Name: Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Leer de isolatie en karakterisering van kankerstamcellen uit hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom met behulp van Hoechst dye efflux assay en flowcytometrie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van therapieresistentie en tumorbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Thibault Andrieu en Sebastien Dussurgey van het Flow Cytometry Platform van UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) voor hun advies en hulp tijdens onze sorteerwerkzaamheden. Dit werk werd uitgevoerd binnen het wetenschappelijke kader van ETOILE en Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de plaatselijke richtlijnen voor de verzorging van dieren. Alle details van deze studie werden goedgekeurd door de CECCAPP, een Franse ethische commissie. 1. Selectie van een side population (SP) door de Hoechst Dye Efflux Assay <ol><li> Kleuring 50.000.000 cellen met Hoechst 33342 kleurstof. <ol><li> Bereid twee 15 ml steriele buizen met een conische bodem: één buis met het label &quot;Hoechst&quot; en één label &quot;Hoechst en Verapamil&quot;. Bereid 10 ml van 5 mM Verapamilhydrochloride oplossing in steriel water. Bereid het kweekmedium (CM) voor stamcellen. <ol><li> CM CSC (CM-CSC) te bereiden, combineren de volgende: Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% foetaal kalfsserum (FCS), 0,04 mg / l hydrocortison , 100 U / ml penicilline, 0,1 g / l streptomycine en 20 ug / l epidermale groeifactor (EGFR). </li></ol></li><li> Onder een laminaire stroming kap, trypsinize cellen. Verwijder media, wassen met sterile fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,5 g / l) gedurende een 75 cm² kolf. Incubeer 3 min bij 37 ° C. Stop de reactie door het toevoegen van kweekmedium gebruikt voor de ouderlijke cellijn. Tel het aantal cellen met een celteller. <ol><li> Om CM ouderlijke cellijn (CM-P) bereiden, DMEM met 10% FCS, 0,4 mg / l hydrocortison, 100 U / ml penicilline en 0,1 g / l streptomycine). </li></ol></li><li> Verdun de celsuspensie verkregen in stap 1.1.2 10 7 cellen / ml in CM-P te verkrijgen. Splitsing van de celsuspensie in de buizen 2 bereid: put 100 pl (10 6 cellen) in de tube &quot;Hoechst en Verapamil&quot; en 4 ml (4 x 10 7 cellen) in de tube &quot;Hoechst&quot;. </li><li> In het monster &quot;Hoechst en Verapamil&quot;, voeg 10 ul van 5 mM Verapamilhydrochloride oplossing (eindconcentratie: 0,5 mM) en meng voorzichtig. Voeg 5 ul van 1 g / l Hoechst-oplossing (eindconcentratie: 0,1 g / l). In het monster # &amp;34; Hoechst &quot;, voeg 5 ul van 1 g / l Hoechst oplossing per 10 6 cellen (200 pi totaal) voortaan houden samples beschermd tegen directe blootstelling aan licht met behulp van aluminiumfolie.. </li><li> Incubeer alle buizen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur 30 min. Meng voorzichtig om de 15 min om cellen te voorkomen vestigen. </li><li> Centrifugebuizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer elke pellet met 2 ml 1x PBS. </li><li> Centrifugebuizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant. Resuspendeer &quot;Hoechst en Verapamil&quot; pellet in 500 ui 5 mg / L propidium jodide (PI) verdund in PBS-buffer en &quot;Hoechst&quot; pellet in 4 ml van 5 mg / l PI verdund in PBS-buffer. </li><li> Transfer sample oplossingen door een 70 um cel zeef om aggregaten cytometer te verwijderen en het verzamelen van enkele cellen in buizen voor sample opname op de stroom. Houd de monsters op ijs en te beschermen tegen de directe blootstelling aan licht met behulp van aluminiumfolie. </li></ol></li><li> ikvertroosting van de Side Bevolking Exclusief Hoechst kleurstof door Cell Sorting. <ol><li> Voer Hoechst negatieve celscheiding op een flowcytometrie sorter met de volgende parameters: UV laser (355 nm), 2 detectors op de UV laser pad met blauwe Hoechst (BP 450/50) en rode Hoechst (BP 610/20) filters, en 2 verzamelaars. <ol><li> Ten eerste analysemonster &quot;Hoechst&quot; die dient als een positieve controle voor kleuring en flow cytometer opstelling. </li><li> Met behulp van de cytometer software, op het raam &quot;Global werkblad&quot;, klik op &quot;Dot Plot&quot; (vijfde boven foto rechts) en maak een grafiek op de mondiale werkblad. Op coördineren, met een klik met de rechtermuisknop, selecteer FSC-A (forward scatter) en abscis, SSC-A (zijwaartse verstrooiing) (Figuur 1A). Op dezelfde manier, het creëren van een SSC-W versus SCC-H dot plot. Op deze tweede dot plot, een P1 regio te creëren, klikt u op &#39;Polygon gate &quot;(veertiende boven foto rechts) (Figuur 1B) 33. Opmerking: De regio P1omvatten enkele cellen en discrimineren doubletten. </li><li> Optioneel: Uitsluiten PI positieve cellen door het creëren van een FSC-A versus PI gated op P1. Op deze puntdiagram selecteert u de PI negatieve populatie (P2) naar PI positieve dode cellen te sluiten. </li><li> Met behulp van de cytometer software, op het raam &quot;Global werkblad&quot;, klik op &quot;Dot Plot&quot; en maak een grafiek op de mondiale werkblad. Op coördineren, met een klik met de rechtermuisknop, selecteer blue Hoechst-A en X-as, rode Hoechst-A. Met een klik met de rechtermuisknop op de bevolking, selecteer &quot;Show bevolking&quot; en P1. Op deze puntendiagram Maak een gebied (P2) aan de negatieve Hoechst kleurstof side population (SP) cellen die verschijnt als een zijarm aan de linkerkant van de populatie van cellen (figuur 1C) te selecteren. </li></ol></li><li> Analyseer het monster &quot;Hoechst&quot; en het verzamelen van 10.000 gebeurtenissen. Opdat de poort P2, waarbij de SP bevolking vertegenwoordigt, goed gepositioneerd, analyseren monster &quot;Hoechst en Verapamil&quot; (10.000 events)het verdwijnen van SP populatie (figuur 1D) waarnemen. </li><li> Verzamel de SP Hoechst kleurstof negatieve cellen in een 15 ml buis met 1 ml CM-CSC bereid 1.1.1.1. </li><li> Aan het einde van de celsortering Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 ml CM-CSC. Tel het aantal cellen gesorteerd onder toepassing van een celteller passend aantal cellen dragen aan een kweekfles (zie tabel 1). Add CM-CSC en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 atmosfeer. </li><li> Handhaven in kweek onder dezelfde omstandigheden maximaal 2 passages tot er een minimum van 5 x 10 7 cellen (zie stap 3, &quot;Cell kweekmethode&quot;). </li></ol></li></ol> 2. Selectie van de CD44 hoog / ALDH hoge Sub-bevolking in de side population Gesorteerd <ol><li> Kleuring 50 miljoen van de SP Cellen met de ALDH Detection Kit en CD44 Antibody. <ol><li> Bereid zeven 15 ml steriele buizen moeten als volgt: &quot;Ongekleurde&quot; (tube), &quot;CD44-APC&quot; (Tube b), &quot;IgG1-APC&quot; (buis c), &quot;ALDH&quot; (Tube d), &quot;ALDH en DEAB &quot;(Tube e)&quot; ALDH en CD44-APC &quot;(Tube f)&quot; ALDH, DEAB en CD44-APC &quot;(Tube g). Houd alle buizen en reagens bij 4 ° C gedurende de kleuring. </li><li> Bereid buffer A met 4,5 ml van de buffer 1 (in de kit) en 45 gl van CD44-APC (allofycocyanine) antilichaam (verdunning 1: 100). Bereid buffer B met 100 ui buffer 1 en 1 pl IgG1-APC antilichamen (verdunning 1: 100). Bereid buffer C met 4 ml buffer 1 en 20 ui van het reagens van de kit. </li><li> Bereid een celsuspensie van de eerder gesorteerde cellen (stap 1.2.5) en 10 7 cellen / ml. Voeg 100 ul (10 6 cellen) van de celsuspensie a, b en c, en 4 ml (4 x 10 7 cellen) aan de buis f buizen. Op dit moment niet cellen zetten in buizen d, e en g. </li><li> Centrifugeer de buisjes die de cellen bij 250 g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in buizen a, b en c in 100 pl buffer 1. Voeg 5 ui diethylaminobenzaldehyde (DEAB), een ALDH inhibitor buizen e en g. <ol><li> Resuspendeer cellen in buis f met 4 ml reagens C en onmiddellijk over 100 ul in buizen d, e en g. Incubeer alle buizen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 min en beschermen tegen direct licht blootstelling door aluminiumfolie. Meng de celsuspensie voorzichtig door vortexen na 15 min te voorkomen cellen bezinken. </li></ol></li><li> Vanaf dit moment, houden de buizen op ijs en beschermd tegen directe blootstelling aan licht met behulp van aluminiumfolie. Centrifugeer alle buizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Resuspendeer buis f in 4 ml en pijpen b en g met 100 ui buffer A. resuspendeer buis C met 100 gl buffer B. Om de andere buisjes, voeg 100 pl buffer 1. Incubeer 10 min bij 4 °; C. </li><li> Centrifugeer alle buizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. Spoel eenmaal met 1 ml buffer 1 (4 ml van buizen f) en gecentrifugeerd opnieuw bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Resuspendeer buis f pellet in 4 ml en alle andere buizen in 1 ml buffer 1. </li><li> Breng het monster oplossingen door middel van 70 micrometer cel zeven aggregaten cytometer te verwijderen en het verzamelen van enkele cellen in geschikte buizen voor sample opname op flow. </li></ol></li><li> Isolatie van de CD44 hoog / ALDH hoge Cell Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting. <ol><li> Voer CD44 hoog / ALDH hoge celsortering op flowcytometrie sorter met de volgende parameters: De blauwe laser (488 nm) en rode laser (633 nm), 1 detector op de blauwe laser pad met een FITC filter (530/30), 1 detector op de rode laser pad met een APC filter (660/20) en 2 verzamelaars. </li><li> Met behulp van de cytometer software, klik op &quot;Dot Plot &#39;(de vijfde bovenste foto rechts) naar een FSC-A versus SSC-A dot plot te creëren zoals beschreven in paragraaf 1.2.1.2, naar cel morfologie te controleren en selecteer een populatie bestaat uit enkele cellen met een SSC-W versus SSC-H dot plot. </li><li> Met behulp van de cytometer software, op het raam &quot;Global werkblad&quot;, klik op &quot;Dot Plot&quot; en maak een grafiek op de mondiale werkblad. Op coördineren, met een klik met de rechtermuisknop, selecteer APC-A en X-as, FITC-A om de dubbele gebrandschilderde bevolking te selecteren. Een poort gebruikmakend van buizen d en e ALDH hoog cellen (Figuur 2A) selecteren. Opmerking: Positieve cellen verdwijnen buis e behandeld met DEAB (figuur 2B). <ol><li> Op dezelfde chart, het creëren van een tweede poort met behulp van buizen b en c om CD44 hoge cellen (figuur 2C en 2D) te selecteren. Positieve cellen verdwijnen in de buis met IgG1-APC. Analyseer tubes f en g en een derde poort die CD44 high / ALDH &lt;omvatsup&gt; hoog cellen (figuur 2E en 2F). Opmerking: Als positieve cellen aanwezig in de buis met IgG1-APC (figuur 2D) zijn, de interactie tussen cellen en APC-gekleurde antilichaam niet specifiek. </li></ol></li><li> Verzamel CD44 hoog / ALDH hoge cellen in een 15 ml buis met 1 ml CM-CSC. Verzamel ook CD44 low / ALDH laag in een 15 ml buis met 1 ml van CM 19. Let op: Bereid CM-CSC, zoals beschreven in stap 1.1.1.1. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 ml CM-CSC. Tel het aantal cellen gesorteerd. </li></ol></li></ol> 3. Cel Cultuur Methode <ol><li> Na de dubbele sorteren van cellen zoals hierboven beschreven, plaat gesorteerde cellen in een geschikte kolf (tabel 1) met CM-CSC bij 37 ° C met 5% CO2. Na 18-24 uur,controleren of de cellen hebben gehandeld en verander het kweekmedium. Verander het kweekmedium om de 3 dagen tot de groeiende kolonies groter dan 50% confluent. </li><li> Met de juiste hoeveelheid trypsine 0,5 g / L - EDTA (tabel 1) om cellen trypsinize van de kolf. Incubeer cellen 3-5 minuten bij 37 ° C. Voeg de juiste hoeveelheid CM-CSC (tabel 1) de werking van trypsine te stoppen. </li><li> Tel het aantal cellen verkregen en plaat 4 x 10 5 cellen in een 175 cm² kolf met CM-CSC. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Bij deze concentratie wordt cellen met een verdubbelingstijd van 24 uur 70% confluent in 7 dagen. </li><li> Gebruik CSCs in vitro of in vivo experimenten voordat ze 3 passages ondergaan. </li></ol> 4. Bevestiging van de Tumor Potentiële en CSC Kenmerken <ol><li> Tumor Sphere Vorming aan de tumor potentieel van de CD44 hoog / ALDH Bevestigenhoog Cells. <ol><li> Trypsinize cellen zoals beschreven in 3.2. Voeg 1 x 10 6 cellen om een 15 ml buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in een DMEM: F12 (3: 1) medium FCS vrij, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparine en 1 x B27. Incubeer cellen in een 6 goed laag verankering platen kolf bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: Gebruik DMEM: F12 (3: 1) medium dat 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparine en 1 x B27 als cellen niet groeien zonder FCS. </li><li> Neem de tumorvorming bol met een optische microscoop van 4 tot 10 dagen na zaaien (Figuur 3A). Opmerking: Tumor boldiameter moet meer zijn dan 35 urn. CD44 high / ALDH hoge cellen zal een snellere en meer uitgebreide tumor bol formatie in termen van het aantal en de omvang ten opzichte van CD44 low / ALDH lage tonen. </li></ol></li><li> Evaluatie van de In Vivo tumorigeniciteit NaSubcutane injectie van CD44 hoog / ALDH hoge Cellen in NOD-SCID muizen. <ol><li> Na het sorteren resuspendeer cellen in PBS bij drie verschillende concentraties (10 4 cellen / ml, 10 5 cellen / ml, en 10 6 cellen / ml). Injecteer subcutaan 100 gl 10 4 cellen / ml (10 3 cellen) in de rechter flank regio 6 muizen. Doe hetzelfde voor 10 5 cellen / ml (10 4 cellen), en 10 6 cellen / ml (10 5 cellen). Opmerking: Lager dan 10 verdunning 3 cellen kunnen worden getest. </li><li> Injecteren dezelfde concentratie van CD44 low / ALDH laag cellen in de linker flank regio. Monitor geïnjecteerde muizen gedurende maximaal 10 weken tot tumorprogressie 19 zien. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li>
<li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Dalerba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+colorectal+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).</li>
<li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumorigenic+subpopulation+with+stem+cell+properties+in+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas.</a> Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).</li>
<li>Prince, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+cells+with+cancer+stem+cell+properties+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Soltanian, S., Matin, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and cancer therapy.</a> Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Normal+stem+cells+%27Jedi%27+that+went+over+to+the+%27dark+side.%27%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'.</a> Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+and+chemoresistance+of+CD133%2B+cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma.</a> Mol Cancer. 5, 67(2006).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+Cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Bertrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Head+and+Neck+Cancer+Stem+Cells+to+Overcome+Resistance+to+Photon+and+Carbon+Ion+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+tumor+stemness+by+increasing+the+invasive+and+tumorigenic+side+population+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction.</a> Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).</li>
<li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li>
<li>Chen, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+concept+in+progression+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer.</a> J Oncol. 2009, 894064(2009).</li>
<li>Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+oral+squamous+cell+carcinoma+possesses+tumor+stem+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes.</a> Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+CD133%28%2B%29+cancer+stem-like+cells+characterized+in+human+oral+squamous+cell+carcinoma+confer+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy.</a> Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).</li>
<li>Sun, S., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+neck+squamous+cell+carcinoma+c-Met%E2%81%BA+cells+display+cancer+stem+cell+properties+and+are+responsible+for+cisplatin-resistance+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis.</a> Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+putative+marker+for+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).</li>
<li>Lim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li>
<li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li>
<li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li>
<li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+properties+of+CD44%2B+cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li>
<li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44%28%2B%29ALDH1%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li>
<li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li>
<li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeinelt%2C+E+%22Technical+Bulletin%3A+Standardizing+Application+Setup+Across+Multiple+Flow+Cytometers+Using+BD+FACSDiva+Version+6+Software%22">Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software</a>. , BD Biosciences. (2012).</li>
<li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li>
<li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li>
<li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li>
<li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2%2FNeu+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een betrouwbare werkwijze voor de succesvolle isolatie van CSCs van een bepaalde cellijn die voor andere HNSCC cellijnen. Geïsoleerde hoofd en nek CSCs zijn dan geschikt voor verdere moleculaire karakterisering in vitro en functionele validatie door transplantatie in immunodeficiënte muizen 19. Toch kunnen enkele wijzigingen worden getest, afhankelijk van de kant bevolking of het CD44 hoog / ALDH hoge percentages in de ouderlijke cellijn. Bijvoorbeeld, in...

Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is een veel voorkomende maligniteit wereldwijd en ondanks de vooruitgang in de huidige behandelingen, patiënten met een gevorderde ziekte hebben een slechte prognose. De overall 5 jaars overleving van de patiënt is ongeveer 30%, ondanks de combinatie van therapeutische benaderingen met inbegrip van de operatie, chemo-radiotherapie en doelgerichte therapieën. Recente studies attribuut lokaal recidief en metastasen op afstand voor het overleven van kanker stamcellen-achtige cellen (CSC) na therapieën tegen kanker 1. Er is een groeiend bewijs dat er cellen presenterende eigenschappen stamcellen (ongedifferentieerde status zelfvernieuwing en differentiatie capaciteiten en telomerase-activiteit) in verschillende vaste tumoren zoals borst-, hersenen, prostaat, long, colon, pancreas, lever en huid 2- 10. Echter, de oorsprong van CSCs blijft onduidelijk 11,12. Zij kunnen het gevolg zijn van de kwaadaardige transformatie van normale stamcellen 3,13 of dedifferentiatie van tumorcellen die CSCs-achtige functies 14,15 verwerven. Daarom is het begrijpen van onderscheidende trajecten met betrekking tot CSCs zal inzicht geven in de vroege diagnose en behandeling van resistente HNSCC. Het is voorgesteld dat CSCs ook resistente fenotypen die standaard chemotherapie en radiotherapie ontwijken, waardoor tumorrecidief bezitten in vergelijking met het grootste deel van tumorcellen 16-19 en zijn gelokaliseerd in hypoxische niches 20. Talrijke factoren zijn voorgesteld om deze resistenties van CSCs, zoals neiging tot rust, versterkt DNA herstel, opwaarts gereguleerd celcyclus controlemechanismen en vrije radicalen 21 uitleggen. Bovendien hebben verschillende oncogene moleculaire pathways kan worden bepaald in CSCs 17 geactiveerd. Om kennis CSCs verdere doelgerichte therapie verbeteren moeten we betrouwbare methoden voor de identificatie en isolatie van CSCs, vanwege de heterogeniteit van stamcellen gerelateerde merkers inverschillende vormen van kanker 22. In HNSCC, stam-achtige tumor-initiërende cellen zijn geïsoleerd uit primaire tumoren van patiënten door het sorteren cellen die verschillende CSC biomarkers (zoals drugs transporters 23 expressie, CD44 hoog, laag CD133 CD24 hoog, c-Met + fenotype 10,24, 25, of ALDH hoge activiteit 26) of het kweken van de primaire tumor patiënt te squamospheres dat CSC eigenschappen te vormen. Toch is het aantal squamospheres dramatisch af na twee passages, waardoor een kleine steekproef voor verdere karakterisering bestudeert 27. Daarom is in vitro testen uitgaande van gevestigde cellijnen is een eenvoudiger oplossing voor experimenten te ontwerpen met het oog op de kennis van CSCs verbeteren. Het doel van dit artikel is een werkwijze te CSCs van HNSCC cellijnen te isoleren middels Multiparametrische flowcytometrische analyse een voorstelnd celsortering. De expressie van CD44 gecorreleerd met verschillende eigenschappen, waaronder CSCs ALDH activiteit side population (SP) fenotype, sferoïde vorming vermogen en tumorigeniciteit worden gebruikt voor het isoleren en karakteriseren onderpopulatie CSCs. CD44, een celoppervlak glycoproteïne is betrokken bij celadhesie en migratie. CD44 is sterk uitgedrukt in vele solide tumoren CSCs 28, met inbegrip van hoofd- en halskanker modellen 29-31. Bovendien kan CD44 hoge cellen te genereren in vivo een heterogene tumor terwijl CD44 laag cellen kunnen niet 10. De SP test is gebaseerd op de differentiële potentie van cellen aan de Hoechst kleurstof 22 uitstromen via de ATP-bindende cassette (ABC) transporter familie van eiwitten tot overexpressie in de CSC membraan. Deze test omvat het gebruik van ABC transporter remmers zoals verapamil in controlemonsters. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) is een intracellulair enzym dat betrokken is bij het omzetten van retinol RETinoic zuur tijdens de vroege stamcel differentiatie 25,26. Cellen die hoge ALDH activiteit vertonen stamcellen-achtige cel gedrag in HNSCC 26 en een zeer klein aantal van ALDH hoge cellen vertonen in staat zijn om tumoren te genereren in vivo 26,32. De combinatie van deze merkers en eigenschappen werd met succes gebruikt door Bertrand e t al. De-resistentie in vitro en in vivo van deze CSCs Photon en koolstof ionenstraling 19. De resultaten toonden duidelijk aan dat de combinatie van verschillende celmerkers en eigenschappen zijn selectiever voor nuttige studies op HNSCC CSC populaties dan één marker benaderingen.

<table><tbody><tr><td>Fetal Calf Serum Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison oplosbaar in water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>De oplossing moet direct voor gebruik worden bereid omdat deze zeer onstabiel is</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), zonder vitamine A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Corrosief, acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing) categorie 4</td></tr><tr><td>Verapamilhydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing) categorie 3</td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing) categorie 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, humaan antilichaam</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, humaan antilichaam</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 coulter-deeltje</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Optische microscoop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B-cellijn</td><td>Gift van het John Little&rsquo;s Laboratory</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FaDu-cellijn</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Platen met lage verankering</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva-software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van stem cell kenmerken

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Ondanks de vooruitgang in het begrijpen van het hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) progressie, de vijf-jaarsoverleving blijft laag als gevolg van lokaal recidief en metastasen op afstand. Eén hypothese om dit te verklaren herhaling is de aanwezigheid van kanker-achtige cellen stamcellen (CSC) die inherent chemo- en radio-weerstandsvermogen. Om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is het noodzakelijk experimentele modellen die de effectiviteit van gerichte behandelingen te valideren en derhalve betrouwbare methoden voor de identificatie en isolatie van CSCs hebben. Hiervoor presenteren we een protocol voor de isolatie van CSCs uit humane HNSCC cellijnen die is gebaseerd op de combinatie van twee opeenvolgende cellen sorteringen uitgevoerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). De eerste is gebaseerd op de eigenschap van CSCs tot overexpressie ATP-bindende cassette (ABC) transporter eiwitten en dus uitgesloten, onder andere vitale DNA kleurstoffen zoals Hoechst 33342. De cellen gesorteerd met thmethode wordt aangeduid als een &quot;side population&quot; (SP). Aangezien de SP cellen vormen een klein percentage (&lt;5%) van de ouderlijke cellen, een groeifase is noodzakelijk om het aantal te verhogen voordat de tweede celsortering. Vervolgens maakt de selectie mogelijk van cellen die bezitten twee HNSCC stamcellen kenmerken namelijk hoog expressieniveau van het celoppervlak marker CD44 (CD44 hoog) en de overexpressie van aldehyde dehydrogenase (ALDH hoog). Aangezien het gebruik van een enkele marker talrijke beperkingen en valkuilen voor de isolatie van CSCs de combinatie van SP, zal CD44 en ALDH markers een nuttig instrument CSCs verdere analytische en functionele assays die levensvatbare cellen te isoleren verschaffen. De steel-achtige kenmerken van CSCs werd uiteindelijk bevestigd in vitro door de vorming van tumorispheres en de expressie van β-catenine.

De isolatie van CSCs van HNSCC cellijnen vereist twee opeenvolgende sortering vanwege het lage percentage CSCs in de ouderlijke cellijn. De eerste sortering is gebaseerd op het vermogen van CSCs de Hoechst kleurstof door middel transporters sluiten. Dit resulteerde in de verwerving van 1-5% van de totale celpopulatie gesorteerd (figuur 1). Tijdens de Hoechst kleurstof negatieve cel sortering, controleer dan de grootte en de granulatie van gesorteerde cellen door te kijke...

Het begrijpen van de rol van kanker-stamcel-achtige cellen bij tumorrecidieven en resistentie tegen therapieën is in het afgelopen decennium een onderwerp van groot belang geworden. Dit artikel beschrijft de isolatie en karakterisering van de subpopulatie van kanker-stamcel-achtige cellen uit hoofd-hals-plaveiselcelcarcinoom cellijnen (HNSCC).

Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van kankerstamcellen uit cellijnen van het hoofd-halsplatmetaceelcarcinoom of HNSCC. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het veld van de kankerbehandeling over hoe chemotherapie kan worden ingezet om tumor-radioresistentie te overwinnen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er een combinatie van markers wordt gebruikt om een hoge specificiteit te bereiken bij kankerstamcellen uit HNSCC-cellijnen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Prescillia Battiston-Montagne, onze technicus, en Marion Gilormini, een PhD uit mijn lab. Om een side population van kankerstamcel-achtige cellen te selecteren via een Hoechst-kleurstof efflux-assay, labelt u eerst één conische buis als Hoechst en één als Hoechst en Verapamil. Was vervolgens een HNSCC-celcultuur met steriele PBS, gevolgd door de toevoeging van één milliliter Trypsine EDTA.Stop na drie minuten bij 37 °C de reactie met vers celkweekmedium en tel de cellen. Verdun de cultuur tot 1 × 10⁷ cellen per milliliter in volledig medium voor de parentale cellijn. Voeg vervolgens 100 µL Hoechst en Verapamil toe aan de Hoechst- en Verapamil-buis en 4 mL cellen aan de Hoechst-buis.Meng vervolgens voorzichtig 10 µL van een 5 mM Verapamilhydrochloride-oplossing in het Hoechst- en Verapamil-monster, gevolgd door 5 µL Hoechst per 1 × 10⁶ cellen in beide buizen. Dek de monsters daarna af met aluminiumfolie en plaats ze bij 37 °C. Centrifugeer de buizen na 90 minuten, waarbij elke 15 minuten voorzichtig werd gemengd, en resuspendeer de pellets in 2 mL PBS.Na een centrifugatie in het midden, resuspendeer het pellet met Hoechst en Verapamil in 500 microliters propidiumjodide in PBS en het Hoechst-pellet in vier milliliters van hetzelfde. Filter de monsters nu door 70-micron celzeefjes in FACS-buisjes om aggregaten te verwijderen en plaats de monsters op ijs, beschermd tegen licht. Laad vervolgens het Hoechst-monster in de flowcytometer en open het venster Global Worksheet in de software van de flowcytometer.Klik op Dot Plot om een grafiek op het Global Worksheet te maken en klik met de rechtermuisknop om de parameters voor forward en side scatter te selecteren. Maak op dezelfde manier een dot plot van side scatter wide tegenover side scatter height en klik vervolgens op polygon gate om een P1-regio in de tweede grafiek te creëren om de enkelvoudige cellen te selecteren en de doubletten te onderscheiden. Maak vervolgens een dot plot van red Hoechst area tegenover blue Hoechst area en klik met de rechtermuisknop op de cellen om de P1-populatie te markeren.Maak vervolgens een P2-regio aan om de negatieve Hoechst-kleurstof side population van cellen te selecteren, die verschijnt als een zijtak links van de hoofdpopulatie cellen, en verzamel 10.000 events van de Hoechst-monsters. Om te bevestigen dat de P2-gate die de side population vertegenwoordigt correct is geplaatst, verzamelt u ook 10.000 Hoechst- en Verapamil-monsterevents. De side population zou moeten verdwijnen.Sorteer vervolgens de zijpopulatie van Hoechst-kleurstofnegatieve cellen in een conische buis van 15 milliliter met één milliliter volledig kankerstamcelmedium. Centrifugeer de cellen na afloop van de sortering en resuspendeer de pellet van de zijpopulatie in één milliliter vers volledig kankerstamcelmedium. Tel vervolgens de cellen en zaai ze in het juiste aantal uit in een nieuwe kweekfles.Om de CD44-hoog/ALDH-hoog subset te selecteren uit de gesorteerde side population-cellen, label eerst zeven steriele conische buizen van 15 milliliter zoals aangegeven. Verdun vervolgens de gesorteerde cellen tot 1 × 10⁷ cellen per milliliter in stamcelmedium en verdeel op ijs 100 µL cellen over de ongesteinde CD44-APC en IGG1-APC buizen en 4 mL cellen over de ALDH en CD44-APC buis. Centrifugeer de cellen en resuspendeer de ongesteinde CD44-APC en IGG1-APC pellets in 100 µL buffer one van de ALDEFLUOR kit.Voeg vervolgens vijf microliters van de ALDH-remmer DEAB toe aan de buizen ALDH, ALDH en DEAB, en ALDH DEAB en CD44-APC. Resuspendeer de cellen in de buis ALDH en CD44-APC in vier milliliters reagens C, bestaande uit vier milliliters buffer één en 20 microliters van het reagens uit de kit, en breng onmiddellijk 100 microliters van deze cellen over naar de buizen ALDH, ALDH en DEAB, en ALDH DEAB en CD44-APC. Plaats vervolgens alle buizen gedurende 30 minuten in een waterbad van 37-degrees Celsius, beschermd tegen licht, waarbij de monsters na 15 minuten voorzichtig worden gemengd door middel van vortexen.Centrifugeer aan het einde van de incubatie alle monsters en verwijder de supernatanten. Plaats vervolgens alle buisjes op ijs en resuspendeer het ALDH- en CD44-APC-pellet in vier milliliter buffer A, en de CD44-APC- en ALDH DEAB- en CD44-APC-pellets in 100 microliters van dezelfde buffer. Resuspendeer het IGG1-APC-pellet in 100 microliters buffer B en de ongekleurde ALDH- en ALDH- en DEAB-buisjes in 100 microliters buffer één.Centrifuge na 10 minuten alle monsters opnieuw en volg dit met een wasbeurt in 1 milliliter buffer één voor alle monsters, behalve het ALDH- en CD44-APC-monster, dat wordt gewassen in vier milliliter buffer één. Resuspendeer na de tweede centrifugatie alle pellets in één milliliter verse buffer één, behalve het ALDH- en CD44-APC-monster, dat wordt geresuspendeerd in vier milliliter buffer één. Plaats nu de ALDH- en CD44-APC-buis in de flowcytometer en maak een APC-door-FITC-dotplot om de dubbelgekleurde populatie te visualiseren.Laad vervolgens de ALDH-buis om een gate voor ALDH-high cellen te maken. De positieve cellen moeten verdwijnen wanneer de ALDH- en DEAB-buis wordt geladen. Maak in dezelfde grafiek een tweede gate met de CD44-APC- en IGG1-APC-buizen om de CD44-high cellen te selecteren.De positieve cellen zullen verdwijnen wanneer de IGG1-APC buis wordt geladen. Laad vervolgens de ALDH en CD44-APC en ALDH DEAB en CD44-APC buizen om een derde gate te creëren die de CD44-high/ALDH-high cellen bevat. Gebruik de dubbelgekleurde ALDH-CD44 buis om de laatste gate op de dubbel-positieve cellen te positioneren.Sorteer vervolgens de CD44-high/ALDH-high cellen in een conische buis van 15 milliliter met één milliliter compleet kankerstamcel-medium, en verzamel de CD44-low/ALDH-low cellen in één milliliter compleet celkweekmedium naar behoefte. Plaats na de tweede sortering de CD44-high/ALDH-high cellen in een geschikte kweekfles met compleet kankerstamcel-medium in de celkweekincubator voor 18 tot 24 uur. Wanneer de cellen aan de bodem van de fles zijn gehecht, wordt het kweekmedium vervangen en wordt de fles teruggeplaatst in de incubator.Om het tumorpotentieel van de CD44-high/ALDH-high cellen te bevestigen, wordt de cancer stem-like monolayer trypsinisch behandeld zoals gedemonstreerd om een single-cell suspensie te verkrijgen, waarna 1 x 10⁶ cellen worden overgebracht naar een conische buis van 15 ml. Na het centrifugeren van de cellen wordt het pellet geresuspendeerd in serumarm medium aangevuld met recombinant humaan epidermale groeifactor, heparine en B27, waarna de cellen worden geïncubeerd in een low-anchorage petrischaal in de celkweekincubator totdat er tumorsferen zichtbaar zijn via optische microscopie. Wanneer de sortering voor het eerst wordt uitgevoerd op een nieuwe cellijn, is het noodzakelijk om het tumorpotentieel van de cellijn te bevestigen, aangetoond door het vermogen om in vitro tumorsferen te vormen in serumvrij medium.Bovendien moet QPCR een hoge expressie van bèta-catenine en andere stamcelachtige markers aantonen door de CD44-high/ALDH-high cellen. De CD44-high/ALDH-high cellen zouden ook tumoren in situ moeten kunnen vormen wanneer ze in lage hoeveelheden worden geïnjecteerd in vergelijking met CD44-low/ALDH-low cellen. Zodra de methode is beheerst, zou elke cel sortering in vijf uur kunnen worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de met fluorochromen gelabelde monsters moeten worden beschermd tegen directe blootstelling aan licht. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals invasie-migratieassays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de betrokkenheid van kankerstamcellen bij het metastatische proces. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van kanker om de mechanismen van tumorontsnapping bij HNSCC-kanker te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kankerstamcellen uit HNSCC-cellijnen kunt isoleren met behulp van multiparametrische flowcytometrische analyse en cel sortering. Vergeet niet dat het werken met tumorcellen en intercalaat DNA-agentia extreem gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van een laboratoriumjas en handschoenen.

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

In this video, we describe the isolation of a subpopulation of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines using fluorescence-activated cell sorter or FACS. The isolated side population of cells can be used for further downstream analysis.

Cancer Side Population Discrimination Assay: A Method to Isolate Cancer Stem-like Cells Using Hoechst Dye Efflux Assay

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

De isolatie van kankerstamcellen (KSC) rechtstreeks van menselijke weefsels is voorwaarde voor hun biologische karakterisering. Dit manuscript beschrijft een methode voor de isolatie van prostaat CSC van menselijk weefsel, terwijl ook het verstrekken van tips over het oplossen van moeilijke stappen.

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Alvleesklierstamcellen (CSC's) kunnen worden uitgebreid in vitro met behulp van de verankeringsonafhankelijke sfeercultuurtechniek, wat een krachtig hulpmiddel is om CSC-biologie te bestuderen en kan dienen als de eerste stap om nieuwe CSC-gerichte therapieën te ontwikkelen. Hier wordt de methodologie voor het uitbreiden, analyseren en targeten van pancreas-CSC's geboden.

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

De aanwezigheid van kanker stamcellen (CSC) in bot sarcomen Onlangs is gekoppeld aan de pathogenese. In dit artikel presenteren we de isolatie van CSCs van primaire celculturen verkregen uit humane biopten van conventionele osteosarcoom (OS) met de mogelijkheid van CSCs groeien onder hechtende omstandigheden.

Oprichting van Cancer Stem Cell Cultures van Human Conventionele Osteosarcoom

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de isolatie van tumor-initiërende cellen van humaan Sarcoom patiënt-afgeleide xenotransplantaten door fluorescentie-geactiveerde celsortering, waarbij gebruik wordt gemaakt van humaan leukocyten antigeen-1 (HLA-1) als een negatieve marker, en voor de verdere validering en karakterisering van deze HLA-1-negatieve tumor initiërende cellen.

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

Hier presenteren we een reproduceerbare methode voor het ontwikkelen van een model orthotopic lymfkliertest van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Tumoren tonen klinisch relevante histopathologische kenmerken van de ziekte, met inbegrip van necrose, arme differentiatie, knooppunten metastasen en immuun infiltratie. Tumor-dragende muizen ontwikkelen klinisch relevante symptomen zoals dysfagie, verplaatsing van de kaak en gewichtsverlies.

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Met behulp van humane primaire prostaat Epitheelcellen, rapporteren we een nieuwe biomarker-vrije methode van functionele karakterisering van stam-achtige cellen door een spheroid-gebaseerde label-retentie test. Een stap-voor-stap protocol wordt beschreven voor BrdU, CFSE of far Red 2D Cell labeling; driedimensionale spheroid-formatie; Label-behoud stam-achtige celidentificatie door immunocytochemie; en isolatie door FACS.

Isolatie van stam-achtige cellen uit 3-dimensionale Spheroid-culturen

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Leer de isolatie en karakterisering van kankerstamcellen uit hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom met behulp van Hoechst dye efflux assay en flowcytometrie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van therapieresistentie en tumorbiologie.

Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken

Meer video's verkennen