Het beoordelen van Primary neurogenese in Xenopus Embryo's met behulp van Immunokleuring

Het algemene doel van dit experiment is om snelle en gemakkelijke visualisatie van verschillende populaties van neuronale cellen in de zich ontwikkelende xenopus embryonale hersenen mogelijk te maken. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van primaire neurogenese, zoals het observeren van het regulatieproces van neuronale differentiatie in het centrale zenuwstelsel van xenopus. Het grote voordeel van deze techniek is dat het gelijktijdige observatie van het neurale stamcel-progenitorpool mogelijk maakt, evenals een gedifferentieerd primaire neurale pool binnen een enkele proef.

Om deze procedure te beginnen, zuigt voorzichtig vijf tot tien embryo's uit de glazen fles met een plastic of glazen pipet zonder luchtbellen te introduceren. Breng de embryo's over in de montagekamer en observeer onder een stereoscoop. Vul de montagekamer met gelatine-oplossing om de stijfheid van het sectieblok te garanderen.

Leg vervolgens de embryo's zij aan zij met behulp van een paar fijne pincetten. Markeer de hoofdoriëntatie door een pijl op de rand van de kamer te tekenen met een cryogene-compatibele marker. Voor meerdere groepen embryo's, schrijf de beschrijving van elke groep op de rand van de overeenkomstige kamer.

Plaats vervolgens de kamer horizontaal in een schuimdoos half gevuld met droog ijs. Sluit het deksel en laat de montagekamer een voor een vijf tot tien minuten bevriezen. Ga daarna verder met cryosectie of bewaar bevroren monsters op 80 graden Celsius gedurende ten minste één tot twee weken zonder immunogeniciteit te verliezen.

Verwijder in deze procedure het bevroren monsterblok uit de kamer door de onderkant van de kamer te drukken met een stompe stok of een vinger. Voeg vervolgens verschillende druppels weefselvriesmedium toe op de monsterstandaard. Monteer het monsterstuk met het voorste uiteinde van de embryo's omhoog en laat het gemonteerde blok ongeveer een minuut in de cryostatenkamer staan, of tot het weefselvriesmedium troebel wordt.

Installeer onmiddellijk de monsterstandaard op de microtoom met de onderkant van het monsterstuk omhoog. Trim een deel van het monsterstuk met een mes wanneer het monsterstuk nog relatief zacht is. Laat vervolgens de monsterstandaard minimaal vijf minuten op de microtoom staan om de temperatuur in evenwicht te brengen.

Trim daarna geleidelijk het monsterstuk totdat de koppen van de kikkervisjes zichtbaar zijn door de doorschijnende gelatine. Om de trimsnelheid te verhogen, verhoog de dikte van de sectie. Controleer de prestaties van de cryostat, zoals de scherpte en hoek van het mes, om ervoor te zorgen dat de volgende secties in een lange strook worden gegenereerd.

Zodra de koppen van de kikkervisjes zichtbaar worden, stel de instellingen van de cryostat terug naar normaal, om ervoor te zorgen dat de voltooide plakjes stroken kunnen vormen en niet overlappen of aan het mes plakken. Ga dan door met trimmen tot de koppen van de kikkervisjes bijna blootliggen. Veeg alle resterende secties van het podium af voordat u begint met het verzamelen van de monstersecties.

Maak ongeveer 10 tot 15 secties en laat ze een lange strook vormen. Draai de dikke dekglasplaat omzij en verwijder voorzichtig de strook van het mes met een fijne penseel. Leg het vervolgens op het podium met de lange as parallel aan het mes.

Maak 10 tot 15 secties en laat ze een lange strook vormen zonder te breken. Het kan niet gemakkelijk zijn en vereist oefening. Eén truc is om de snelheid niet te hoog op de handwiel aan te brengen.

Draai in plaats daarvan voorzichtig en langzaam het handwiel. Kies vervolgens een positief geladen dia bij kamertemperatuur en label het met een potlood. Druk het vervolgens snel en stevig op de strook met de gelabelde kant naar beneden gericht.

Verwijder vervolgens het dia uit de cryostatenkamer. Herhaal deze stap om 20 tot 30 plakjes parallel op elk dia te rangschikken. Laat de zijden 10 minuten luchtdrogen en ga dan onmiddellijk door naar de immunokleuringsprocedure of bewaar de dia's in een diadoos op 80 graden Celsius gedurende maximaal drie tot zes maanden voordat de immunokleuringsprocedure plaatsvindt.

Hier kunnen we de corresponderende sectievlakken van de voorhersenen, middenhersenen, achterhersenen en het ruggenmerg van een xenopus-kikkervisje zien, die worden gebruikt om positiereferenties te geven voor de volgende afbeeldingen. De corresponderende dwarsdoorsneden, die zijn gekleurd met Anti-Sox 3, Anti-Acetylering Tubuline en DAPI, tonen de relatieve locaties van neurale stamcelpools evenals neurofilamenten binnen de neurale buis. En hier zijn de corresponderende dwarsdoorsneden gekleurd met Anti-MyT1 en DAPI die de relatieve locaties van de gedifferentieerde primaire neuronen binnen de neurale buis tonen.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee uur worden gedaan als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voldoende koeltijd voor het monsterstuk in droog ijs te garanderen. Anders kan het monsterstuk niet hard genoeg zijn en dus moeilijk te snijden.

Na de ontwikkeling van deze techniek heeft het de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van ontwikkelingsneurowetenschap om de neurale differentiatie in xenopus centrale zenuwstelsels te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u secties kunt maken en specifieke pools van neuronale cellen in een xenopus centraal zenuwstelsel kunt observeren.