Name: Een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Leer de RAPID bloedverwerkingsmethode voor het verhogen van peptide-opbrengst in menselijk bloed. Deze techniek verbetert de detectie van endogene peptiden en hun moleculaire vormen aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek 03IPT614A (CG). Wij danken Reinhard Lommel en Petra Busse voor hun uitstekende technische ondersteuning en Karin Johansson en Christina Hentzschel voor hulp bij de organisatie en uitvoering van antropometrische metingen

Het protocol werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor menselijke onderzoek (protocol nummer EA1 / 114/10). 1. Blood Processing <ol><li> Verzamel veneuze bloed 7:00-08:00 na een nacht vasten van een ader en het proces onderarm volgens de standaard procedure of de snelle methode. Instrueer de onderwerpen niet uit te oefenen of roken voor bloedafname. </li><li> Voor standaard verwerking, het verzamelen van bloed in EDTA-bevattende gekoelde en centrifugeer binnen 10 minuten bij 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de supernatant en bewaar bij -80 ° C tot verdere verwerking door radioimmunoassay. </li><li> Voor snelle verwerking onmiddellijk verdund bloed (binnen 1 min na bloedafname) 01:10 in ijskoude buffer (pH 3,6) die 0,1 M ammoniumacetaat, 0,5 M NaCl en enzymremmers (diprotine A, E-64-d, antipaïne , leupeptine, chymostatine, 1 ug / ml). Vervolgens centrifuge binnen 10 minuten bij 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en laat ons supernatanting een pipet in polypropyleen buizen zoals hiervoor beschreven in ratten 6. <ol><li> Charge chromatografie cartridges (360 mg, 55-105 pm) met 100% acetonitril (rate 10 ml / min), in evenwicht met 0,1% trifluoracetaat (TFA, snelheid 10 ml / min) en de supernatant lading met een constante snelheid van 1 ml / min met behulp van een injectiepomp. </li><li> Daarna wassen patronen met 3 ml 0,1% TFA (rate 10 ml / min) en langzaam elueer met 2 ml 70% acetonitril dat 0,1% TFA (2 ml / min). </li><li> Droge geëlueerde monsters met behulp van vacuüm centrifugatie en opslag bij -80 ° C tot verdere verwerking door radioimmunoassay. LET OP: Voer alle stappen in polypropyleen (RAPID verwerking) en borosilicaat (radioimmunoassay) buizen die aanzienlijk lager oppervlak bindende eigenschappen vertonen en dus peptide verlies voor het grootste deel van de peptiden onderzocht vóór 26 minimaliseren. </li></ol></li></ol> 2. Metingen LET OP: De stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een laboratoriumgecertificeerd voor het werken met radioactief materiaal. Standaard voorzorgsmaatregelen voor het werken met 125 I moeten worden genomen. <ol><li> Herstel van radioactief gelabeld Peptiden <ol><li> Verkrijgen 125I radioactief gemerkte menselijke-peptiden (bijv. Acyl-ghreline, GLP-1, glucagon, insuline, kisspeptin, leptine, nesfatin-1, PYY 3-36 en somatostatine-28). </li><li> Houd peptiden in poedervorm tot het experiment, toen vers verdund in 0,1% azijnzuur (~ 100.000 cpm per ml). </li><li> Voor standaard bloed verwerking, direct na de bloedafname in gekoelde EDTA-bevattende buizen, breng 1 ml bloed in een buis met 50 ul van radiolabel met 3.000-6.000 tpm (direct geteld voor het experiment begint). </li><li> Voor een snelle verwerking, breng 1 ml bloed van EDTA met bloed in een buis met 9 ml RAPID buffer (voor de samenstelling zie 1.3) en 500 ul radiolabel met 30,000-60,000 cpm. Door het gebruik 1:10 verdunning 10-maal groter volume radiolabel voor een snelle verwerking. </li><li> Daarna proces monsters zoals beschreven in stap 1.2 tot 1.3.2. </li><li> Voor het herstel experimenten, niet droog monsters door middel van vacuüm centrifugeren en niet bewaren bij -80 ° C. In plaats daarvan beoordeelt herstel van radioactief gemerkte peptiden direct daarna met behulp van een gamma-teller. </li><li> Meet de gehele supernatant standaardmonsters, terwijl RAPID monsteranalysen 1/10 van het totale volume vergelijkbaarheid van de hoeveelheid radiolabel gebruikte verkrijgen. Voor het meten, overdracht van de bovenstaande vloeistof in buizen passend in de gamma-teller en de tellingen per minuut te beoordelen </li><li> Als standaard 100%, gebruikt twee monsters met 50 pl 125I radioactief gemerkt peptide dat geen bewerking ondergaan. Meet tegelijkertijd met andere monsters zoals beschreven in 2.1.7. </li><li> Voer het experiment 5-6 keer voor elk peptide. </li></ol></li><li> High Performance Liquid Chromatography van radioactief gelabeld Ghreline <ol><li> Trekken bloed in chilled EDTA bevattende buizen en overdracht 1 ml tot buizen die 200 pi radioactief gemerkt-acyl ghreline met 15.000-20.000 cpm (direct geteld voor het experiment begint). </li><li> Voor een snelle verwerking, breng 1 ml bloed in een buis met 9 ml RAPID buffer (voor de samenstelling zie 1.3) en 200 pi radioactief gemerkt acyl ghreline met 15.000-20.000 cpm. </li><li> Daarna proces monsters zoals beschreven in stap 1.2 tot 1.3.2. </li><li> Voor verdere analyse met omkeerfase HPLC, direct geladen monsters op een stabiele binding C18 kolom (2,1 mm x 50 mm, 1,8 urn) geëquilibreerd in 17% acetonitril in water (aangevuld met 0,1% TFA). </li><li> Na 5 min equilibreren gebruik een gradiënt 17-40% acetonitril aan het monster elueren in 40 minuten (stroomsnelheid van 1 ml / min). </li><li> Verzamel fracties van 1 ml per minuut en analyseren van radioactiviteit met behulp van een gamma-teller. </li><li> In een afzonderlijk experiment belasting 200 gl radioactief gemerkte acyl ghreline met 15.000-20.000cpm op de kolom direct en voer HPLC zoals beschreven in de stappen 2.2.4 tot en met 2.2.6. </li></ol></li><li> radioimmunoassay <ol><li> Voor radioimmunoassay, ontdooien bevroren supernatanten (standaard verwerking) en vacuüm gedroogd poeder (RAPID-methode) bij kamertemperatuur. </li><li> Onmiddellijk voor radioimmunoassay, resuspendeer droge RAPID monsters met tweemaal gedestilleerd H2O volgens de oorspronkelijke volume plasma (500 ui). </li><li> Evalueren kisspeptin en totale (zowel desacyl en acyl ghreline) en acyl ghreline zoals eerder beschreven 12,27 behulp van commerciële radioimmunoassays volgens de protocollen van de fabrikant. Gebruik borosilicaat buizen die stabiele formatie pellet mogelijk te maken. <ol><li> Op dag één, incubeer de monsters met testbuffer en primair antilichaam (bijv. Anti-ghreline) in de verdunning van de fabrikant gedurende 24 uur. </li><li> Op dag twee, voeg de tracer 125I (bijvoorbeeld 125I-ghreline), vortex en incubeer gedurende 24 uur. </li><li> Op dag drie, voeg reagens worden, vortex en incubeer zoals aanbevolen door de fabrikant. Vervolgens centrifugebuizen bij 3000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatants en tel radioactiviteit in de pellets onder toepassing van een gammateller </li></ol></li><li> Bereken desacyl ghreline als het verschil van de totale minus acyl ghreline. Beoordelen van de acyl / desacyl ghrelin verhouding door deling acyl door desacyl ghreline voor elk individueel monster. </li><li> Verwerk alle monsters - indien mogelijk - in de ene partij naar inter-assay variabiliteit te voorkomen. De intra-assay variatie in het onderhavige experiment was &lt;8% voor kisspeptin, &lt;7% voor totaal en &lt;9% voor acyl ghreline. </li></ol></li></ol> 3. Statistische analyse <ol><li> Bepaal de verdeling van de gegevens waarbij de Kolmogorov-Smirnov-test. Versneld data als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). </li><li> Beoordelen van verschillen tussen tweegroepen van t-test. Beoordelen van de verschillen tussen de verschillende groepen door alle pair-wise meervoudige vergelijking procedures (Tukey post hoc test) of two-way ANOVA gevolgd door Holm-Sidak methode. </li><li> Overweeg p &lt;0,05 significant en het uitvoeren van analyses met behulp van een statistisch programma. </li></ol>

<ol><li>Finucane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+body-mass+index+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+960+country-years+and+9.1+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants.</a> Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).</li>
<li>James, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+obesity%3A+the+size+of+the+problem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of obesity: the size of the problem.</a> J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).</li>
<li>Stengel, A., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+peptides+and+their+regulation+of+hunger+and+satiety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gastroenterol+Rep%22%5BJournal%5D)">Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety.</a> Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).</li>
<li>Hussain, S. S., Bloom, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+food+intake+by+the+gut-brain+axis%3A+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity.</a> Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).</li>
<li>Hosoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+collection+and+storage+conditions+for+ghrelin+measurements%3A+octanoyl+modification+of+ghrelin+is+rapidly+hydrolyzed+to+desacyl+ghrelin+in+blood+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples).</a> Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAPID+method+for+blood+processing+yields+new+insight+in+plasma+concentrations+and+molecular+forms+of+circulating+gut+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides.</a> Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+differentially+decreases+plasma+acyl+and+desacyl+ghrelin+levels+in+rats%3A+Potential+role+of+the+circulating+ghrelin-acylating+enzyme+GOAT%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT.</a> Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+ambient+temperature+reverses+abdominal+surgery-induced+delayed+gastric+emptying+and+decreased+plasma+ghrelin+levels+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats.</a> Peptides. 31, 2229-2235 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+administration+of+pan-somatostatin+agonist+ODT8-SST+prevents+abdominal+surgery-induced+inhibition+of+circulating+ghrelin%2C+food+intake+and+gastric+emptying+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+surgery+inhibits+circulating+acyl+ghrelin+and+ghrelin-O-acyltransferase+levels+in+rats%3A+role+of+the+somatostatin+receptor+subtype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+urocortin+1+induces+a+CRF2+mediated+increase+in+circulating+ghrelin+and+glucose+levels+through+distinct+mechanisms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats.</a> Peptides. 39, 164-170 (2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexigenic+response+to+tail+pinch%3A+role+of+brain+NPY%281%29+and+corticotropin+releasing+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).</li>
<li>Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+increases+plasma+levels+of+corticotropin-releasing+hormone+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats.</a> Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
<li>Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrally+injected+kisspeptin+reduces+food+intake+by+increasing+meal+intervals+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice.</a> Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).</li>
<li>De Bond, J. A., Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kisspeptin+and+energy+balance+in+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kisspeptin and energy balance in reproduction.</a> Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).</li>
<li>Wren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+enhances+appetite+and+increases+food+intake+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992(2001).</li>
<li>Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucagon+on+food+intake+and+body+weight+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of glucagon on food intake and body weight in man.</a> J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).</li>
<li>Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+glucagon-like+peptide+1+or+peptide+YY+3-36+affects+food+intake+in+healthy+male+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects.</a> Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).</li>
<li>Dewan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+insulin-induced+hypoglycaemia+on+energy+intake+and+food+choice+at+a+subsequent+test+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal.</a> Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).</li>
<li>Schlogl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+24-hour+ad+libitum+food+intake+is+associated+with+lower+plasma+irisin+concentrations+the+following+morning+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Appetite%22%5BJournal%5D)">Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans.</a> Appetite. 90, 154-159 (2015).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+leptin+for+weight+loss+in+obese+and+lean+adults%3A+a+randomized%2C+controlled%2C+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial.</a> JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).</li>
<li>Shimizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+administration+of+nesfatin-1+reduces+food+intake+in+mice%3A+the+leptin-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism.</a> Endocrinology. 150, 662-671 (2009).</li>
<li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+food+intake+in+obese+subjects+by+peptide+YY3-36%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36.</a> N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).</li>
<li>Shibasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effect+of+somatostatin+on+corticotropin-releasing+factor-induced+anorexia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat.</a> Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>Smets, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+plasma+levels+of+metastin+in+early+pregnancy+are+associated+with+small+for+gestational+age+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat+Diagn%22%5BJournal%5D)">Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates.</a> Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).</li>
<li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+is+a+growth-hormone-releasing+acylated+peptide+from+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach.</a> Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).</li>
<li>Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((the+Gastric+X%2FA-like+Cell+as+Possible+Dual+Regulator+of+Food+Intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake.</a> J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).</li>
<li>Inhoff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desacyl+ghrelin+inhibits+the+orexigenic+effect+of+peripherally+injected+ghrelin+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats.</a> Peptides. 29, 2159-2168 (2008).</li>
<li>Hirayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+effects+of+ghrelin+and+des-acyl+ghrelin+on+the+lumbo-sacral+defecation+center+and+regulation+of+colorectal+motility+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).</li>
<li>Horikoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+elevation+of+plasma+metastin+concentrations+in+human+pregnancy%3A+metastin+as+a+novel+placenta-derived+hormone+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).</li>
<li>Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+of+kisspeptin+levels+in+girls+with+idiopathic+central+precocious+puberty+and+its+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance.</a> Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).</li>
<li>Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+and+des-acyl+ghrelin%3A+two+major+forms+of+rat+ghrelin+peptide+in+gastrointestinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue.</a> Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).</li>
<li>Raff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+and+active+ghrelin+in+developing+rats+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia.</a> Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+anticoagulants+and+storage+temperatures+on+stability+of+plasma+and+serum+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones.</a> Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).</li>
<li>Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+degradation+pathway+of+recombinant+human+parathyroid+hormone%3A+deamidation+of+asparaginyl+residue+and+peptide+bond+cleavage+at+aspartyl+and+asparaginyl+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues.</a> Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).</li>
<li>White, A., Handler, P., Smith, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+A+%22Principles+of+Biochemistry%22">Principles of Biochemistry</a>. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We meldden eerder dat de snelle methode voor de verwerking van bloed verbeterde de recovery voor 11/12 peptides in vergelijking met standaard verwerking bloed bij ratten 6. In deze studie hebben we aangetoond dat deze methode ook geschikt voor gebruik bij mensen. Na snelle verwerking werd het herstel voor 9 van 9 125I-gemerkte peptiden getest dan standaard Bloedverwerkingsfilter (EDTA bloed op ijs). De waargenomen verbetering varieerde 19-39% die van belang kan zijn, vooral onder omstandigheden wan...

In het licht van de wereldwijde toenemende prevalentie van obesitas 1,2, wordt onderzoek op het gebied van de voedselinname regelgeving steeds belangrijker. Terwijl tot nu toe slechts één peptide is bekend dat de omtrek opgesteld en centraal werkende voedselinname, namelijk ghreline 3 stimuleren, in de afgelopen decennia is een groot aantal peptiden geïdentificeerd die verminderen voedselinname, bijv. leptine, peptide YY (PYY) en glucagon-achtig peptide-1 (GLP-1) en insuline 4, Daarom is in studies naar de regulatiemechanismen van honger-peptide niveaus worden vaak beoordeeld en tegelijkertijd wordt aangenomen dat het peptide bestudeerde stabiel en teruggewonnen in hoge opbrengsten bij plasma formatie. Echter, vaak is dit niet het geval is door snelle endogene afbraak zoals eerder getoond bijv. ghreline die gedegradeerd van acyl ghreline tot 5 desacyl. Daarom hebben we onlangs beschreef de snelle methode voor het bloed proceszingen bij ratten in dienst R educed temperaturen, A cidification, P rotease inhibitie, ik sotopic exogene controles en D ilution 6. Deze methode verbeterd herstel van 6 11 van 12 peptiden getest en toegestaan ​​voor het bepalen van de juiste circulerende moleculaire vorm in vergelijking met standaard Bloedverwerkingsfilter (EDTA bloed op ijs). Deze werkwijze is gebruikt in verscheidene latere studies 7-12 voor de detectie van ghreline en corticotropine releasing factor 13. Daarom is de werkwijze nuttig voor peptide onderzoek bij knaagdieren aangetoond. Echter, aangezien knaagdieren studies zijn niet altijd te vertalen naar een andere soort, de methode moet worden vastgesteld voor het gebruik in het menselijk bloed ook. Het doel van het onderhavige onderzoek was de snelle werkwijze voor het bloedverwerkende testen bij mensen in vergelijking met standaard bloedbewerkingsprocedure, EDTA bloed op ijs, die algemeen wordt aanbevolen 14 en vaak used in de klinische en onderzoek instellingen. We testten het herstel van een selectie van 125 I-gelabelde peptiden die betrokken zijn bij de regulatie van voedselinname waaronder gevestigde peptiden evenals nieuwe kandidaten onlangs voorgesteld om een rol spelen bij het ​​voeden van regulering spelen (effecten op voedselinname zijn weergegeven in tabel 1) na verwerking met beide methoden. Hormonen werden gekozen om peptiden van verschillende lengte en lading (tabel 2) te vertegenwoordigen. Bovendien is het voor ghrelin onderzochten we de moleculaire vorm (s) naar aanleiding van de standaard en snelle methode. Tenslotte onderzochten we endogeen ghreline (acyl en desacyl ghreline) en kisspeptin niveaus, een peptide onlangs voorgesteld een rol in de regulering van voedselinname 15,16 volgende RAPID of standaard bewerking beschikt. Daarnaast onderzochten we ook deze peptide niveaus in een populatie van patiënten met een breed scala van body mass index (variërend 10,2-67,6 kg / m 2) possib studerenle verschillen met betrekking tot chronisch gewijzigd lichaamsgewicht. <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/53959/53959table1.jpg" /><img alt="tabel 2" src="/files/ftp_upload/53959/53959table2.jpg" /> Diagnose, Evaluatie en Plan: studie deelnemers Alle deelnemers aan de studie werden onlangs in het ziekenhuis opgenomen patiënten (inclusie was binnen twee dagen na opname in het ziekenhuis) van de afdeling Psychosomatische Medicine in Charité-Universitätsmedizin Berlijn en gaven schriftelijk informed consent. Om enige impact van gender enige vrouwelijke patiënten geïncludeerd te voorkomen. Een totaal van 42 patiënten namen deel aan het onderzoek en werden verdeeld in drie groepen: normaal gewicht (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervosa (BMI &lt;17,5 kg / m 2, n = 15) en obesitas (BMI&gt; 30 kg / m 2, n = 15). Anorexia en obese patiënten warengediagnosticeerd volgens de International Classification of Diseases-10 en het ziekenhuis voor gewichtstoename (anorexia nervosa) of gewichtsvermindering (obesitas), respectievelijk. Alle normaal gewicht patiënten werden uitsluitend in het ziekenhuis als gevolg van somatoforme klachten zonder relevante somatische aandoeningen. Patiënten met gastro-intestinale somatoforme symptomen of een voorgeschiedenis van gastro-intestinale chirurgie werden uitgesloten. Uitsluitingscriteria omvatte ook een leeftijd &lt;18 jaar, de huidige zwangerschap en onbehandelde psychotische aandoeningen. Bloedafname uitgevoerd op dag 2 of 3 na ziekenhuisopname voor het ontvangen dieetbehandeling voor het vergroten of verkleinen lichaamsgewicht, respectievelijk. Antropometrische parameters werden op dezelfde dag.

<table><tbody><tr><td>Diprotin A</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IDP-4132</td><td></td></tr><tr><td>E-64-d</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IED-4321-v</td><td></td></tr><tr><td>Antipain</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IAP-4062</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>ILP-4041</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>ICY-4063</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 cartridges</td><td>Waters Corporation, Milford, MA, USA</td><td>WAT051910</td><td>360 mg, 55-105 &micro;m</td></tr><tr><td>Acyl-ghrelin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9088-HK</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9035-HK</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9030</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9011S</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Leptin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9081-HK</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Kisspeptin-10</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-048-56</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Nesfatin-1</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-003-26</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>PYY3-36</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-059-02&nbsp;</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Somatostatin-28</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-060-16&nbsp;</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td>822700-902</td><td>2,1 mm x 50 mm, 1,8 &micro;m</td></tr><tr><td>Agilent 1200 LC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>HPLC, meerdere componenten, dus geen enkel catalogusnummer</td></tr><tr><td>Kisspeptin&nbsp; RIA</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td># RK-048-56</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Total ghrelin RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td># GHRT-89HK&nbsp;</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>Active ghrelin RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td># GHRA-88HK</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>SigmaStat 3.1</td><td>Systat Software, San Jose, CA, USA</td><td>online download</td><td></td></tr></tbody></table>

een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Onderzoek op het gebied van de voedselinname regelgeving wordt steeds belangrijker. Dit omvat vaak het meten van peptiden de voedselopname. Voor de juiste bepaling van de concentratie van een peptide moet stabiel tijdens bloedbewerking zijn. Dit is echter niet voor meerdere peptiden die snel worden afgebroken door endogene peptidasen. Onlangs hebben we een bloedverwerkend werkwijze gebruik R educed temperaturen cidification A, P rotease remming I sotopic exogene controles en D ilution (RAPID) voor gebruik bij ratten. Hier hebben we deze techniek voor gebruik bij mensen vastgesteld en onderzocht herstel moleculaire vorm en circulerende concentratie van voedselinname regulerende hormonen. De snelle werkwijze aanzienlijk verbeterd herstel voor 125-gemerkte somatostatine-28 (+ 39%), glucagon-achtige peptide-1 (+ 35%), acyl ghreline en glucagon (+ 32%), insuline en kisspeptin (+ 29% ) nesfatin-1 (+ 28%), leptine(+ 21%) en peptide YY 3-36 (+ 19%) in vergelijking met standaard verwerking (EDTA bloed op ijs, p &lt;0,001). Hoge prestatie vloeistofchromatografie toonde de elutie van endogene acyl ghreline op de verwachte positie RAPID verwerking, terwijl na standaardverwerking 62% van acyl ghreline werd afgebroken waardoor een eerdere piek waarschijnlijk vertegenwoordigen desacyl ghreline. Na een snelle verwerking van de acyl / desacyl ghrelin verhouding in het bloed van een normaal gewicht was 1: 3 ten opzichte van 01:23 volgende standaard verwerking (p = 0,03). Ook endogene kisspeptin niveaus waren hoger na RAPID in vergelijking met standaard verwerking (+ 99%, p = 0,02). RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen, levert hogere peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm.

RAPID bloedverwerkende verhoogt de opbrengst aan 125 I-radiogelabelde peptiden in menselijk bloed in vergelijking met standaard bloedbewerkingsprocedure. Na standaard bloed verwerking (EDTA bloed op het ijs), het herstel van radioactief gemerkte peptiden was ~ 60% in 9/9 peptiden (variërend 48-68%, Figuur 1A - K). RAPID verwerking verbeterde de opbrengst in elke 125I-gemerkte peptiden, namelijk in somatostatine-28 (+ 39%, <st...

RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen en hogere opbrengsten peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm. Daarom zal deze methode een waardevol instrument in peptide onderzoek.

Een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Het algemene doel van deze RAPID-methode is het verhogen van de opbrengst van endogene peptidehormonen die in menselijk bloed gemeten moeten worden. De RAPID-methode is onlangs ontwikkeld voor gebruik bij ratten en is ook geschikt voor gebruik in menselijk bloed. De RAPID-methode verbetert de opbrengst en maakt de detectie van de correcte moleculaire vorm van het endogene peptide mogelijk.De RAPID-methode is eenvoudig in gebruik. De RAPID-methode is echter tijdrovender en kostbaarder in vergelijking met standaard bloedafname. Daarom is deze mogelijk meer geschikt voor gebruik in een onderzoekssetting.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien zowel de tijdige verdunning van de monsters als de elutie van groot belang zijn om een correct peptidegehalte te waarborgen. Neem veneus bloed op een gestandaardiseerd tijdstip af uit een armader na een nacht vasten. Verwerk dit vervolgens volgens standaardprocedures of de RAPID-methode.Instrueer de proefpersonen om geen lichaamsbeweging te doen of te roken voorafgaand aan de bloedafname. Voor de standaardverwerking wordt bloed verzameld in gekoelde EDTA-buizen en binnen 10 minuten gecentrifugeerd bij 3000 Gs gedurende

a-rapid-method-for-blood-processing-to-increase-yield-plasma-peptide

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een nieuwe werkwijze voor het isoleren van genomisch DNA uit volbloed voor plasma / serologie. Na het plasma, wordt de verdichte bloed meestal weggegooid. Onze nieuwe methode is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van bestaande methoden en maakt DNA en plasma verkrijgbaar vanaf een enkele collectie, zonder daarvoor extra bloed.

Een praktische en nieuwe methode om Genomic DNA Uittreksel uit Bloedafname Kits voor Plasma Protein Preservation

In this video, we demonstrate reversed-phase high-performance liquid chromatography to purify peptides from a digested protein lysate mixture. These purified peptides are then lyophilized and stored for downstream applications. Analysis of peptides can help understand the mechanics involved in cellular signaling and cancer.

Peptide Purification: An RP-HPLC-based Technique to Extract Peptides from Digested Protein Lysates

Source:Sathish Muthu1,2,31Orthopaedic Research Group, Coimbatore.2Department of Biotechnology, Faculty of Engineering, Karpagam Academy of Higher Education.3Department of Orthopaedics, Government Medical College.This video demonstrates the preparation of high-quality Platelet-Rich Plasma (PRP) by screening for platelet count, collecting and centrifuging blood, and isolating platelets. This PRP is used in therapeutic applications for tissue regeneration and healing.

Preparation of Platelet-Rich Plasma from Human Peripheral Blood

We schetsen een methodologie voor de verwerking van volbloed om een verscheidenheid aan componenten te verkrijgen voor verdere analyse. We hebben een gestroomlijnd protocol geoptimaliseerd dat snelle, hoogwaardige, gelijktijdige verwerking van volbloedmonsters in een niet-klinische omgeving mogelijk maakt.

Snelle Fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling

High-throughput verkouden fysieke plasma behandeling protocol van vloeistoffen en cellen wordt weergegeven. Het gaat om de oprichting van verschillende grondstof gas composities voor plasma ontsteking, meten van de plasma emissie spectra, en de daaropvolgende analyse van vloeistoffen en cellulaire activiteit na plasma behandeling.

Basisonderzoek in Plasma geneeskunde - een benadering van de doorvoer van vloeistoffen naar cellen

Hier presenteren we een geautomatiseerde plasma-eiwit verteringsmethode voor massaspectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomische analyse. In dit protocol worden de vloeibare overdrachts- en incubatiestappen voor eiwitdenaturatie, reductie, alkylation en trypsine-spijsverteringsreacties gestroomlijnd en geautomatiseerd. Het duurt ongeveer vijf uur om een 96-well plaat met de gewenste precisie voor te bereiden.

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Dit protocol beschrijft klinisch implementeerbare bereiding van hoogwaardige PBMC- en plasmabioamples op de klinische proeflocatie die kunnen worden gebruikt voor translationele biomarkeranalyse.

Voorbereiding van perifere bloedmononucleaire celkorrels en plasma uit een enkele bloedafname op klinische proeflocaties voor biomarkeranalyse

Dit protocol biedt een toegankelijke gids voor het verzamelen, bewaren en ontdooien van perifere mononucleaire bloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse analyses en workflows zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Plasma- en buffy-jascollecties worden ook gedemonstreerd.

Isolatie en cryopreservatie van zeer levensvatbare mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed uit volbloed: een gids voor beginners

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

Om effectief onderzoek naar de werking van het immuunsysteem celpopulaties hun zuivering vaak vereist is. Complement uitputting is een snelle en goedkope techniek voor de isolatie van het immuunsysteem van celpopulaties met hoge zuiverheid.

Uitputting van specifieke celpopulaties door Complement Uitputting

Leer de RAPID bloedverwerkingsmethode voor het verhogen van peptide-opbrengst in menselijk bloed. Deze techniek verbetert de detectie van endogene peptiden en hun moleculaire vormen aanzienlijk.

Een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen

Meer video's verkennen