><li> Het dragen van handschoenen en een veiligheidsbril, het reinigen van de verlengde metalen capillaire inlaat door ultrasoon bad in 15% salpeterzuur gedurende 10 minuten, daarna in HPLC-grade water gedurende 10 minuten, en uiteindelijk in HPLC-kwaliteit methanol gedurende 10 min. Droog de metalen capillaire inlaat onder een stroom van stikstof, en plaats in MS. Opmerking: Gooi oplosmiddel in de daarvoor bestemde afvalcontainers daarna. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="432"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="22"><td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:216px;"> Parameter </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> Waarde </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> ionisatie Mode </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> Positief </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> electrospray Voltage </td><html> R &quot;style =&quot; width: 216px; &quot;&gt; 3,8-4,2 kV </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> Solvent Flow Rate </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 2 gl / min </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> capillaire Temperatuur </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 275 ° C </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> scanbereik </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> m / z 250-1,000 </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> Scan type </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> Volledige scan </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> injectie Time </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 110 msec </td></tr><tr height="22"><td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:216px;"> oplossend vermogen </td>width: 216px; &quot;&gt; 140.000 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Instrument parameters voor het gehele lichaam IR-MALDESI MSI. 5. Data Analysis <ol><li> Omzetten van de ruwe data bestanden die door het instrument om gegevens formaten zoals mzXML 17 of imzML 18 met behulp van gratis software zoals MSConvert 17 en imzML converter 19. </li><li> Start MSiReader v1.0, een open-source software die is ontwikkeld voor de analyse van high-oplossend vermogen MSI data 20, op een speciale verwerking computer. Laad de imaging-bestand naar MSiReader. Voor de user interface van MSiReader en sommige van haar ingebouwde functies, zie figuur 3. </li><li> Genereren ion kaarten van analyten door het invoeren van de m / z en kies een geschikte m / z venster in delen per miljoen (ppm) of Thomson (Th) (Figuur 3-1). Voor hoog oplossend vermogen (RP) instrumentenkiezen voor een raam in de low-range ppm. Opmerking: De juiste m / z venster afhankelijk van de RP en massa meetnauwkeurigheid (MMA) van het instrument dat IR-MALDESI is gekoppeld met. </li><li> Verder zijn de gegevens met behulp van de ingebouwde functies zoals interpolatie (zie figuur 3-2), normalisatie (Afbeelding 3-3), optische image overlay (Afbeelding 3-4), en de piek plukken (figuur 3-5) 20 interpreteren. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53942/53942fig3.jpg" /> Figuur 3. De gebruikersinterface van MSiReader; v1.0 20. Zodra een bestand in de software is geladen, worden ion kaarten van analyten wordt weergegeven door (1) het invoeren van de m / z en tolerantie in ppm of Th. Verdere analyse zoals (2) interpolatie of (3) normalisatie kan worden uitgevoerd. Een optische beeld van het weefsel kunnen ook worden geïmporteerd en bovenop metde ion kaarten (4) voor een betere visualisatie. Voor ongerichte analyseert de piek picking-functie (5) kan worden gebruikt om weefsel-specifieke pieken halen door te kiezen voor het gebied van weefsel (paarse lijn) en een referentiegebied off-weefsel (groene doos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53942/53942fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.</a> <ol start="5"><li> Gebruik de piek picking functie om een lijst met weefsel-specifieke m / z waarden met behulp van door de gebruiker gedefinieerde criteria te genereren. Opmerking: De PeakFinder algoritme verschillen in gemiddelde massaspectrum twee gebieden. Deze m / z waarden kunnen vervolgens worden doorzocht tegen metaboliet databases zoals METLIN 21 of LIPID KAARTEN. 22 <ol><li> Zie Figuur 3 voor een voorbeeld van het kiezen van een ondervraagde weefselgebied (magenta veelhoek ROI) en uit weefsel referentiegebied (groen veelhoek ROI). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mcdonnell, L. A., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 606-643 (2007).</li>
<li>Chughtai, K., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+for+biomedical+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis.</a> Chem. Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).</li>
<li>Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Mass+Spectrometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Mass Spectrometry Imaging.</a> Encycl. Anal. Chem. , (2014).</li>
<li>Sampson, J. S., Hawkridge, A. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+detection+of+multiply-charged+peptides+and+proteins+by+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization+%28MALDESI%29+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Generation and detection of multiply-charged peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (12), 1712-1716 (2006).</li>
<li>Robichaud, G., Barry, J. A., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization+%28IR-MALDESI%29+imaging+source+coupled+to+a+FT-ICR+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) imaging source coupled to a FT-ICR mass spectrometer.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IR-MALDESI+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Biological+Tissue+Sections+Using+Ice+as+a+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">IR-MALDESI Mass Spectrometry Imaging of Biological Tissue Sections Using Ice as a Matrix.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).</li>
<li>Barry, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Antiretroviral+Drugs+in+Tissue+by+IR-MALDESI+MSI+Coupled+to+the+Q+Exactive+and+Comparison+with+LC-MS%2FMS+SRM+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mapping Antiretroviral Drugs in Tissue by IR-MALDESI MSI Coupled to the Q Exactive and Comparison with LC-MS/MS SRM Assay.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).</li>
<li>Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Ghashghaei, H. T., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Desorption+Conditions+on+Analyte+Sensitivity+and+Internal+Energy+in+Discrete+Tissue+or+Whole+Body+Imaging+by+IR-MALDESI%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Influence of Desorption Conditions on Analyte Sensitivity and Internal Energy in Discrete Tissue or Whole Body Imaging by IR-MALDESI.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 26, 899-910 (2015).</li>
<li>Nelson, K. A., Daniels, G. J., Fournie, J. W., Hemmer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+whole-body+zebrafish+sectioning+methods+for+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Optimization of whole-body zebrafish sectioning methods for mass spectrometry imaging.</a> J. Biomol. Tech. 24 (3), 119-127 (2013).</li>
<li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (3), e194(2007).</li>
<li>Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+emtricitabine+in+cervical+tissue+model+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2073-2084 (2015).</li>
<li>Nazari, M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+Switching+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Healthy+and+Cancerous+Hen+Ovarian+Tissue+Sections+by+Infrared+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Electrospray+Ionization+%28IR-MALDESI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Polarity Switching Mass Spectrometry Imaging of Healthy and Cancerous Hen Ovarian Tissue Sections by Infrared Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI).</a> Analyst. 141, 595-605 (2016).</li>
<li>Hsu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Application+of+a+Low-Temperature+Peltier-Cooling+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Design and Application of a Low-Temperature Peltier-Cooling Microscope.</a> J. Pharm. Sci. 85 (1), 70-74 (1996).</li>
<li>Jurchen, J. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-MS+imaging+of+features+smaller+than+the+size+of+the+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MALDI-MS imaging of features smaller than the size of the laser beam.</a> J. Am. Soc.Mass Spectrom. 16 (10), 1654-1659 (2005).</li>
<li>Nazari, M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular-level+mass+spectrometry+imaging+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization+%28IR-MALDESI%29+by+oversampling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cellular-level mass spectrometry imaging using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) by oversampling.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2265-2271 (2015).</li>
<li>Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Nazari, M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+C-Trap+Ion+Accumulation+Time+on+the+Detectability+of+Analytes+in+IR-MALDESI+MSI%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Influence of C-Trap Ion Accumulation Time on the Detectability of Analytes in IR-MALDESI MSI.</a> Anal. Chem. 87, 10483-10490 (2015).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>Schramm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImzML+-+A+common+data+format+for+the+flexible+exchange+and+processing+of+mass+spectrometry+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ImzML - A common data format for the flexible exchange and processing of mass spectrometry imaging data.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5106-5110 (2012).</li>
<li>Race, A. M., Styles, I. B., Bunch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusive+sharing+of+mass+spectrometry+imaging+data+requires+a+converter+for+all%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Inclusive sharing of mass spectrometry imaging data requires a converter for all.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5111-5112 (2012).</li>
<li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSiReader%3A+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li>
<li>Smith, C. A., O'Maille, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+a+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug.+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN: a metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug. Monit. 27 (6), 747-751 (2005).</li>
<li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMSD%3A+LIPID+MAPS+structure+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Res. 35, D527-D532 (2007).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Takai, N., Tanaka, Y., Inazawa, K., Saji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+pharmaceutical+drug+distribution+in+multiple+organs+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of pharmaceutical drug distribution in multiple organs by imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 26 (13), 1549-1556 (2012).</li>
<li>Liu, J., Gingras, J., Ganley, K. P., Vismeh, R., Teffera, Y., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+distribution+study+of+drugs+in+neonate+mice+using+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue distribution study of drugs in neonate mice using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (2), 185-190 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Het protocol hierboven beschrijft de belangrijkste stappen voor het uitvoeren van een IR-MALDESI MSI experiment. De matrix applicatie (Paragraaf 3) duurt ongeveer 20 minuten, die vergelijkbaar is met een typische matrix toepassingsproces voor MSI MALDI experimenten door sublimatie of sproei-bekleding met een robot sproeier. Bovendien is IR-MALDESI niet afhankelijk verdeling van analyten in de matrix kristallen 6, en het ijs matrix is universeel voor alle analyten ongeacht hun massa, grootte of chemische eigen...

Massaspectrometrie imaging (MSI) microprobe modus omvat desorptie van het monster van een oppervlak door een balk (laser of ionen) op discrete plaatsen over het oppervlak van een monster. Op elk rasterpunt wordt een massaspectrum geproduceerd en de verkregen spectra, samen met de ruimtelijke locatie van waaruit ze zijn verzameld, kan worden gebruikt om tegelijkertijd kaart talrijke analyten in het monster. Deze labelvrije wijze van beeldvorming gekoppeld met de gevoeligheid en specificiteit van massaspectrometrie geholpen MSI een van de snelst veranderende velden massaspectrometrie 1,2. Matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) is de meest voorkomende ionisatie methode voor MSI analyse. De noodzaak van een organische matrix en het vacuüm eisen van MALDI vormen belangrijke beperkingen reproduceerbaarheid monsters worden verwerkt en de typen monsters kunnen worden geanalyseerd met de werkwijze. Een aantal van de atmosferische druk (AP) ionisatie methoden zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren aan deze beperkingen 3 te omzeilen. Deze ambient ionisatie methoden mogelijk maken voor de analyse van biologische monsters in een omgeving die veel dichter bij hun natuurlijke staat en vereenvoudigen monstervoorbereiding stappen voorafgaand aan de analyse. Matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatie electrospray (MALDESI) is een voorbeeld van een dergelijke ionisatiemethode 4,5. IR-MALDESI experimenten wordt een dunne laag ijs afgezet op het weefseloppervlak als energieabsorberende matrix. Een mid-IR laserpuls wordt geabsorbeerd door het ijs matrix en vergemakkelijkt desorptie van neutraal materiaal van het oppervlak door resonant exciteren van het OH stretching wijze van water. De gedesorbeerde neutralen partitie in de geladen druppeltjes van een orthogonaal elektrospray en zijn post-geïoniseerd in een ESI-achtige manier 4-6. De toevoeging van exogene ijs matrix heeft de voorkeur boven uitsluitend op de endogene water in het weefsel, omdat het ac helpttellen variaties in het watergehalte in verschillende compartimenten weefsel en is aangetoond dat desorptie 6 verhogen en ion overvloed van ~ 15-voudig 7,8 in weefsel plaatsbepalingen. In dit werk, maken we gebruik van IR-MALDESI MSI aan de verdeling van de metabolieten in de verschillende organen te wekken in een neonatale muis hele lichaam. Een overzicht van de instelbare parameters van de IR-MALDESI bron wordt gegeven, en de nodige stappen voor een succesvolle beeldvorming van weefsel secties worden gedemonstreerd.

<table><tbody><tr><td>IR-MALDESI Source</td><td>Op maat gemaakt</td><td>N/A</td><td>Raadpleeg verwijzingen 4 en 12 voor een diepgaande bespreking van de ontwikkeling van de IR-MALDESI-bron.</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td></tr><tr><td>Water, HPLC Grade</td><td>Burdick &amp; Jackson&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC Grade</td><td>Burdick &amp; Jackson&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Tunable mid-IR Laser</td><td>Opotek Inc.</td><td>IR Opolette</td><td>Instelbare 2.700-3.100&nbsp;nm IR OPO-laser</td></tr><tr><td>Nitrogen Gas</td><td>Arc3 Gases</td><td>AG S-NI300-5.0</td><td>Graad 5.0 hoge zuiverheid stikstofgascilinder (300)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM 1950</td><td>Cryomicrotome</td></tr><tr><td>High Profile Microtome Blades</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802123</td><td>Leica DB80HS</td></tr><tr><td>Mounting Medium (OCT)</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801480</td><td>Surgipath FSC 22 montagemedium</td></tr><tr><td>Cryostat Specimen Disc</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740045</td><td>40 mm diameter</td></tr><tr><td>Glass Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Gemat, geselecteerd, voorgedaan</td></tr></tbody></table>

whole-body massaspectrometrie imaging door infrared matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (ir-maldesi)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionisatie bronnen voor massaspectrometrie (MS) zijn het onderwerp van veel belangstelling in de afgelopen tien jaar geweest. Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (MALDESI) is een voorbeeld van dergelijke werkwijzen, waarbij gebruik van matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) (bijvoorbeeld gepulste aard van desorptie) en electrospray ionisatie (ESI) (bijvoorbeeld soft-ionisatie ) worden gecombineerd. Een van de grote voordelen van MALDESI is de inherente veelzijdigheid. In MALDESI experimenten, kan een ultraviolet (UV) en infrarood (IR) laser gebruikt om resonant exciteren van een endogene of exogene matrix. De keuze van de matrix niet analytafhankelijke en hangt uitsluitend af van de golflengte laser voor excitatie. IR-MALDESI experimenten wordt een dunne laag ijs afgezet op het monsteroppervlak als energieabsorberende matrix. De IR-MALDESI source geometrie is geoptimaliseerd met behulp van statistische opzet van experimenten (DOE) voor de analyse van vloeibare monsters, alsook biological weefselmonsters. Bovendien is een robuuste IR-MALDESI beeldbron ontwikkeld, waarbij een afstembare mid-IR laser wordt gesynchroniseerd met een computergestuurde XY translationele fase en een hoog oplossend vermogen massaspectrometer. Een aangepaste grafische gebruikersinterface (GUI) biedt de gebruiker de keuze van de herhalingsfrequentie van de laser, het aantal opnamen per voxel, stap-omvang van de steekproef podium, en de vertraging tussen de desorptie en scan evenementen voor de bron. IR-MALDESI is gebruikt in diverse toepassingen zoals forensische analyse van vezels en pigmenten en MSI biologische weefselsecties. Verdeling van verschillende analyten variërend van endogene metabolieten exogene xenobiotica in weefselcoupes kunnen worden gemeten en gekwantificeerd met behulp van deze techniek. Het protocol beschreven in dit manuscript beschrijft de belangrijkste stappen die nodig zijn voor de IR-MALDESI MSI van het hele lichaam weefsel secties.

De beelden weergegeven in figuur 4 tonen de ruimtelijke verdeling van metabolieten in verschillende organen in de weefselsectie gehele lichaam. Unieke m / z waarden voor specifieke gebieden van het lichaam gevonden met MSiReader PeakFinder, gevolgd door batchverwerking voor het genereren. Het beeld overlay gereedschap (Afbeelding 3-4) werd gebruikt om het optische beeld genomen voordat ijs matrix afzetting met de resulterende ion kaarten af te s...

Een massaspectrometrie-beeldvormingsbron (MSI) die op atmosferische druk werkte, werd ontwikkeld door mid-infrarood laserdesorbentie te koppelen met post-ionisatie door middel van elektrospray. Exogeen ijsmatrix werd gebruikt als de energieabsorberende matrix om resonante desorbentie van weefselgerelateerd materiaal te vergemakkelijken. Dit manuscript biedt een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van IR-MALDESI MSI van een neonatale muis in zijn geheel.

Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Het algemene doel van dit protocol is om de belangrijkste stappen te beschrijven die nodig zijn voor IR-MALDESI-massaspectrometrie-imaging van volledige lichaamsweefselsneden. Deze methode kan effectief antwoord geven op kernvragen binnen het vakgebied van massaspectrometrie-imaging, zoals het onderscheiden van de ruimtelijke distributie van endogene en exogene analyten in meerdere organen tegelijkertijd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze bij atmosferische druk werkt en dat de exogene ijsmatrix helpt om variaties in het watergehalte in verschillende organen te compenseren.Hoewel dit protocol inzicht biedt in gerichte beeldvorming van het gehele lichaam, kan IR-MALDESI-massaspectrometrie-beeldvorming ook worden toegepast voor gerichte en kwantitatieve analyse van de drugverdeling. Het volgende protocol beschrijft hoe IR-MALDESI-MSI-experimenten kunnen worden uitgevoerd.Uitgebreide details over de geoptimaliseerde geometrie van de IR-MALDESI-bron en de synchronisatie hiervan met de laser, de tafel en de massaspectrometer zijn elders te vinden. Draag bij het voorbereiden van het specimen beschermende handschoenen en breng een laag OCT-inbeddingsmedium aan op een

whole-body-mass-spectrometry-imaging-infrared-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie (DESI-MS) is een ambient methode waarbij monsters, met inbegrip van biologische weefsels, kunnen worden afgebeeld met een minimale monstervoorbereiding. Door rastering het monster onder de ionisatie-elektrode, deze spray-gebaseerde techniek voldoende ruimtelijke resolutie om moleculaire kenmerken van belang te onderscheiden binnen coupes.

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming van kleine moleculen, protocollen voor het gebruik van DT voor de MALDI beeldvorming van endogene lipiden op de oppervlak van het weefsel secties door positieve-ion MALDI-MS op een ultrahoge resolutie quadrupool-FTICR instrument worden hier gegeven.

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Massaspectrometrische imaging (MSI) is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om verschillende chemische stoffen ontdekken en identificeren intacte weefsels behoud van de verbindingen in hun eigen omgeving, waarin nieuwe inzichten in biologische processen kunnen leveren. Hierin een MSI werkwijze ontwikkeld voor de analyse van kleine moleculen beschreven.

MALDI-Massaspectrometrische Imaging voor onderzoek naar metabolieten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wortelknolletjes

Moleculaire beeldvorming met laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie gebaseerde imaging massaspectrometrie (MALDI-IMS) kan de gelijktijdige koppeling van meerdere analyten in biologische monsters. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en de visualisatie van amyloïde β eiwit op weefsels van de hersenen van Alzheimer en Cerebrale amyloïde angiopathie monsters met behulp van MALDI-IMS.

Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

Dit protocol beschrijft enkelcel massaspectrometrie beeldvorming van OVCAR-8-cellen met behulp van desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan Orbitrap-massaspectrometers voor metabolomische analyse met hoge ruimtelijke resolutie.

Single-cell massaspectrometriebeeldvorming met desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan orbitrap-massaspectrometers

Secundaire electrospray ionisatie massa spectrometrie (Sesi-MS) kan de detectie van vluchtige organische stoffen (VOS), zonder de noodzaak voor een monstervoorbehandeling. Dit protocol bevat instructies voor het snel (binnen minuten) karakterisering van bacteriële VOS met behulp van Sesi-MS.

Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS)

Dit protocol zal de extractie en analyse van vrije en geësterde bioactieve vetzuren uit cellen demonstreren. Vetzuren worden nauwkeurig gekwantificeerd met behulp van stabiele isotoopverdunning, chirale vloeistofchromatografie, electronenvangst-atmosferische chemische ionisatie-meervoudige reactiebewaking massaspectrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

Onsterfelijk kankercellijnen kunnen worden gekweekt als 3D celculturen, een waardevol model voor biologisch onderzoek. Dit protocol beschrijft massaspectrometrie beeldvorming van de 3D celculturen, waaronder verbeteringen in de monstervoorbereiding platform. Het doel van dit protocol is om gebruikers te instrueren om 3D celculturen voor te bereiden op massaspectrometrie imaging-analyse.

Monstervoorbereiding Strategieën voor massaspectrometrie Imaging van 3D celkweekmodellen

Leer IR-MALDESI massaspectrometrie imaging voor gehele lichaamsweefselanalyse bij neonatale muizen. Deze methode maakt gelijktijdige detectie van endogene en exogene analyten in meerdere organen mogelijk.

Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI)

Meer video's verkennen