Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Het algemene doel van deze procedure is om alle glycanen in een biologisch monster af te breken terwijl de monosaccharidesamenstelling en koppelingsinformatie behouden blijven. Het vergemakkelijkt de destillatie van interessante glycaneigenschappen zoals zieke cyalalatie en bisecting N-Acetylglucosamine tot enkele analytische signalen. Deze methode kan helpen om direct antwoord te geven op sleutelvragen op het gebied van glycomieten, zoals welke unieke glycaneigenschappen veranderd zijn in specifieke ziektetoestanden.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat glycaneigenschappen die geneigd zijn om te veranderen bij ziekte, zoals bèta 1-6 vertakking en corfulcosulatie, worden gedistilleerd tot enkele analytische signalen in plaats van verspreid over meerdere intacte glycanen. Over het algemeen hebben individuen die deze methode toepassen, echt last van slechte opbrengsten van N-Acetylcysteïnen als gevolg van onjuiste verwerking van vers permethyleerde glycanen. Bereid de monsters voor door eerst negen microliter van elk biologisch analiet over te brengen in afzonderlijke 1,5 milliliter testbuisjes.

Voeg aan elk monster één microliter gedeïoniseerd water en 270 microliter hoogzuiver DMSO toe. Meng ze krachtig door te vortexen. Na monstervoorbereiding worden de met natriumhydroxide geladen spinkolommen geassembleerd zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg met behulp van een analytische spuit 105 microliter jodomethaanges toe aan elk analiet en sluit de buisjes onmiddellijk. Vortex de monsters grondig. Haal de eerder bereide spinkolommen los en centrifugeer ze gedurende 15 seconden bij 2.400 Gs. Gooi de reservoirbuisjes en het afval weg, sluit de kolommen weer en plaats ze in een nieuwe set buisjes, gelabeld voor elk analiet.

Gebruik een 1000 microliter pijpkop om elke analyt-oplossing over te brengen naar de corresponderende spinkolom. Zodra de analytoplossing is toegevoegd, draai ongeveer twee milliliter van het uiteinde van een 200 microliter pijpkoptip af en laat de tip in de kolom zitten om als roerder te dienen. Gebruik de pijpkoptips om de kolommen eens in de twee tot drie minuten voorzichtig te roeren.

Na 11 minuten haalt u de kolommen los en centrifugeert u ze gedurende 15 seconden bij 2.400 Gs. Haal onmiddellijk de spinkolommen los en plaats ze in nieuwe reservoirbuisjes, bewaar de doorstroomoplossing maar gooi de pluggen weg. Voeg aan de kolommen 300 microliter acetonitril toe en centrifugeer ze 30 seconden bij 9.600 Gs. Breng vervolgens de eerste permethyleerde doorstroomoplossingen over in gesilaniseerde glazen testbuisjes met 3,5 milliliter natriumfosfaatbuffer. Zorg ervoor dat de overgebrachte supernatant helder is en dat er geen vast materiaal wordt overgebracht.

Er zal een klein wit pelletje ontstaan op de bodem van de plastic buisjes. Vermijd het overbrengen van duidelijk zichtbaar vast materiaal. Als u dit niet doet, zullen er slechte opbrengsten van N-Acetylcysteïne-glucosamine glycan-notities ontstaan.

Vortex onmiddellijk elke monster in de batch zodra alle monsters zijn overgebracht. Combineer vervolgens de acetonitril doorstroomoplossingen met de rest van de vloeistof in de respectieve testbuisjes. Vermijd opnieuw het overbrengen van vast, wit residu tijdens deze stap.

Sluit, schud en vortex de gecombineerde oplossingen onmiddellijk voordat u naar het volgende monster gaat. Voeg na permethylatie 1,2 milliliter chloroform toe aan elke testbuis in een afzuigkap. Sluit vervolgens de buisjes en meng de inhoud krachtig.

Om de lagen te scheiden, centrifugeer de oplossingen kort bij 3.000 Gs. Gebruik een weiland pijpkop om de meeste van de bovenste waterige laag te extraheren en weg te gooien, waarbij ongeveer drie milliliter van de laag achterblijft. Voeg 3,5 milliliter van de 0,2 molaire natriumfosfaatbuffer toe en sluit vervolgens, meng en centrifugeer de testbuis. Voer deze vloeistof/vloeistof-extractiestap in totaal drie keer uit.

Laat ongeveer één milliliter van de waterige laag achter in de laatste extractie. Gebruik nu een schone, gesilaniseerde weiland pijpkop om de chloroformlaag voorzichtig over te brengen naar een schone en gelabelde, gesilaniseerde glazen testbuis zoals beschreven in het tekstprotocol. Droog de monsters in een voorverwarmd verdampingsstelsel, ingesteld op 75 graden Celsius, onder een zachte stroom stikstofgas.

Zorg ervoor dat de gasstroom het vloeistopoppervlak verstoort, maar zonder dat het spat. Zodra de monsters droog zijn, zijn ze klaar voor hydrolyse. Voeg 325 microliter van 2 Molair trifluorazijnzuur of TFA toe aan elk monster en meng goed.

Sluit elk monsterbuisje onmiddellijk na toevoeging aan alle monsters stevig af om TFA-verdamping en monstersverlies tijdens de daaropvolgende verwarmingsstap te voorkomen. Incubeer de monsters gedurende twee uur bij 121 graden Celsius om de glycanen te hydroliseren. Terwijl de monsters incuberen, bereidt u het verdampingsstelsel opnieuw voor op 75 graden Celsius.

Na incubatie droogt u de monsters onder een gelijkmatige stroom stikstof in het verdampingsstelsel. Controleer regelmatig de monsters om ervoor te zorgen dat ze gedroogd zijn met behulp van de minimale droogijd die mogelijk is. Voeg aan elk monster 475 microliter van 10 gram per liter natriumborohydride toe.

Meng vervolgens de monsters grondig om eventueel aanwezig residu op te lossen. Sluit de testbuisjes en laat de reductiereactie een uur lang doorgaan. Voeg vervolgens 63 microliter methanol toe aan elk monster.

Meng en droog vervolgens de monsters bij 75 graden Celsius onder stikstof. Voeg 125 microliter methanol toe aan de azijnzuuroplossing voor elk monster. Meng en droog vervolgens de monsters opnieuw bij 75 graden Celsius onder stikstof.

Zorg ervoor dat de monsters volledig droog zijn door ze 20 minuten onder vacuüm te plaatsen. Voeg na het drogen 18 microliter gedeïoniseerd water toe aan elk monster. Centrifugeer vervolgens de monsters kort en meng ze goed om een neerslag op