Een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen
28 april 2016
RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen en hogere opbrengsten peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm. Daarom zal deze methode een waardevol instrument in peptide onderzoek.
Het algemene doel van deze RAPID-methode is om de opbrengst van endogene peptidehormonen die in menselijk bloed worden gemeten te verbeteren. De RAPID-methode is onlangs ontwikkeld voor gebruik bij ratten en is ook geschikt voor gebruik in menselijk bloed. De RAPID-methode verbetert de opbrengst en maakt detectie van de juiste moleculaire vorm van endogene peptiden mogelijk.
De RAPID-methode is eenvoudig te gebruiken. Echter, de RAPID-methode is tijdrovender en duurder in vergelijking met standaard bloedmonsters. Het kan dus meer toepasbaar zijn in een onderzoeksomgeving.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de tijdige verdunning van de monsters en de elutie van groot belang zijn om een goede peptideniveau te garanderen. Verzamel veneus bloed op een gestandaardiseerd tijdstip na een nacht vasten vanuit een onderarmslagader. En verwerk volgens standaardprocedures of de RAPID-methode.
Instrueer de proefpersonen om niet te oefenen of te roken voordat het bloed wordt afgenomen. Voor standaardverwerking, verzamel bloed in gekoelde EDTA-bevattende buisjes en centrifugeer binnen 10 minuten bij 3000 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking door middel van radio-immunoassay.
Voor RAPID-verwerking, verdun bloed onmiddellijk een op tien, in ijskoud RAPID-buffer. PH drie punt zes, bevattend nul punt één molair amoniumasitate. Nul punt vijf molair natriumchloride, en enzymremmers.
Centrifugeer binnen 10 minuten de RAPID-monster op 3000 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en verzamel de supernatant, met behulp van een pipette. Laad vervolgens de chromatografiecartridges met 100% actitonitrile, bij 10 milliliters per minuut. Na equilibratie met 0,1% trifluorazijnzuur of TFA.
Laad met het RAPID-monstersupernatant, met een constante snelheid van één milliliter per minuut, met behulp van een spuitpomp. Na het wassen van de cartridges met drie milliliter 0,1% TFA, bij 10 milliliters per minuut, eluteer langzaam het RAPID-monster met twee milliliter 70% acetonitrile bevattend 0,1% TFA, bij twee milliliters per minuut. Droog de eluteerde monsters met behulp van vacuümcentrifugatie, en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking door middel van radio-immunoassay.
Verkrijg jodium 125 radio-gelabelde humane peptiden. Bewaar de peptiden in poedervorm tot het experiment. Verdun dan vers in 0,1% azijnzuur.
Voor standaardverwerking, direct na het afnemen van bloed, in gekoelde EDTA-bevattende buisjes, breng een milliliter bloed over in een buis met 50 microliter radiolabel, bevattend 3000 tot 6000 CPM. Voor RAPID-verwerking, breng een milliliter EDTA-bevattend bloed over in een buis met negen milliliters RAPID-buffer, en 500 microliter radiolabel bevattend 30.000 tot 60.000 CPM. Vanwege de een op tien verdunning, gebruik een tien keer hoger volume van radiolabel voor RAPID-verwerking.
Direct na het toepassen van de verschillende stappen van de RAPID-methode, beoordeel de herstel van radioactief gelabelde peptiden door middel van een gammateller. Droog de monsters niet door vacuümcentrifugatie, en bewaar ze niet bij min 80 graden Celsius. Voor meting, breng de supernatant over naar buisjes passend bij de gammateller.
En beoordeel de tellen per minuut. Meet de gehele supernatant in standaard monsters. In RAPID-monsters, analyseer een tiende van het totale volume om een vergelijkbare hoeveelheid radiolabel te bereiken die is gebruikt.
Gebruik als 100% standaard twee monsters met 50 microliters jodium 125 radiogelabeld peptide die niet worden verwerkt. Meet de radioactiviteit van alle monsters op hetzelfde moment. Trek bloed af, in gekoelde EDTA-bevattende buisjes, en breng een milliliter over naar buisjes met 200 microliters radiogelabeld acyl ghrelin, bevattend 15.000 tot 20.000 CPM, voor standaardverwerking.
Voor RAPID-verwerking, breng een milliliter bloed over naar een buis met negen milliliters rapid-buffer, en 200 microliters radiogelabeld acyl ghrelin bevattend 15.000 tot 20.000 CPM. Verwerk vervolgens de monsters zoals eerder. Voor verdere analyse door middel van omgekeerde fase HPLC, laad de monsters direct op een stabiele bond C18 kolom geëquilibreerd in 17% acetonitrile in water aangevuld met 0,1% TFA.
Na vijf minuten van equilibratie, gebruik een gradiënt van 17 tot 40% acetonitrile, om het monster in 40 minuten te eluteren, bij één milliliter per minuut. Verzamel fracties van één milliliter elke minuut, en analyseer radioactiviteit met behulp van een gammateller. In een apart experiment, laad 200 microliters radiogelabeld acyl ghrelin bevattend 15.000 tot 20.000 CPM direct op de kolom en voer HPLC uit zoals eerder.
Voor radio-immunoassay, ontdooi bevroren supernatanten en vacuümgedroogd poeder op kamertemperatuur. Direct voorafgaand aan radio-immunoassay, hersuspendeer droge RAPID-monsters in dubbel gedistilleerd water, volgens het oorspronkelijke volume plasma. Beoordeel kisspeptin en totaal ghrelin evenals acyl ghrelin, met behulp van commerciële radio-immuno-assays volgens de protocollen van de fabrikant.
Gebruik borosilicaatbuisjes die stabiele palettenvorming toelaten. Op dag één, incubeer de monsters met testbuffer en primaire atibody, in de verdunning voorzien door de fabrikant gedurende een periode van 24 uur. Op dag twee, voeg de jodium 125 tracer toe, vortex, en incubeer gedurende een periode van 24 uur.
Op dag drie, voeg de precipitatiereagens toe, vortex, en incubeer zoals aanbevolen door de fabrikant. Vervolgens, centrifugeer de buisjes bij 3.000 Gs gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de supernatanten en tel de radioactiviteit in de paletten, met behulp van een gammateller.
Bereken de desacyl ghrelin, als het verschil van de totale ghrelin min acyl ghrelin. Beoordeel de acyl, desacyl ghrelin verhouding, door
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De RAPID-methode voor bloedverwerking verhoogt de opbrengst van endogene peptide hormonen in menselijk bloed, waardoor een nauwkeurige beoordeling van moleculaire vormen mogelijk is. Deze methode, oorspronkelijk ontwikkeld voor ratten, is gebruiksvriendelijk maar mogelijk meer geschikt voor onderzoek vanwege de hogere kosten en tijdsvereisten.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Peptide-onderzoek
- Bloedverwerkingsmethoden
- Endogene hormonen
Achtergrond
- De RAPID-methode verbetert de opbrengst van peptiden in bloedmonsters.
- Het maakt de detectie van correcte moleculaire vormen van peptiden mogelijk.
- Oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik bij ratten.
- Aanpasbaar voor toepassingen met menselijk bloed.
Doel van het onderzoek
- Om de meting van endogene peptide hormonen te verbeteren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het beoordelen van moleculaire vormen van peptiden.
- Om de haalbaarheid van de RAPID-methode in menselijk bloed te evalueren.
Gebruikte methoden
- RAPID-bloedverwerkingstechniek
- Vergelijking met standaard bloedmonstermethoden
- Beoordeling van peptideniveaus en moleculaire vormen
- Toepassing in zowel ratten- als menselijk bloed
Belangrijkste resultaten
- Hogere peptideniveaus verkregen met behulp van de RAPID-methode.
- Nauwkeurige beoordeling van moleculaire vormen van peptiden.
- Methode is gebruiksvriendelijk maar tijdrovender en duurder.
- Mogelijk meer toepasbaar in onderzoeksinstellingen.
Conclusies
- De RAPID-methode is een waardevol hulpmiddel voor peptide-onderzoek.
- Het biedt aanzienlijke verbeteringen ten opzichte van standaardmethoden.
- Verder onderzoek kan de toepassing ervan in klinische omgevingen optimaliseren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of endogenous peptide hormones is critical for target validation in metabolic disease research, where low abundance and rapid degradation compromise data reliability. The RAPID method addresses this challenge by stabilizing peptides during blood processing, thereby improving assay sensitivity and enabling detection of correct molecular forms. This supports mechanistic de-risking in early discovery by reducing false negatives and enhancing predictive confidence in biomarker measurements.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by improving recovery of labile peptides such as acyl ghrelin and kisspeptin, reducing false-negative rates in target engagement studies.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for peptide stabilization that supports reproducible target validation across laboratories.
- Predictive Value: Increases confidence in biomarker quantification by preserving the native molecular form, aiding in go/no-go decisions for targets with low circulating concentrations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates higher-yield peptide samples, improving signal-to-noise ratios in radioimmunoassay and mass spectrometry-based screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through consistent peptide recovery, reducing variability in high-throughput screening outputs.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for downstream screening, enhancing platform reuse in peptide-focused discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant systems by maintaining peptide integrity across normal weight, anorexic, and obese conditions, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing reliable peptide measurements for pharmacokinetic and pharmacodynamic modeling.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in peptide hormone measurements.
Pipeline & Workflow Integration
The RAPID method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and biomarker assessment prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by improving detection of endogenous peptides like glucagon-like peptide-1 and insulin, enabling clearer pathway interrogation.
- Screening: Enhances assay readiness through improved peptide recovery and molecular form accuracy, enabling reliable compound evaluation in functional assays.
- Analytics: Delivers quantitative outputs such as acyl/desacyl ghrelin ratios and peptide recovery rates, helping teams compare experimental conditions with greater precision.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining peptide integrity across disease models, supporting biomarker alignment in metabolic research.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable sample preparation capability rather than a single-use technique, enabling consistent application across multiple peptide targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by improving peptide yield and preserving correct molecular forms, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of peptide measurements across sample processing workflows.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing false negatives in low-abundance peptide detection, improving capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets by providing more reliable biomarker data for advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peptide biochemistry and protease inhibition to properly formulate and apply the RAPID buffer.
- Needs access to refrigerated centrifuges, vacuum concentrators, and HPLC systems for sample processing and analysis.
- Demands cross-team standardization of blood collection timing, fasting state, and processing delays to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different peptide classes or sample volumes beyond the validated range.
- Involves higher reagent costs and processing time compared to standard EDTA-on-ice methods, limiting routine use to focused research applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Blood Processing
3:14
Recovery of Radiolabled Peptides
5:15
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Radiolabled Ghrelin
6:50
Radioimmunoassay
8:42
Results: Comparison of RAPID Method Versus Standard Processing for Assessing Plasma Peptide Levels in Human Blood
10:43
Conclusion
