Name: Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Leer een verbeterde bottom-up glycomics-techniek voor het analyseren van glycanen in biofluids met behulp van GC-MS-detectie. Deze methode identificeert ziektegerelateerde glycanveranderingen en ondersteunt vroegtijdige kankerdetectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de College of Liberal Arts and Sciences van Arizona State University in de vorm van laboratoriumstartfondsen aan CRB. Het werd ook ondersteund door een subsidie van de Flinn Foundation (subsidienummer 1977) en door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R33CA191110. JA werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health Postbaccalaureaus-onderzoekseducatieprogramma (PREP) onder toekenningsnummer R25GM071798. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

<ol><li>Li, M., Song, L., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+changes%3A+cancer+metastasis+and+anti-cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines.</a> J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).</li>
<li>Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanley%2C+P+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).</li>
<li>Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+of+protein+glycosylation%2C+as+deduced+from+analysis+of+the+SWISS-PROT+database%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.</a> Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).</li>
<li>Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockhausen%2C+I+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).</li>
<li>Rini, J., Esko, J., Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRini%2C+J+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).</li>
<li>Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+aberrant+tumor-reactive+immunoglobulins+in+the+circulation+of+patients+with+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>An, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+glycans+in+serum+for+the+discovery+of+potential+biomarkers+for+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer.</a> J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).</li>
<li>Kanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+IgG+oligosaccharide+chains+with+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression.</a> Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+serum+glycome+due+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).</li>
<li>Okuyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+marker+for+pancreatic+cancer%3A+a+detailed+analysis+of+the+oligosaccharide+structure+and+a+possible+mechanism+for+fucosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation.</a> Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+microarrays+with+multi-lectin+detection%3A+unique+lectin+binding+patterns+as+a+tool+for+classifying+normal%2C+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+sera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).</li>
<li>Comunale, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+serum+associated+fucosylated+glycoproteins+in+the+development+of+primary+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma.</a> J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).</li>
<li>Goldman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Hepatocellular+Carcinoma+Using+Glycomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis.</a> Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).</li>
<li>Aurer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+of+Igg+heavy+chain+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma.</a> Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).</li>
<li>Abd Hamid, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+to+reveal+potential+glycan+markers+from+serum+glycoproteins+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression.</a> Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+diagnosis+and+prognosis+through+quantitative+measurements+of+serum+glycan+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles.</a> Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Hongsachart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+analysis+of+WGA-bound+glycoprotein+biomarkers+in+sera+from+patients+with+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma.</a> Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).</li>
<li>Arnold, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+glycan+biomarkers+for+the+detection+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).</li>
<li>Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+Fc+N-glycan+profiling+in+patients+with+gastric+cancer+by+LC-ESI-MS%3A+relation+to+tumor+progression+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival.</a> Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc-glycosylation+profiling+reveals+associations+with+age%2C+sex%2C+female+sex+hormones+and+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer.</a> J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).</li>
<li>Takeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+type+of+cancer+biomarker+linked+to+the+prognosis+after+an+operation+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer.</a> Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).</li>
<li>Parekh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+rheumatoid+arthritis+and+primary+osteoarthritis+with+changes+in+the+glycosylation+pattern+of+total+serum+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG.</a> Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).</li>
<li>Mehta, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+galactose-deficient+anti-Gal+immunoglobulin+G+in+the+sera+of+hepatitis+C+virus-infected+individuals+with+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis.</a> J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).</li>
<li>Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutional+and+clinical+implications+of+the+epigenetic+regulation+of+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation.</a> Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).</li>
<li>Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenomics+of+the+human+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenomics of the human glycome.</a> Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).</li>
<li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).</li>
<li>Tuccillo, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+Glycosylation+as+Biomarker+for+Cancer%3A+Focus+on+CD43%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43.</a> Biomed Res Int. , (2014).</li>
<li>Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).</li>
<li>Brockhausen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans+in+human+colon+and+breast+cancer%3A+glycodynamics+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions.</a> EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li>
<li>Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzi%2C+CR+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).</li>
<li>Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+surrogate+analysis+of+glycotransferase+activity+in+whole+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens.</a> Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).</li>
<li>Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Carbohydrate+Derivatives+by+Gas-Liquid+Partition+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography.</a> J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).</li>
<li>Ciucanu, I., Caprita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Per-O-methylation+of+neutral+carbohydrates+directly+from+aqueous+samples+for+gas+chromatography+and+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis.</a> Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+permethylation+of+glycans+for+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis.</a> Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+solid-phase+permethylation+of+glycans+prior+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).</li>
<li>Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+profiling+of+invasive+and+non-invasive+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells.</a> Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).</li>
<li>Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic%2Fchemical+release+of+O-glycans+allowing+MS+analysis+at+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity.</a> Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silanizing+glassware%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Silanizing glassware.</a> Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).</li>
<li>Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aminosugar+linkages+in+glycolipids+by+methylation.+Aminosugar+linkages+of+ceramide+pentasaccharides+of+rabbit+erythrocytes+and+of+Forssman+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen.</a> Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het algemeen is de succesvolle productie van partieel gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs) vanaf hexosen is beladen met minder problemen en is robuuster dan de succesvolle productie van N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Het exacte mechanisme achter dit fenomeen speelt in elke stap van deze procedure is niet bekend, maar moet betrekking hebben op de unieke chemie van de N-acetyl groep (in plaats hydroxylgroep) die uniek is HexNAcs opzichte van hexosen. Het mechanisme achter dit verschijnsel betre...

Glycolipiden, glycoproteïnen, proteoglycanen en glycosaminoglycanen vormen de vier hoofdklassen van complexe heterogene koolhydraten gezamenlijk bekend als glycanen. Zo alomtegenwoordig en een integraal onderdeel van het plasmamembraan, glycocalyx, en extracellulaire matrix en vloeistoffen, glycanen deel te nemen aan zulke uiteenlopende biochemische processen als endocytose, intracellulaire mensenhandel, celmotiliteit, signaaltransductie, moleculaire herkenning, receptor activering, celadhesie, gastheer-pathogeen interactie , intercellulaire communicatie immunosurveillance en immuunrespons initiëren. 1 aanwezig in bijna elk gebied van het leven, enzymen bekend als glycosyltransferasen die glycan polymeren bouwen handelen combinatie met glycoside hydrolasen (ook bekend als glycosidases, wat neerkomt glycanen breken) te bouwen, verbouwen, en uiteindelijk produceren afgerond glycan polymeren 2. Hoewel elk glycosyltransferase kan werken op verschillende glycoconjugaten, een glycosyltransferaseAldus wordt een algemeen linkage- en anomeer specifieke glycosidische binding in door de monosaccharide-eenheid met een bepaalde geactiveerde nucleotidesuiker donor (bijvoorbeeld GDP-fucose) een bepaalde categorie nucleofiele acceptoren (bijvoorbeeld een lipide, polypeptide, nucleïnezuur, of groeien oligosaccharide). Er wordt geschat dat meer dan 50% van de eiwitten (in het bijzonder membraan en secretorische eiwitten) zijn post-translationeel gemodificeerd door glycosylering 3 Rudimentary combinatorische berekeningen geven een waardering voor de grote variabiliteit, veelzijdigheid en specificiteit die aan glycoproteïnen door glycosylering.; bijvoorbeeld als een polypeptide substraat in 10 glycosylatieplaatsen en elke plaats kan een glycosidische binding met 1 van slechts 3 verschillende monosacharide-reducerende uiteinden te vormen, dan het theoretisch uiteindelijke glycoproteïne kan aannemen 3 10 = 59.049 verschillende identiteiten. In glycoproteïnen glucosidebindingen algemeen vormen de zijketen stikstof of asparagine residuen in de sequentie Asn-X-Ser / Thr ter verkrijging van N-glycanen 2 en zijketen hydroxylgroepen van serine en threonine residuen verkregen O-glycanen 4 (X kan elk aminozuur behalve proline is). De samenstelling van glycome een cel (dat wil zeggen, het complement van glycosylering producten) is uniek en beperkt, omdat, op enkele uitzonderingen na, glycosyltransferases vertonen strenge donor, acceptor, en koppeling specificiteit. 5 Belangrijke en overvloedige bloed plasma glycoproteïnen lijden afwijkende glycosylering als downstream gevolg glycosyltransferase van abnormale expressie en activiteit als gevolg van vele pathologische aandoeningen, met name kanker en infectieziekten. 6-24 Voornamelijk als gevolg van epigenetische factoren, de glycome aanzienlijk meer divers, dynamisch en complex dan het proteoom en transcriptoom. 25,26 Terwijl ongeveer 1% van het zoogdiergenoom codeert de vorming, modificatie enassemblage van glycanen, 27 glycosylering verloopt in een niet-matrijs-gestuurde wijze-een schril contrast met polypeptide en nucleïnezuur biosynthese. De interactie tussen de relatieve hoeveelheid en activiteit van glycosylering enzymen en dergelijke omgevingsfactoren als voedingsstof en voorloper beschikbaarheid bepaalt uiteindelijk de aard, de snelheid en de omvang van glycosylering. 5,28 embryogenese (bv, vastberadenheid en differentiatie), cellulaire activatie, en progressie door middel van de celcyclus invloed genexpressie (dwz transcriptie en vertaling) en wijzigen van de identiteit en de hoeveelheid beschikbare glycosyltransferases, waarvan de activiteit is de onmiddellijke stroomopwaarts determinant van de cel glycaan-profiel. Omdat (een deel van) de proliferatieve, lijm, en invasieve eigenschappen van kankercellen lijken op die van gewone embryogene cellen, specifieke veranderingen in glycan biosynthetische routes (bijv voorloper accumulatie, gedereguleerde expressie, aberrant modificatie structurele afknotting of nieuwe vorming) dienen als universele kanker biomarkers die verschillende stadia van tumorvorming, progressie, migratie en invasie 29 geven Hoewel glycosylering is zeer complex, blijkbaar op enkele verbeteringen in glycosylering kunnen carcinogenese en metastase mogelijk.; blijkbaar, bepaalde &quot;afwijkende&quot; glycosyleringsproducten inderdaad kankercellen profiteren door hen in staat om het immuunsysteem erkenning ontwijken en overleven de eisen van de migratie in onherbergzame intravasculaire en metastatische omgevingen. 28,30,31 Niet verrassend, hebben experimenten aangetoond dat de patronen van veranderde verstoren of voorkomen genexpressie en afwijkende glycan vorming kan het ontstaan ​​van tumoren Toch halt toe te roepen. 29, de afwijkende glycanen gedetecteerd in een Biofluid monster (bijvoorbeeld, urine, speeksel en bloed plasma of serum) misschien niet direct indicatoren van kanker (of een andere ziekte), maar stroomafwaarts uitkomsten van subtiele, maar belangrijkeveranderingen in het immuunsysteem of meetbare vertakkingen van een kwaadaardige aandoening bij een onvoorspelbare orgaan. 32 Hoewel ze bieden universele informatie over de glycome, vele moleculaire interactie gebaseerde glycomics technieken (bijvoorbeeld lectine / antilichaam-arrays en metabole / covalente etikettering) afhankelijk van de detectie van de hele glycan structuren en geen gedetailleerde structurele informatie over de verschillende glycanen niet te verstrekken. In contrast, kunnen massaspectrometrie (MS) te identificeren en kwantificeren van individuele glycan structuren en dergelijke structurele informatie de bevestigingsplaatsen om kernen polypeptide te onthullen. Gedereguleerde expressie of activiteit van één glycosyltransferase kan een cascade van schadelijke moleculaire gebeurtenissen in meerdere glycosyleringsroutes initiëren. Omdat elke glycosyltransferase kan werken op meer dan één glycoconjugaat substraat en in verschillende groeiende glycan polymeren, gedereguleerde biosynthese cascades opleveren disproportioneel verhoogde hoeveelheden van één glycan product maar verschillende heterogene klassen van afwijkende glycanen in intra- of extracellulaire vloeistoffen. 33 Dergelijke unieke afwijkende glycanen worden soms onpraktisch als biomarkers voor kanker of andere glycan-affectieve aandoeningen, omdat, vergeleken met de grote pool van goed gereguleerde glycanen, deze afwijkende glycanen slechts een zeer klein deel dat kan vaak niet detecteerbaar blijven zelfs dergelijke zeer gevoelige technieken zoals massaspectrometrie. Bijvoorbeeld in intra- en extracellulaire lichaamsvloeistoffen, het brede eiwitconcentratie spectrum (waarvan acht ordes van grootte overspant) kan detectie van schaarse glycoproteïnen die worden gemaskeerd door de meer voorkomende soort voorkomen. 32 Bovendien bepalen glycosyltransferase activiteit blijft een aanzienlijke praktische en theoretische uitdaging, omdat veel glycosyltransferases afwezig zijn in klinische biovloeistoffen of inactief ex vivo worden. Ondanks de moeilijkheid consistenTLY opsporen en kwantificeren van ultra-kleine hoeveelheden uniek geheel glycanen, hebben beoefenaars van massaspectrometrie enorme vooruitgang geboekt in de richting van het gebruik van intact glycanen klinische markers. Recent hebben wij als aanvulling op de analyse van intacte glycanen dat gebruik GC-MS, vergemakkelijkt de detectie van alle samenstellende branch-point en koppeling-specifieke monosacchariden ( &quot;glycan nodes &#39;) die samen uniciteit verlenen aan elke glycan en in vele gevallen rechtstreeks dienen als moleculaire surrogaten dat de relatieve activiteit van de verwijtbare glycosyltransferase (s) te kwantificeren. Sinds zijn eerste directe toepassing op glycaan analyse in 1958 gemeld, is gaschromatografie (GC) bewezen een krachtige techniek om per-gemethyleerd mono- en disachariden te analyseren, 34 bepalen hun anomericity en absolute configuratie, en ze te scheiden voor daaropvolgende massaspectrometrische analyse. 35 tussen 1984 en 2007, Ciucanu en collega&#39;singevoerd en geraffineerd een vaste fase glycan permethylation techniek die natriumhydroxide en joodmethaan toegepast, gevolgd door vloeistof / vloeistofextractie of gepermethyleerd glycanen met water en chloroform. 35,36 Tussen 2005 en 2008, Kang en medewerkers geïntegreerd een tijdbesparende rotatie -column aanpak in de permethylation stap. 37,38 In 2008, het Goetz onderzoeksgroep bedacht een kwantitatieve vaste fase permethylation glycaan-profilering methode met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatie (MALDI) massaspectrometrie om te vergelijken en mogelijk onderscheid invasieve en niet -invasive borstkankercellen; 39 toen, in 2009, de Goetz team gecombineerde enzymatische en technieken chemische stof in klieven O-glycanen uit intacte glycoproteïnen in een sterk basische vaste fase permethylation regeling 40 Hoewel de Goetz procedure vergemakkelijkt gelijktijdige permethylation en chemische release. van O-glycanen, was het alleen van toepassing op pre-geïsoleerde glycoeiwitten. We pasten deze techniek in 2013 en aangepast voor de hele niet-gefractioneerde biovloeistoffen en monsters gehomogeniseerd weefsel door het opnemen van trifluorazijnzuur (TFA) hydrolyse, reductie en acetylering stappen. 33 Deze extra stappen ook glycanen van glycolipiden en N los gebonden glycanen van glycoproteïnen en om te zetten ze in gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs, figuur 1), waarvan de karakteristieke methylatie-en-acetylering patronen analyse door GC-MS en uniek vergemakkelijken kenmerken de samenstellende glycan knooppunten in de oorspronkelijke intacte glycan polymeer 41 (figuur 2). 33 Uiteindelijk is dit procedure levert een samenstelling portret van de glycanen in een complex Biofluid door directe relatieve kwantificatie van glycan unieke eigenschappen zoals &quot;kern fucosylatie&quot;, &quot;6-sialylering&quot;, &quot;splitsend GlcNAc&quot; en &quot;beta 1-6 vertakking&quot; - elk afgeleid van een GC-MS chromatographic piek. Dit artikel geeft verdere optimalisatie van het permethylation, acetylering, isolatie, en clean-up fase, samen met verbeteringen in de wijze van relatieve kwantificatie.

<table><tbody><tr><td>Sodium hydroxide beads&nbsp;</td><td>367176</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>20-40 mesh, reagent grade 97%</td></tr><tr><td>0.9 ml Spin column</td><td>69705</td><td>Pierce division of ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Inclusief&nbsp; pluggen en polyethyleen frits&nbsp;</td></tr><tr><td>GC-MS autosampler vial (silanized)*</td><td>C4000-9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Target DP High Recovery Vial, 1.5&nbsp;ml, 12&nbsp;mm x 32&nbsp;mm, inclusief Teflon-gecoate prikdoppen</td></tr><tr><td>1.5 ml polypropyleen testbuisjes</td><td>05-402-25</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Snap-cap deksel</td></tr><tr><td>2 ml polypropyleen testbuisjes</td><td>05-408-138</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Snap-cap deksel</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>D8418</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BioReagent voor moleculaire biologie, reagent grade >99.0%</td></tr><tr><td>Iodomethane&nbsp;</td><td>I8507</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Bevat koper als stabilisator, ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>A955-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Optima LC/MS</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>24 x 1.5/2.0 rotor met ClickSeal biocontainment deksel. Rotor catalogusnummer: 75003424</td></tr><tr><td>13 x 100 glazen testbuis (silanized)*</td><td>53283-800</td><td>VWR</td><td>13 mm x 100 mm borosilicaat glazen testbuisjes met schroefdop</td></tr><tr><td>Doppen voor glazen testbuisjes</td><td>14-930-15D</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Kimble&trade; Black Phenolic Screw Caps; 13&nbsp;mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.</td></tr><tr><td>Natriumchloride&nbsp;</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>>99.5% zuiver</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>4440-08</td><td>Macron Fine Chemicals&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur&nbsp;</td><td>299537</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99% gezuiverd door herdistillatie voor eiwitsequentiebepaling&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumborohydride</td><td>71321</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxide oplossing&nbsp;</td><td>320145</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>NH3 inhoud: 28.0-30.0%</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>AH230-4</td><td>Honeywell Burdick &amp; Jackson</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Azijnzuur&nbsp;</td><td>320099</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99.70%</td></tr><tr><td>Kunststof vacuüm exsiccator&nbsp;</td><td>Een model van voldoende grootte</td><td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuuranhydride&nbsp;</td><td>539996</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>Dichloormethaan&nbsp;</td><td>D143SK-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Gestabiliseerde HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>Baker Analyzed&nbsp;</td></tr><tr><td>Verwarmde verdampingsverdeler (hoofdunit)</td><td>pi18823</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Thermo Scientific* Reacti-Therm* Verwarmings- en roermodule; Drievoudig blokmodel met verwarmings- en roerfunctie</td></tr><tr><td>Verwarmde verdampingsverdeler (bovenste verdamper)</td><td>pi18826</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>ThermoScientific* Reacti-Vap Verdamper, 27-poort; Voor gebruik met drievoudig blok Reacti-Therm verwarmingsmodule</td></tr><tr><td>Aluminium monsterhouderblokken voor verdampingsverdeler</td><td>pi18816</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Blok, aluminium, Reacti-Block S-1, houdt 13&nbsp;mm dia testbuisjes, 13 gaten (14&nbsp;mm dia. x 45&nbsp;mm diep)</td></tr><tr><td>Gaschromatograaf</td><td>Model A7890</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Uitgerust met CTC PAL autosampler</td></tr><tr><td>Massaspectrometer&nbsp;</td><td>GCT Premier (Time-of-Flight)</td><td>Waters&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Split-mode liner (gedeactiveerd / silanized)</td><td>5183-4647</td><td>Agilent</td><td>Bevat een kleine plug van silanized glaswol</td></tr><tr><td>DB-5ms GC-kolom</td><td>122-5532</td><td>Agilent</td><td>30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron filmdikte</td></tr><tr><td>Chloortrimethylsilaan</td><td>95541</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glazen vacuüm exsiccator (voor silanisering van glaswerk)</td><td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer</td><td>12" breed; 230 mm plaatmaat</td></tr><tr><td colspan="4">*Silanisering van glaswerk wordt in huis uitgevoerd, overnacht met chlorotrimethylsilaan damp in een grote glazen vacuüm exsiccator.</td></tr></tbody></table>

glycan node analyse: een bottom-up benadering van glycomics

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycans, gesynthetiseerd in een niet-sjabloon-gedreven proces door enzymen genaamd glycosyltransferasen, spelen een sleutelrol in verschillende belangrijke intra- en extracellulaire gebeurtenissen. Veel pathologische aandoeningen, met name kanker, beïnvloeden de genexpressie, wat op zijn beurt de relatieve abundantie en activiteitsniveaus van glycosidasehydrolase- en glycosyltransferase-enzymen kan dereguleren. Unieke abnormale hele glycanen die het gevolg zijn van gedereguleerde glycosyltransferase(s) zijn vaak aanwezig in sporenhoeveelheden binnen complexe biovloeistoffen, waardoor hun detectie moeilijk en soms stochastisch is. Echter, met de juiste monstervoorbereiding kan een van de oudste vormen van massaspectrometrie (gaschromatografie-massaspectrometrie, GC-MS) routinematig de verzameling van takpunt- en koppelingsspecifieke monosachariden ("glycan-knooppunten") detecteren die aanwezig zijn in complexe biovloeistoffen. Als aanvulling op traditionele top-down glycomics-technieken omvat de hier besproken aanpak het verzamelen en condenseren van elk afzonderlijk glycan-knooppunt in een monster tot een enkele onafhankelijke analytische signaal, wat gedetailleerde structurele en kwantitatieve informatie biedt over veranderingen in het glycoom als geheel en onthult mogelijk gedereguleerde glycosyltransferasen. Verbeteringen aan de permethylatie en de daaropvolgende vloeistof/vloeistof-extractiefasen die hier worden geboden, verbeteren de reproduceerbaarheid en het totale opbrengst door minimale blootstelling van pergemethyleerde glycanen aan alkalische waterige omstandigheden te vergemakkelijken. Wijzigingen in de acetyleringsfase verhogen verder de mate van reactie en het totale opbrengst. Ondanks hun reproduceerbaarheid, blijken de totale opbrengsten van N-acetylhexosamine (HexNAc) gedeeltelijk pergemethyleerde alditolacetaten (PMAA's) inherent lager te zijn dan hun verwachte theoretische waarde ten opzichte van hexose PMAA's. Het berekenen van de verhouding van de oppervlakte onder het geëxtraheerde ionenchromatogram (XIC) voor elke individuele hexose PMAA (of HexNAc PMAA) tot de som van dergelijke XIC-gebieden voor alle hexosen (of HexNAcs) biedt een nieuwe normalisatiemethode die relatieve kwantificering van individuele glycan-knooppunten in een monster mogelijk maakt. Hoewel momenteel beperkt in termen van zijn absolute detectielimieten, versnelt deze methode de analyse van klinische biovloeistoffen en toont aanzienlijk potentieel als een aanvullende aanpak voor traditionele top-down glycomics.

Een totale ionenstroom chromatogram (TIC) weergegeven succesvol permethylation, hydrolyse, reductie en acetylering van humaan bloedplasma monsters ten opzichte van gevallen waarin twee belangrijke stappen permethylation correct zijn uitgevoerd zijn getoond in figuur 3. Absolute Opbrengst van HexNAcs Ten opzichte van hexosen: N -ace...

Dit artikel presenteert een verbeterde vorm van een nieuwe bottom-up glycomische techniek die is ontworpen om het gepoolde samenstellingsprofiel van glycanen in niet-gefractioneerde biofluiden te analyseren door de chemische afbraak van glycanen in hun samenstellende bindingsspecifieke monosacchariden voor detectie door GC-MS. Mogelijke toepassingen omvatten vroege detectie van kanker en andere glycan-beïnvloedende aandoeningen.

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Het algemene doel van deze procedure is om alle glycanen in een biologisch monster af te breken, terwijl de monosacharidesamenstelling en informatie over de koppelingen behouden blijven. Hierdoor worden interessante glycaankenmerken, zoals sialisering en bisecterend N-Acetylglucosamine, gedestilleerd tot enkele analytische signalen. Deze methode kan helpen om direct belangrijke vragen in het veld van de glycomiek te beantwoorden, zoals welke unieke glycaankenmerken veranderd zijn bij specifieke ziektebeelden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat glycaan-kenmerken die vaak veranderen bij ziekten, zoals bèta 1-6 vertakking en core-fucosylering, worden gedestilleerd tot enkele analytische signalen in plaats van verspreid te zijn over meerdere intacte glycanen. Over het algemeen hebben personen die deze methode uitvoeren veel moeite met lage opbrengsten van N-acetylcystëïnes als gevolg van onjuiste verwerking van vers permethylated glycanen. Bereid de monsters voor door eerst 9 µL van elke biologische analyt over te brengen naar afzonderlijke 1,5 mL reageerbuisjes.Voeg aan elk monster 1 µL gedeïoniseerd water en 270 µL hoogzuivere DMSO toe. Meng deze vervolgens krachtig door middel van vortexen. Assembleer na de monstervoorbereiding de met natriumhydroxide geladen spinzuilen zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg met een analytische spuit 105 µL jodiummethaan toe aan elke analyt en sluit de buisjes onmiddellijk af. Vortex de monsters grondig. Verwijder de dopjes van de eerder geprepareerde spinzuilen en centrifugeer deze 15 seconden bij 2.400 Gs. Gooi de opvangbuisjes en het effluent weg, plaats de dopjes terug op de zuilen en zet deze in een nieuwe set buisjes, gelabeld voor elke analyt.Gebruik een 1000 µL pipetpunt om elke analytoplossing over te brengen naar de overeenkomstige spincolumn. Zodra de analytoplossing is toegevoegd, knijp je ongeveer twee millimeter van het uiteinde van een 200 µL pipetpunt af en laat je de punt in de column zitten om als roerder te dienen. Gebruik de pipetpunten om de columns elke twee tot drie minuten voorzichtig te roeren.Koppel na 11 minuten de kolommen los en centrifugeer deze 15 seconden bij 2.400 Gs. Verwijder onmiddellijk de spin-kolommen en plaats ze in nieuwe opvangbuisjes; bewaar de doorloopvloeistof, maar gooi de dopjes weg. Voeg 300 µL acetonitril toe aan de kolommen en centrifugeer deze 30 seconden bij 9.600 Gs. Draag nu de eerste permethylated doorloopvloeistoffen over naar gesilaniseerde glazen reageerbuisjes die 3,5 mL natriumfosfaatbuffer bevatten. Zorg ervoor dat het overgedragen supernatant helder is en dat er geen vaste stoffen worden overgebrengt.Er zal zich een klein wit pellet hebben gevormd op de bodem van de plastic buisjes. Vermijd het overbrengen van enig zichtbaar vast materiaal. Indien dit niet gebeurt, zal dit leiden tot een lage opbrengst van N-Acetylcysteine-glucosamine glycaan-notities.Vortex elk monster in de batch onmiddellijk nadat alle monsters zijn overgebracht. Voeg vervolgens de doorloopoplossingen van acetonitril samen met de rest van de vloeistof in de respectievelijke reageerbuisjes. Vermijd tijdens deze stap opnieuw het overbrengen van enig vast, wit residu.Sluit de buizen, schud en vortex de gecombineerde oplossingen onmiddellijk voordat u overgaat naar het volgende monster. Voeg na permethylering in een zuurkast 1,2 milliliters chloroform toe aan elke reageerbuis. Sluit vervolgens de buizen en meng de inhoud krachtig.Om de lagen te scheiden, worden de oplossingen kort gecentrifugeerd bij 3,000 Gs. Gebruik een Pasteurpipet om het grootste deel van de bovenste waterige laag te verwijderen en weg te gooien, waarbij ongeveer drie milliliters van de laag achterblijft. Voeg 3,5 milliliters van de 0,2 molar natriumfosfaatbuffer toe, sluit de reageerbuis vervolgens af, meng deze en centrifugeer de buis. Voer deze vloeistof/vloeistof-extractiestap in totaal drie keer uit.Laat ongeveer one milliliter van de waterige fase achter in de laatste extractie. Gebruik nu een schone, gesilaniseerde Pasteurpipet om de chloroformlaag voorzichtig over te brengen naar een schone en gelabelde gesilaniseerde glazen reageerbuis, zoals beschreven in het tekstprotocol. Droog de monsters onder een zachte stroom nitrogeen gas in een voorverwarmde verdampingsmanifold, ingesteld op 75 °C.Zorg ervoor dat de gasstroom het vloeistofoppervlak verstoort, maar zonder het te doen spatten. Zodra de monsters droog zijn, zijn ze klaar voor hydrolyse. Voeg 325 µL 2 M trifluorazijnzuur of TFA toe aan elk monster en meng goed.Sluit elke monsterbuis onmiddellijk na toevoeging aan alle monsters stevig af om verdamping van TFA en monsterverlies tijdens de daaropvolgende verhittingstap te voorkomen. Incubeer de monsters gedurende twee uur bij 121 degrees celsius om de glycanen te hydrolyseren. Bereid, terwijl de monsters incuberen, opnieuw het verdampingsmanifold voor bij 75 degrees celsius.Droog de monsters na incubatie onder een constante stroom stikstof in de verdampingsmanifold. Controleer de monsters regelmatig om ervoor te zorgen dat ze worden gedroogd met de kleinst mogelijke droogtijd. Voeg aan elk monster 475 µL natriumborhydride (10 g/L) toe.Meng de monsters vervolgens grondig om eventuele resten op te lossen. Sluit de reageerbuisjes af en laat de reductiereactie gedurende één uur doorgaan. Voeg daarna 63 µL methanol toe aan elk monster.Meng de monsters en droog deze vervolgens bij 75 °C onder stikstof. Voeg aan elk monster 125 µL methanollosning in azijnzuur toe. Meng de monsters en droog deze opnieuw bij 75 °C onder stikstof.Zorg ervoor dat de monsters volledig droog zijn door ze gedurende 20 minuten onder vacuüm te plaatsen. Voeg na het drogen 18 µL gedeïoniseerd water toe aan elk monster. Centrifugeer de monsters vervolgens kort en meng ze goed om het neerslag op te lossen.Voeg vervolgens 250 µL azijnzuuranhydride toe aan elke buis. Sluit de buizen af, vortex deze grondig en soniceer de monsters gedurende twee minuten in een waterbad om volledige oplossing van eventuele residuen te waarborgen. Incubeer de monsters vervolgens gedurende 10 minuten bij 50 °C.Voeg nu 230 µL geconcentreerd TFA toe aan elk monster. Sluit de monsters af, meng ze en incubeer ze gedurende 10 minuten bij een interne temperatuur van 50 °C. Voeg 1,8 mL dichloormethaan toe aan elk monster en meng dit goed.Voeg vervolgens twee milliliters gedeïoniseerd water toe aan de buis en voer tweemaal een vloeistof-vloeistofextractie uit. Herwin de dichloormethaanlaag met een gesilaniseerde Pasteurpipet. Overbreng dit naar een autosampler-vial en droog het monster vervolgens onder stikstof bij 74 degrees celsius.Reconstitueer voor GC-MS de monsters elk met 120 µL aceton, sluit ze af en meng ze grondig. Gebruik in split-modus een autosampler om één µL van elk monster in de GC split-mode liner te injecteren. Voor time-of-flight massaspectrometers wordt een split-ratio van 40 en heliumgas in constante stroommodus bij 0,8 mL/min aanbevolen.Analyseer het monster met een gradiënt in twee stappen die 325 °C bereikt. Onderwerp de eluerende monstercomponenten aan elektronenimpactionisatie. Analyseer voor een time-of-flight massaanalyser fragmenten m/z 40 tot 800 met een pulssommatiesnelheid van 0,1 seconde.Om de gevoeligheid van dit protocol aan te tonen, is een biologisch monster zorgvuldig verwerkt. Het resulterende chromatogram vertoont een adequate intensiteit tussen de gewenste productpieken voor een eenvoudige vergelijking en analyse. Vervolgens is hetzelfde biologische startmonster met dezelfde procedure verwerkt.Maar het witte residu in de permethylatie-oplossing die door de NaOH-kolom was gecentrifugeerd, kwam terecht in het daaropvolgende mengsel voor vloeistof/vloeistofextractie. Het chromatogram vertoont een andere verhouding in piekintensiteit van dezelfde belangrijkste monsterproducten. Bij een directe vergelijking is het verschil frappant.De duidelijke daling van de piek van het op positie 4 gekoppelde N-acetylglucosamine in het tweede chromatogram is een herkenbaar kenmerk van een mislukte permethylering en extractie. Om het nut van deze aanpak voor het detecteren van verschillen in glycaansamenstelling bij ziektebeelden te illustreren, worden geëxtraheerde ionenchromatogrammen van een normaal bloedplasmaproef en een bloedplasmaproef van een kankerpatiënt genormaliseerd voor 2-gekoppelde mannose en over elkaar gelegd. Kwantitatieve verschillen in unieke glycaanfuncties, zoals bèta 1-6 vertakking en verhoogde sialylering, zijn direct duidelijk zichtbaar.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een bottom-up glycomics glycaanknoop-analyse uitvoert. Dit vergemakkelijkt de distillatie van interessante glycaankenmerken, zoals core-fucosylering, siallylering en bisecterende glycanen, tot enkele analytische signalen.

glycan-node-analysis-a-bottom-up-approach-to-glycomics

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Om de diversiteit van O-gekoppelde glycanen grondig te onderzoeken, wordt een nieuwe procedure voor in-gel reducerende β-eliminatie, gecombineerd met permethylering en een snelle fase-verdelingsmethode, toegepast op de analyse van O-gekoppelde glycanen die direct vrijkomen uit glycoproteïnen opgelost door SDS-PAGE en bruikbaar voor verdere glycomics-analyse door massaspectrometrie.

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan matrix (PGA) technologie voor de analyse van de circulerende anti-koolhydraten antistoffen bij kleine dieren.

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

Open zoeken maakt de identificatie van glycopeptiden versierd met voorheen onbekende glycaansamenstellingen mogelijk. In dit artikel wordt een gestroomlijnde aanpak voor het uitvoeren van open zoekopdrachten en daaropvolgende glycaangerichte glycopeptide-zoekopdrachten gepresenteerd voor bacteriële monsters met behulp van Acinetobacter baumannii als model.

De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Dit protocol illustreert hoe menselijke eiwitglyomen kunnen worden verkend, vergeleken en geïnterpreteerd met online bronnen.

Bioinformatica Bronnen voor de Studie van Glycan-Gemedieerde Eiwit Interacties

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Een begeleide materiaal screening benadering van sol-gel afkomstig eiwit gedoteerde microarrays met behulp van een opkomende methode pin-drukken van fabricage ontwikkeling wordt beschreven. Deze methode wordt aangetoond door de ontwikkeling van acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays, die voor rendabele kleine moleculen screening.

A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays

Leer een verbeterde bottom-up glycomics-techniek voor het analyseren van glycanen in biofluids met behulp van GC-MS-detectie. Deze methode identificeert ziektegerelateerde glycanveranderingen en ondersteunt vroegtijdige kankerdetectie.

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Meer video's verkennen