Immobilisatie van Multi-biokatalysatoren in Alginaat Kralen voor cofactorregeneratiesysteem en verbeterde Herbruikbaarheid

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om het gebruik van een gekoppeld whole-cell biocatalytisch systeem te demonstreren, geïmmobiliseerd in alginaatkralen, voor een verbeterde productieopbrengst en herbruikbaarheid. Dit is mijn onderwerp, waarbij ik antwoord heb gegeven op kernvragen binnen het veld van de biocatalyse, zoals de immobilisatie van biocatalysatoren, stabiliteit, cofactor-regeneratie en whole-cell biocatalysatoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige maar flexibele benadering biedt voor de verbeterde productie van vele belangrijke biomoleculen via cofactor-afhankelijke pathways.

In dit protocol worden twee recombinante E. coli-stammen gebruikt: SpNOx E. coli, die NADH-oxidase tot expressie brengt, en HjLAD E. coli, die L-arabinitol-dehydrogenase tot expressie brengt. Aangezien deze procedure voor beide E. coli-stammen identiek is, zal deze enkel worden gedemonstreerd voor HjLAD E. coli.

Inoculeer een enkele kolonie HjLAD E coli in drie milliliters LB-medium, aangevuld met 15 micrograms per milliliter Ket-A-My-Sin, en incubeer dit overnacht in een schudincubator. Verdun de volgende dag de cultuur in een verhouding van 1:100 in 200 milliliters vers LB met 15 micrograms per milliliter Ket-A-My-Sin, en incubeer bij 37 degrees Celsius bij 250 RPM totdat de OD 600 ongeveer 0,6 bereikt. Induceer de expressie van het HjLAD-eiwit door 0,1 millimolar IPTG aan het cultuurmedium toe te voegen en zes uur te incuberen bij 25 degrees Celsius en 200 RPM.

Oogst de geïnduceerde cellen door centrifugatie bij 3200 ×g en vier °C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant en ga verder met het verwerken van de celpellet zoals gedemonstreerd in het volgende segment. Om deze procedure te starten, suspenderen we de celpellets van HjLAD E coli en SpNox E coli afzonderlijk in 50 mM Tris-Hcl buffer, bij een celdichtheid van vijf gram droog celgewicht per liter.

Meng in een rondbodembuis van 14 milliliter 600 µL HjLAD E. coli (vijf gram droog celgewicht per liter), 600 µL SpNOx E. coli (vijf gram droog celgewicht per liter), 100 µL 20 mM NAD+, en 150 µL 2 M L-aribinitol. Breng het reactievolume naar 2 mL door 550 µL 50 mM Tris-HCl toe te voegen. Incubeer het reactiemengsel 8 uur op 30 °C en 200 RPM.

Centrifugeer het mengsel na acht uur 10 minuten bij 3200 ×g en 4 °C en verzamel het reactiesupernatans. Om de productie van L-xylulose via een colorimetrische assay te kwantificeren, wordt 100 µL van het verzamelde supernatans in een buisje van 1,5 ml opgezogen. Voeg 50 µL 1,5% cysteine, 900 µL 70% zwavelzuur en 50 µL 0,1% Kar-Piz-All opgelost in ethanol toe, en meng voorzichtig door het buisje drie keer om te keren.

Incubeer het reactiemengsel gedurende 20 minuten bij 37 °C en 200 RPM. Meet de optische absorptie van het reactiemengsel bij 560 nm met behulp van een spectrophotometer. Start het immobilisatieprotocol door een 4% alginaatoplossing voor te bereiden.

Voeg 0,8 gram natriumalginaat toe aan 20 milliliter gedestilleerd water en verhit het mengsel om het natriumalginaat op te lossen. Voeg 600 microliter HjLAD E coli met een droog celgewicht van vijf gram per liter en 600 microliter SpNOx E coli met een droog celgewicht van vijf gram per liter toe aan 1,2 milliliter van de 4% alginaatoplossing. Meng de cellen en het alginaat door voorzichtig te pipetteren om bubbelvorming te voorkomen.

Om de vorming van alginaatkralen met een uniforme grootte, morfologie en stijfheid te garanderen, is het cruciaal om de cel-alginaatsuspensie vanuit een optimale afstand langzaam en druppelsgewijs toe te voegen aan een voldoende volume calciumchlorideoplossing om alle kralen te bedekken. Zuig de cel-alginaatsuspensie met een naald in een spuit en voeg het mengsel vervolgens druppelsgewijs toe aan een 0,3 molar calciumchlorideoplossing in een bekerglas van 100 milliliter onder voortdurend roeren. Laat de kralen twee tot drie uur bij kamertemperatuur zonder roeren in de calciumchlorideoplossing staan om crosslinking mogelijk te maken.

Giet de calciumchloride-oplossing af zonder de kralen te verstoren door de calciumchloride-oplossing voorzichtig in een conische buis van 15 milliliter te gieten. Breng de resterende kralen over naar een andere conische buis van 50 milliliter. Was de kralen met 50 millimolair Tris-HCl-buffer om overtollig calciumchloride en niet-ingekapselde cellen te verwijderen.

Voeg 10 milliliters buffer toe aan de beads en laat de suspensie drie tot vijf minuten ongestoord staan. Zodra de beads naar de bodem zakken, wordt de buffer in een andere houder gegoten. Was de beads op deze wijze drie keer.

Centrifugeer de beads in geen enkele stap, anders zullen ze scheuren. Gooi de gebruikte Tris-HCl wasbuffer niet weg. Trek de 30 milliliters gebruikte wasbuffer samen met de eerder opgevangen gebruikte calciumchloride-oplossing op.

Pellet de niet-geïmmobiliseerde E coli-cellen door de verzamelde calciumchloride- en Tris-HCl-oplossing 20 minuten te centrifugeren bij 3200 ×g. Breng de gewassen beads over naar een buis. Evalueer vervolgens de biosynthese van L-xylulose volgens de procedure die is gedemonstreerd voor de celpellets, maar gebruik alle gewassen beads in plaats van de celpellets.

Om de stabiliteit van de geïmmobiliseerde biocatalysatoren voor de productie van L-xylulose te beoordelen, worden de kralen verzameld nadat ze zijn gevormd. Was deze vervolgens tweemaal met 10 milliliter 50 millimolaire Tris-HCl buffer zonder centrifugatie, zoals eerder beschreven. Gebruik alle gewassen kralen om de reactie voor de productie van L-xylulose uit te voeren zoals eerder gedemonstreerd.

Kwantificeer de L-xylulose-productie met een colorimetrische assay, zoals eerder gedemonstreerd. Herhaal de L-xylulose-productiereactie voor het gewenste aantal productiecycli en meet de hoeveelheid geproduceerde L-xylulose in het reactiesupermataan bij elke cyclus. De L-xylulose-productie wordt versterkt door dit gekoppelde whole-cell biocatalytische systeem.

Uitgaande van een beginconcentratie van 150 millimolair L-aribinitol, leverde het gebruik van alleen de HjLAD E coli biocatalysator een opbrengst van 79% L-xylulose op. Ter vergelijking leverde het gebruik van HjLAD E coli en SpNOx E coli cellen in een verhouding van één op één een opbrengst van 96% L-xylulose op. Een evaluatie van de parameters die de efficiëntie van de immobilisatie van de biocatalysator beïnvloeden, toonde aan dat de efficiëntie toeneemt bij een stijgende natriumalginaatconcentratie in het bereik van één tot drie procent.

Echter resulteerden natriumalginaatconcentraties hoger dan 2% in een verlaagde opbrengst aan L-xylulose. Met gebruik van een natriumalginaatconcentratie van 2% werd de optimale calciumchlorideconcentratie voor immobilisatie en L-xylulose-opbrengst bepaald op 0,3 M. De herbruikbaarheid van de biokatalysator werd beoordeeld.

In deze grafiek wordt de L-xyluloseproductie gedurende zeven opeenvolgende cycli van hergebruik van geïmmobiliseerde en vrije gekoppelde gehele-cel biocatalysatoren respectievelijk in donkergrijs en lichtgrijs weergegeven. Hoewel de maximale opbrengst aan L-xylulose door geïmmobiliseerde gekoppelde gehele-cel biocatalysatoren lager is dan bij een systeem met vrije gekoppelde gehele cellen, wordt de herbruikbaarheid verbeterd door immobilisatie. Aan het einde van zeven cycli van opeenvolgend hergebruik behielden de geïmmobiliseerde biocatalysatoren hun stabiliteit en behielden zij 65% van de oorspronkelijke L-xylulose opbrengst.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biocatalyse om de opbrengsten van volledige multi-cel biocatalysatoren en de belangrijkste reacties waarbij cofactoren betrokken zijn, te onderzoeken.