Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken
11 mei 2016
Het begrijpen van de rol van kanker-stamcel-achtige cellen bij tumorrecidieven en resistentie tegen therapieën is in het afgelopen decennium een onderwerp van groot belang geworden. Dit artikel beschrijft de isolatie en karakterisering van de subpopulatie van kanker-stamcel-achtige cellen uit hoofd-hals-plaveiselcelcarcinoom cellijnen (HNSCC).
Het algemene doel van deze procedure is om kanker stamcellen te isoleren van hoofd- en hals plaveiselcelcarcinoom of HNSCC-cellijnen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van kankerbehandeling te beantwoorden over hoe chemotherapie te gebruiken om tumorradioresistentie te overwinnen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een combinatie van markers gebruikt om een hoge specificiteit te bereiken in kanker stamcellen van HNSCC-cellijnen.
De procedure wordt gedemonstreerd door Prescillia Battiston-Montagne, onze technicus en Marion Gilormini, een doctoraatsstudent uit mijn lab. Om een zijpopulatie van kanker stamcel-achtige cellen te selecteren door Hoechst-kleurstofeflux-assay, label je eerst één conische buis Hoechst en één Hoechst en Verapamil. Was vervolgens een HNSCC-cellcultuur met steriel PBS gevolgd door de toevoeging van één milliliter Tripsyn EDTA.
Na drie minuten bij 37 graden Celsius stop je de reactie met vers cellencultuurmedium en tel je de cellen. Verdun de cultuur tot één keer 10 tot de zevende cellen per milliliter en voltooi het ouderlijke cellijnmedium. Voeg vervolgens 100 microliter toe aan de Hoechst en Verapamil buis en vier milliliter cellen aan de Hoechst buis.
Meng vervolgens voorzichtig 10 microliter van vijf millimolar Verapamilhydrochloride-oplossing in het Hoechst en Verapamil-monster gevolgd door vijf microliter Hoechst per één keer 10 tot de zesde cellen in beide buizen. Bedek vervolgens de monsters met aluminiumfolie en plaats ze bij 37 graden Celsius. Na 90 minuten met voorzichtig mengen elke 15 minuten centrifugeer je de buizen en suspendeer je de pellets in twee milliliter PBS.
Na een centraal centrifugeren, suspendeer je het Hoechst en Verapamil-pellet in 500 microliter propidiumjodide in PBS en het Hoechst-pellet in vier milliliter van hetzelfde. Filter nu de monsters door 70-micron celsifters in FACS-buizen om eventuele aggregaten te verwijderen en plaats de monsters op ijs beschermd tegen licht. Laad vervolgens het Hoechst-monster op de flowcytometer en open het Global Worksheet-venster in de flowcytometersoftware.
Klik op Dot Plot om een grafiek op het Global Worksheet te maken en klik met de rechtermuisknop om de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters te selecteren. Maak op dezelfde manier een zijwaartse verstrooiingsbreedte door een zijwaartse verstrooiingshoogte dotplot in dezelfde grafiek en klik vervolgens op polygon gate om een P1-regio in de tweede grafiek te maken om de enkele cellen te selecteren en de doubletten te discrimineren. Maak vervolgens een rode Hoechst-gebied door een blauw Hoechst-gebied dotplot en klik met de rechtermuisknop op de cellen om de P1-populatie te markeren.
Maak vervolgens een P2-regio om de negatieve Hoechst-kleurstof zijpopulatie van cellen te selecteren die verschijnt als een zijarm aan de linkerkant van de hoofdpopulatie van cellen en verzamel 10.000 van de Hoechst-monstergebeurtenissen. Om te bevestigen dat de P2-gate die de zijpopulatie vertegenwoordigt correct is gepositioneerd, verzamel ook 10.000 Hoechst en Verapamil monstergebeurtenissen. De zijpopulatie zou moeten verdwijnen.
Sorteer vervolgens de zijpopulatie van Hoechst-kleurstof negatieve cellen in een 15-milliliter conische buis met één milliliter compleet kanker stamcel-achtig medium. Aan het einde van de sortering, centrifugeer je de cellen en suspendeer je het zijpopulatiepellet in één milliliter vers compleet kanker stamcel-achtig medium. Tel vervolgens de cellen en zaai ze in het juiste aantal in een nieuwe cellencultuurkolf.
Om de CD44-high/ALDH-high subset van de gesorteerd zijpopulatie cellen te selecteren, label je eerst zeven steriele 15-milliliter conische buizen zoals aangegeven. Verdun vervolgens de gesorteerd cellen tot één keer 10 tot de zeven cellen per milliliter in stamcelmedium en pipet 100 microliter cellen naar de ongekleurde CD44-APC en IGG1-APC buizen en vier milliliter cellen naar de ALDH en CD44-APC buis, allemaal op ijs. Centrifugeer de cellen en suspendeer de ongekleurde CD44-APC en IGG1-APC pellets in 100 microliter buffer één uit het ALDEFLUOR-kit.
Voeg vervolgens vijf microliter van de ALDH-remmer DEAB toe aan de ALDH en DEAB en ALDH DEAB en CD44-APC buizen. Suspendeer de cellen in de ALDH en CD44-APC buis in vier milliliter reagens C met vier milliliter buffer één en 20 microliter van het reagens uit het kit en draag onmiddellijk 100 microliter van deze cellen over naar de ALDH, ALDH en DEAB, en ALDH DEAB en CD44-APC buizen. Plaats vervolgens alle buizen in een 37-graden Celsius waterbad gedurende 30 minuten beschermd tegen licht, mengen de monsters na 15 minuten door voorzichtig te vortexen.
Aan het einde van de incubatie, centrifugeer je alle monsters en gooi je de supernatanten weg. Plaats vervolgens alle buizen op ijs en suspendeer je het ALDH en CD44-APC-pellet in vier milliliter buffer A, een CD44-APC en ALDH DEAB en CD44-APC-pellets in 100 microliter van hetzelfde. Suspendeer het IGG1-APC-pellet in 100 microliter buffer B en de ongekleurde ALDH en ALDH en DEAB buizen in 100 microliter buffer één.
Na 10 minuten, centrifugeer je alle monsters opnieuw gevolgd door een wassing in 1 milliliter buffer één voor alle monsters behalve het ALDH en CD44-APC-monster, dat wordt gewassen in vier milliliter buffer één. Na de tweede centrifugatie, suspendeer je alle pellets in één milliliter verse buffer één behalve voor het ALDH en CD44-APC-monster, dat wordt gesuspendeerd in vier milliliter buffer één. Laad nu het ALDH en CD44-APC-buis op de flowcytometer en creëer een APC by fitsy dot plot om de dubbel gekleurde populatie te visualiseren.
Laad vervolgens het ALDH-buis om een poort voor ALDH-high cellen te maken. De positieve cellen zouden moeten verdwijnen wanneer het ALDH en DEAB-buis wordt geladen. In dezelfde grafiek, maak je een tweede poort met behulp van de CD44-APC en IGG1-APC buizen om de CD44-high cellen te selecteren.
De positieve cellen zullen verdwijnen wanneer het IGG1-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel richt zich op de isolatie en karakterisering van kankerstamcelachtige cellen uit cellijnen van plaveiselcelcarcinoom van het hoofd-halsgebied (HNSCC). Het begrijpen van deze cellen is cruciaal voor het aanpakken van tumorrecidieven en therapieresistentie.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Oncologie
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Kankerstamcel-achtige cellen spelen een belangrijke rol in het tumorgedrag.
- Ze dragen bij aan therapieresistentie en tumorrecidive.
- Isolatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van deze cellen.
- Plaveiselcelcarcinoom van de hoofd-halsregio brengt unieke uitdagingen met zich mee bij de behandeling.
Doel van de studie
- Om kankerstamcelachtige cellen te isoleren uit HNSCC-cellijnen.
- Om het begrip van chemotherapieresistentie te verbeteren.
- Om methoden te ontwikkelen voor het identificeren van specifieke kankerstamcelpopulaties.
Gebruikte methoden
- Hoechst-kleurstof efflux-assay voor het selecteren van side-populaties.
- Flowcytometrie voor het analyseren van celpopulaties.
- Gebruik van specifieke markers om de isolatiespecificiteit te verhogen.
- Sorteren en kweken van geïdentificeerde kankerstamcel-achtige cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van kankerstamcel-achtige cellen uit HNSCC.
- Identificatie van CD44-high/ALDH-high celpopulaties.
- Aangetoonde effectiviteit van de methode voor het bestuderen van tumorbiologie.
- Inzichten verschaft in het overwinnen van behandelresistentie.
Conclusies
- De studie vergroot het begrip van kankerstamcel-achtige cellen.
- Het biedt een betrouwbare methode voor hun isolatie en karakterisering.
- De bevindingen kunnen toekomstige therapeutische strategieën tegen HNSCC informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Betrouwbare isolatie van kankerstamcelachtige cellen uit HNSCC-lijnen pakt een kritieke bottleneck aan in het begrijpen van tumorrecidive en therapieresistentie. Deze multiparametrische, op FACS gebaseerde workflow maakt een hoogspecifieke verrijking mogelijk van subpopulaties die betrokken zijn bij chemoresistentie en metastatisch potentieel. De aanpak ondersteunt voorspellend vertrouwen bij vroege ontdekking en targetvalidatie voor antikankerstrategieën die zich richten op stamcelachtige tumorcellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk die gericht zijn op tumorrecidive aangestuurd door stamcellen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het isoleren van functioneel gevalideerde kankerstamcel-achtige subpopulaties.
- Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door marker-expressie te koppelen aan stamcel-achtige fenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde CSC-verrijkte systemen voor voor daaropvolgende screening van verbindingen en functionele assays.
- Standaardiseert multiparametrische gating-strategieën voor reproduceerbare cel sortering en assay-ontwikkeling.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van marker-gedefinieerde subpopulaties mogelijk om de geschiktheid voor screening vast te stellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt de in vitro vorming van tumorsferen en marker-expressie met ziekte-relevante kenmerken van stamcelidentiteit.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door functionele karakterisering van CSC's mogelijk te maken.
- Biedt een platform voor mechanistische risicoreductie van therapeutische kandidaten tegen CSC's.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op FACS gebaseerde isolatiemethode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor robuuste targetvalidatie en functionele screening van CSC's in HNSCC-modellen mogelijk wordt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over mechanismen van CSC-gestuurde resistentie en recidieven.
- Screening: Levert reproduceerbare, door markers gedefinieerde celpopulaties voor assayontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve read-outs van markerexpressie en functionele stamcelkarakteristieken via tumorisfeer-assays.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro CSC-karakterisering en preklinische modellering van het tumorigenisch potentieel.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare workflow voor CSC-isolatie in HNSCC en potentieel andere tumormodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij CSC-gerichte ontdekking en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert multiparametrische cel-sortering voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen voor anti-CSC-programma's en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van kandidaten die zich richten op stamcelachtige tumor-subpopulaties.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie en multiparametrische gating-strategieën.
- Vraagt om toegang tot geavanceerde FACS-instrumentatie en analytische software.
- Nekt noodzaak tot standaardisatie van markerpanels en gating-protocollen tussen teams.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende tumormodellen of markercombinaties.
- Monsterbehandeling en lichtbescherming zijn cruciaal voor de stabiliteit van fluorochromen en de integriteit van de gegevens.
