Name: Intratracheale toediening van Haemophilus influenzae In muismodellen om te studeren luchtwegontsteking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer intratracheale inoculatie van Haemophilus influenzae in muizen om luchtwegontsteking en immuunresponsen te bestuderen. Deze efficiënte methode levert betrouwbare resultaten voor inflammatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Carson Harrod voor het kritische lezen van het manuscript. We bedanken ook de heer Minghui Zeng en Drs. Mahesh Kathania en Prashant Khare voor hun bijdragen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Cancer Society (Research Scholar-subsidie, 122713-RSG-12-260-01-LIB) en het Sammons Cancer Center (Pilot Project-subsidie) aan K. Venuprasad.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Baylor Research Institute. 1. Het kweken van niet-typeerbare Haemophilus influenzae (NTHi) en voorbereiden Inoculum <ol><li> NTHi plaat op een chocolade agar plaat en houden de plaat ondersteboven in een bevochtigde CO2 incubator gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO2. De volgende dag, de cultuur van de bacteriën in de hersenen het hart infusie bouillon. Voeg vervolgens 1 ml van de kweekvloeistof in een steriele 1,5 ml buis. </li><li> Centrifugeer bij 4000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml steriel 1x PBS. Herhaal deze stap een keer. </li><li> Transfer 100 ul geresuspendeerde oplossing in 900 pl 1x PBS en meet de absorptie van de verdunde kweek bij golflengte 600 nm in een spectrofotometer. </li><li> Bepaal de levensvatbaarheid en kiemgetals (CFU&#39;s) van het inoculum door het kweken 01:10 seriële verdunningen op chocolade-agarplaten en gedurende de nacht incuberen bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Gebaseerd op de levensvatbaarheid en CFU&#39;s bepaald uit de vorige stap, passen de entmateriaal tot een eindconcentratie van 20 x 10 6 CFU / ml. </li></ol> 2. intratracheale (it) Blaasinstillatie <ol><li> Injecteer de muis intraperitoneaal (ip) met 0,1 ml / 10 g lichaamsgewicht van muizen met 150 mg / ml ketamine + 20 mg / ml xylazine oplossing. De procedure moet worden gedaan in de kap met een lichtbron om het dier warm te houden. </li><li> Knijp de tussenklauwspleet van de muis om te controleren of de muis op adequate wijze wordt verdoofd. </li><li> Plaats de muis op de rug. Scheer de ventrale gebied van de nek en ontsmet met chloorhexidine en 70% ethylalcohol. </li><li> Til de huid van het bovenste ventrale deel van de nek met behulp rat tand tang. Voeg een kleine incisie (0,5-1,0 cm) boven de thymus met behulp van een scalpelen zorgvuldig ontleden de spier de luchtpijp bloot. <ol><li> Met behulp van een 1 ml spuit met een 27 G naald en injecteer langzaam 0,05 ml lucht, gevolgd door 0,05 ml NTHi verkregen afdeling 1 of zoutoplossing als controle, gevolgd door nog 0,05 ml lucht. Houd dier verticaal voor ongeveer 1 min. </li></ol></li><li> Sluit de incisie met chirurgische lijm. Houd de muis zijwaarts ligfiets en warm voor ongeveer 10 minuten. </li></ol> 3. BALF Collection <ol><li> Offer de muis door cervicale dislocatie 24 uur na infectie. </li><li> Open de buikholte van de muis met anatomische schaar en snijd de ventrale aorta te bloeden. Expose het ventrale deel van de long. </li><li> Expose de luchtpijp en intuberen het met een 20 gauge katheter. Inboezemen 0,8 ml BALF buffer (1x PBS, 0,1% dextrose, 10 U / ml heparine) en het verzamelen van de lavage door zachte aspiratie. Herhaal deze procedure drie keer. </li><li> Tel het aantal cellen in 100 ui BALF suspensie op met een hemocytometer onder 10x vergroting met trypan Blue kleuring. </li><li> Bereid je dia&#39;s voor gemodificeerde Giemsa kleuring. Aliquot 100 ul van BALF in de geschikte putjes van de Cytospin en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Droog de objectglaasjes gedurende 10 minuten en vlekken op de cellen onder toepassing van gemodificeerde Giemsa-kleuring volgens de protocollen van de fabrikant. </li><li> Met de resterende cellen voor daaropvolgende analyse, zoals fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), confocale microscopie, genexpressie en Western blot 11-13. </li></ol> 4. Histopathologie Voorbereiding <ol><li> Voor histopathologie-analyse, infecteren muizen met NTHi zoals beschreven in stap 2.4. Na 24 uur van de infectie, offeren de dieren door cervicale dislocatie. Opengesneden de borstholte anatomische schaar om de longen en luchtpijp zoals eerder vermeld bloot. Steek dan de 20 gauge katheter in de luchtpijp. </li><li> Vul de long met 2% agarose warme oplossing bereid in 4% formaline. Zodra delongen volledig opgeblazen, plaats ijs bovenop de longen naar de agarose oplossing stollen. </li><li> Verwijder dan voorzichtig de thoracale stekker en zet het in een 50 ml oplossing van 4% formaline in 1x PBS totdat het wordt verwerkt voor hematoxyline en eosine (H &amp; E) secties. </li></ol> 5. FACS kleurende cellen in de BALF <ol><li> Zet 1 x 10 5 cellen uit de BALF vloeistof in een 96-well V-bodem microtiterplaat. </li><li> Was de cellen met 300 pi koude 1x PBS en centrifugeren bij 4000 g gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Vlekken op de cellen met een oplossing cel vlek in 100 pl 1x PBS (1: 1000 verdunning) en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Was de cellen met 300 pi koude 1x PBS bij 4000 g gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Blijf cellen in 100 gl FACS wasbuffer [wasbuffer (1 x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% natriumazide] met 1: 100 verdund Fc-Block for 15 min bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer cellen bij 4000 xg gedurende 3 minuten en gooi supernatant. </li><li> Vlek cellen met 100 pi oppervlak kleuring cocktail (1: 100 verdunning) in FACS wasbuffer gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen drie maal met 300 ui FACS wasbuffer bij 4000 g gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Fix cellen in 100 pi 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen tweemaal met 300 gl 1 x PBS bij 400 g gedurende 3 min bij 4 ° C en resuspendeer in 300 ul FACS wasbuffer. </li><li> Maak een kleur kleuring controles met behulp van flowcytometrie kralen. <ol><li> Één druppel kralen in de 96-well V-bodem microliter plaat en wassen met 200 pl 1x PBS. </li><li> Voeg 1 pl kleuring antilichaam aan 100 pl 1x PBS en kralen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Was kralen tweemaal met 300 pl 1x PBS. </li></ol></li><li> Analyseer enkele gekleurde controles en cellen door flowcytometrie 14. </li></ol> 6. Homogenisatie van longweefsel RNA isoleren <ol><li> Na infectie, het verzamelen van een klein stukje van de long (20-40 mg) en bewaar het in RNA stabiliserend reagens bij 4 ° C gedurende de nacht. Vervolgens slaan bij -80 ° C tot de volgende stap. </li><li> Was het longweefsel in koude 1x PBS om zich te ontdoen van het RNA stabilisatie reagens te krijgen. </li><li> Plaats het weefsel in een 1,5 ml centrifugebuis bevattende lysisbuffer (1 ml lysis buffer + 10 gl β-mercaptoethanol). </li><li> Hak het weefsel in kleine stukjes met behulp van puntige schaar en homogeniseren met behulp van een draadloze motor pellet stamper voor 20-40 sec. </li><li> Houd het lysaat op ijs gedurende 5 minuten en ga verder met stap 7.1. </li></ol> 7. RNA isolatie uit de Lung <ol><li> Centrifugeer het lysaat bij 18.000 xg gedurende 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren voorzichtig overbrengen naar een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 1 volume 70% ethanol aan het lysaat. Meng onmiddellijk door pipetteren en wacht 2-4 min. </li><li> Transfer tot 700 ul lysaat een spinkolom geplaatstin een 2 ml verzamelbuis. </li><li> Centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec en gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voeg 350 ul stringente wasbuffer en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voeg 80 ul DNase I direct naar spinkolom membraan en bewaren bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Voeg 350 ul stringente wasbuffer om de spin kolom en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voeg 500 ul RNA wasbuffer en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voeg 500 ul RNA wasbuffer en draaien op 9600 xg gedurende 2 minuten. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voeg 30-50 ul RNase-vrij water direct naar spinkolom en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 1 min. RNA opslag bij -80 ° C. </li><li> Voer RNAseq analyse 14. </li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+asthma+and+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).</li>
<li>Sethi, S., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+the+pathogenesis+and+course+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+Immune+Response+to+Nontypeable+Haemophilus+influenzae+%28Lung+Immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi).</a> J Immunol Res. 2015, 706376(2015).</li>
<li>Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+microbiology+and+cellularity+in+children+with+newly+diagnosed+non-CF+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis.</a> Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).</li>
<li>King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+PT+%22Respir+Med%22">Respir Med</a>. 101, 1633-1638 (2007).</li>
<li>Shuto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NF-kappa+B+by+nontypeable+Hemophilus+influenzae+is+mediated+by+toll-like+receptor+2-TAK1-dependent+NIK-IKK+alpha+%2Fbeta-I+kappa+B+alpha+and+MKK3%2F6-p38+MAP+kinase+signaling+pathways+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).</li>
<li>Moghaddam, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+lysate+induces+aspects+of+the+chronic+obstructive+pulmonary+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+exposure+to+bacterial+superantigens+induces+airway+inflammation+in+HLA+class+II+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice.</a> Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).</li>
<li>Ganesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase%2FLPS-exposed+mice+exhibit+impaired+innate+immune+responses+to+bacterial+challenge%3A+role+of+scavenger+receptor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A.</a> Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).</li>
<li>Hogner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-expressed+IFN-beta+contributes+to+apoptotic+alveolar+epithelial+cell+injury+in+severe+influenza+virus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia.</a> PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).</li>
<li>Karisola, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+Natural+Killer+T+Cells+Play+a+Role+in+Chemotaxis%2C+Complement+Activation+and+Mucus+Production+in+a+Mouse+Model+of+Airway+Hyperreactivity+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation.</a> PloS one. 10, e0129446(2015).</li>
<li>Theivanthiran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+Itch+inhibits+p38alpha+signaling+and+skin+inflammation+through+the+ubiquitylation+of+Tab1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1.</a> Sci Signal. 8, 22(2015).</li>
<li>Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+the+ubiquitin+ligase+Itch+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation.</a> Immunol Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin wij een unieke en minimaal invasieve procedure beschrijft de longen van muizen te inoculeren met een bacteriële ziekteverwekker long. We tonen aan dat deze procedure kan worden gebruikt om de functie van verschillende genen bij muizen die deficiënt zijn in de genen van inflammatoire signaalroutes zijn bestuderen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de ontstekingsreacties op virale en fungale longinfecties bestuderen. De voordelen van deze werkwijze ten opzichte van andere werkwijzen zoals intranasale of aër...

Ontsteking is een fundamenteel immuun mechanisme van verdediging tegen infectieuze agentia. Het bevordert pathogeen uitroeiing en de reparatie van beschadigd weefsel. Het vergemakkelijkt ook het herstel naar een normale gezonde toestand 1. Echter, ontregelde ontsteking leidt vaak tot chronische ontstekingsziekten 2. Luchtwegontsteking een initiële trigger voor verschillende longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), astma en longfibrose 3. De niet-typeerbare (ingekapseld) Haemophilus influenzae (NTHi) is geassocieerd met chronische bovenste en onderste long ontstekingsziekten 4,5. Het is de dominante species geïsoleerd uit de lagere luchtwegen van kinderen en volwassenen met chronische obstructieve longziekte 4,6,7. De ontstekingsreactie na NTHi infectie wordt gekenmerkt door de verhoogde expressie van pro-inflammatoire cytokinen (zoals TNF en IL-1β) en wordt gemedieerd by mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) en nucleaire factor-kB (NF-KB) door middel van toll-like receptoren (TLRs) 8. Muis zijn zeer nuttige hulpmiddelen voor het analyseren van de onderliggende pathologie van long- ontsteking vanwege de beschikbaarheid van verschillende gen-deficiënte lijnen. Verscheidene methoden zijn voor levende / verzwakte bacteriën en bacteriële producten, waaronder intranasale instillatie en aërosol inhalatie 9,10 inoculeren. Hier tonen we intra-tracheale instillatie. Hoewel minder frequent gebruikt, deze benadering is efficiënter en zeer reproduceerbare vanwege de directe levering van het entmateriaal tot de onderste luchtwegen.

<table><tbody><tr><td>Chocolate agar plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Deft quick solution</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needle 20/26G&nbsp;</td><td>BD</td><td>(REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml syringe</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Catheter 20GA</td><td>BD</td><td>REF 381433</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, straight, 10 cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps, serrated, 10cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600095</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml polystyrene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp; kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestile motor (Tissue homoginizer)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 well microtiter plates V bottom</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Werkverdunning 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Werkverdunning 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubes polystyrene round bottom tube</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intratracheale toediening van<em&gt; haemophilus influenzae</em&gt; in muismodellen om te studeren luchtwegontsteking

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Hier hebben we een gedetailleerde procedure te beschrijven om efficiënt en rechtstreeks te leveren Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. We tonen de procedure voor het bereiden van H. influenzae entstof, intratracheale indruppeling van H. influenzae in de longen, het verzamelen van broncho-alveolaire lavage vloeistof (BALF), analyse van immuuncellen in de BALF en RNA-isolatie van differentiële genexpressie analyse. Deze procedure kan worden gebruikt om de long ontstekingsreactie op bacteriën, virussen of fungi. Direct tracheale instillatie wordt meestal de voorkeur boven intranasale of aërosol inhalatie procedures omdat het efficiënter levert het bacteriële inoculum in de onderste luchtwegen minder dubbelzinnigheid.

Intratracheale instillatie leidde tot een duidelijk verhoogde aantal leukocyten in BALF (Figuur 1A, linkerpaneel) inrichtingskosten met zoutoplossing. De differentiële telling analyse van de leukocyten bleek duidelijk toegenomen infiltratie van neutrofielen (figuur 1, rechter paneel). De FACS analyse van de cellen in de BALF voorts bevestigd het toegenomen aantal neutrofielen (figuur 1B). Histologische analyse van H &amp; E-gekleurde cou...

We demonstreren de procedure voor intra-tracheale inoculatie van Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. Dit is een zeer nuttige tool om signaleringsroutes te bestuderen die luchtwegontsteking reguleren in muismodellen.

Intratracheale toediening van<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In muismodellen om te studeren luchtwegontsteking

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Het algemene doel van dit experiment is het bestuderen van de immuunresponsen in de long tijdens een bacteriële infectie. Dit kan helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen op het gebied van longontsteking, zoals wat de belangrijkste regulerende mechanismen en genen zijn die longontsteking remmen of bevorderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer efficiënt en zeer reproduceerbaar is vanwege de directe toediening van het bacteriële inoculum in de onderste luchtwegen.Begin met het uitplaten van de NTHi op een chocolade-agarplaat. Incubeer de plaat ondersteboven gedurende de nacht bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Kweek de bacteriën de volgende dag in een brain-heart infusion bouillon.Voeg vervolgens één milliliter van het bouillon toe aan een microcentrifugebuisje. Centrifugeer het mengsel 5 minuten bij 4.000 g bij kamertemperatuur. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer het pellet in één milliliter PBS.Herhaal deze wasstap nog een keer. Verdun vervolgens 100 µL van de resuspenseerde oplossing in 900 µL PBS en meet de absorbentie van de cultuur bij 600 nm. Gebruik deze informatie om het inoculum aan te passen naar 20 miljoen CFU per ml.Bepaal vervolgens de levensvatbaarheid en de CFU's van het inoculum. Kweek één tot tien seriële verdunningen van het bouillon op chocolade-agarplaten en incubeer de platen gedurende de nacht. Begin met het anesthetiseren van de muis en controleer met een teenknijptest of de muis voldoende is geanestheseerd.Plaats de muis vervolgens in rugligging en scheer het ventrale gebied van de nek. Desinfecteer de blootgestelde huid. Til nu de huid van het bovenste ventrale deel van de nek op met ratten tandpincetten en maak met een scalpel een incisie van een halve tot één centimeter boven de thymus.Scheid vervolgens voorzichtig de spier om de trachea bloot te leggen. Injecteer langzaam 50 µL lucht in de trachea, gevolgd door 50 µL geprepareerde NTHi, en sluit dit af met nogmaals 50 µL lucht. Voor een negatieve controleprocedure wordt zoutoplossing geïnjecteerd in plaats van NTHi.Houd het dier na de injectie ongeveer een minuut rechtop. Sluit vervolgens de incisie met weefsellijm en houd de muis ongeveer 10 minuten zijlings liggend en warm. Euthanaseer het geïnfecteerde dier 24 uur na de infectie en open de buikholte met een anatomische schaar.Snijd vervolgens de ventrale aorta door om het dier leeg te laten bloeden. Leg daarna het ventrale deel van de long bloot om toegang te krijgen tot de trachea. Intubeer de trachea met een katheter van 20 gauge.Instilleer met behulp van de katheter 0,8 milliliters BALF-buffer en verzamel het lavage-spoelsel via dentale aspiratie. Herhaal deze procedure nog drie keer en voeg de vier verzamelde lavage-monsters samen tot één enkele suspensie. Neem een aliquot van 100 microliter en centrifugeer deze gedurende twee minuten bij 2 000 RPM.Verwijder het supernatant en resuspendeer in RBC-lysisbuffer. Centrifugeer dit en resuspendeer het pellet met 1x PBS. Tel vervolgens het totale aantal cellen in 100 µL van de suspensie met een hemocytometer onder 10x vergroting met trypaanblauw-kleuring.Bereid vervolgens objectglazen voor om de cellen te kleuren. Pipetteer 100 µL van de BALF-suspensie in de juiste putjes van cytospin-objectglazen en centrifugeer de glazen bij 500 g gedurende vijf minuten. Laat de objectglazen daarna 10 minuten drogen bij kamertemperatuur en kleur de cellen met een gemodificeerde Giemsa-kleuring volgens de protocollen van de fabrikant.Gebruik de overgebleven cellen voor daaropvolgende analyses, zoals FACS, confocale microscopie, enzovoort. Neem na het verzamelen van het lavage uit de geïnfecteerde long een stukje long van 20-40 milligram en incubeer dit in een RNA-stabiliseringsreagens bij 4 °C gedurende de nacht, gevolgd door langdurige bewaring bij -80 °C. Was de longweefselmonsters bij gereedheid in koude PBS om het RNA-stabiliseringsreagens te verwijderen.Plaats het weefsel vervolgens in een centrifugebuis van 1,5 milliliter met lysisbuffer en beta-mercaptoethanol. Hak het weefsel daarna met een klein schaartje in stukjes en homogeniseer deze stukjes gedurende 20-40 seconden met een gemotoriseerde stamper. Bewaar het lysaat vijf minuten op ijs en centrifugeer dit vervolgens 3 minuten bij 18,000 g.Verwijder voorzichtig het supernatant en breng dit over naar een nieuwe buis. Voeg vervolgens één volume 70% ethanol toe en homogeniseer het mengsel door trituratie. Laat het mengsel twee tot vier minuten rusten bij 25 °C.Breng vervolgens maximaal 700 µL over naar een spincolumn op een opvangbuis van 2 mL en centrifugeer de column bij 9600 g gedurende 15 seconden. Gooi het filtraat weg, voeg 350 µL wasbuffer toe en herhaal de centrifugatie. Incubeer daarna het membraan met 80 µL DNase I-oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 350 µL wasbuffer toe aan de kolom en herhaal de centrifugatie. Voeg daarna 500 µL RNA-wasbuffer toe. Herhaal de korte centrifugatie en gooi het doorstroomvolume weg.Voer twee wasbeurten uit met RNA-wasbuffer. Voeg ten slotte, boven een nieuwe opvangbuis, 30-50 µL RNase-vrij water direct toe aan de kolom en centrifugeer één minuut om het RNA-monster in het filtraat op te vangen. De procedure werd uitgevoerd zoals beschreven bij normale, gezonde muizen.Intratracheale instillatie resulteerde in een aanzienlijk verhoogd aantal leukocyten in het bronchoalveolaire lavagevocht van muizen die waren geïnoculeerd met NTHi, vergeleken met de zoutoplossing-behandelde controles. De differentiële telling van de leukocyten laat duidelijk een toegenomen neutrofiele infiltratie zien. FACS-analyse van de cellen in het BALF bevestigt verder het verhoogde aantal neutrofielen.HNE-gekleurde coupes van het longweefsel tonen een toegenomen ontsteking van de luchtwegen. Gezamenlijk suggereren deze gegevens dat intratracheale instillatie luchtwegontsteking induceert bij muizen. In een soortgelijk experiment met mutante en controlemuizen werd het RNA van longweefsel geanalyseerd middels whole transcriptome sequencing.In vergelijking met wild-type controles leidde Itch-deficiëntie tot een differentiële expressie van verschillende genen. Men gaat ervan uit dat Itch een regulator is van inflammatoire signaleringspaden, waardoor dit resultaat gebruikt kan worden om nieuwe studies te stimuleren. Gedurende de gehele ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van longziekten de weg vrijgemaakt om celsignalering in immuuncellen tijdens longinfecties en inflammatie te onderzoeken.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om extra voorzorgsmaatregelen te nemen tijdens stappen zoals het blootleggen van de trachea en de intratracheale instratie van bacteriën. Zodra men hierin vaardig is, kan de intratracheale instratie binnen tien minuten worden uitgevoerd en kan het vloeistof uit het vial binnen 10-15 minuten worden verzameld. Na deze procedure kunnen aanvullende analyses zoals RNA-sequencing, flowcytometrie en immunoblocking worden uitgevoerd om verdere vragen te beantwoorden, zoals welke genen upgereguleerd of downgereguleerd zijn.

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Venuprasad, K., et al. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the intratracheal delivery of a lung-pathogenic bacterial inoculum into an anesthetized mouse to model lower respiratory tract infection.

Performing Intratracheal Bacterial Delivery in a Mouse Model

Source: Venuprasad, K., et al. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the collection and processing of bronchoalveolar lavage fluid from a euthanized mouse infected with non-typeable Haemophilus influenzae for downstream analysis.

Bronchoalveolar Lavage Fluid Collection from a Mouse Model Infected with Non-typeable Haemophilus influenzae

Source: Lenhard, A. et al. A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a mouse co-infection model in which the influenza virus triggers the transition of Streptococcus pneumoniae from a colonizer to a pathogen. It outlines the steps involved in bacterial colonization, viral infection, and disease progression.

A Mouse Model to Study the Pathogenic Transition of Streptococcus pneumoniae Following Viral Co-Infection

We hebben een eenvoudige, betrouwbare en relatief goedkope methode voor endotracheale intubatie bij muizen via directe laryngoscopie behulp van een otoscoop met een 2,0 mm speculum ontwikkeld. Deze techniek is atraumatische en kan worden gebruikt voor herhaalde metingen in chronische experimenten. We vinden het superieur aan tracheostomie of eerder gerapporteerde niet-chirurgische technieken.

Luchtpijpintubatie in Muizen<em&gt; Via</em&gt; Directe laryngoscopie behulp van een otoscoop

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Intratracheale intubatie-gemedieerde (IMIT) instillatie van reagentia is een uitstekend invasieve methode voor het bestuderen ademhalingsziekte, alsmede een werkwijze voor het indruppelen therapeutische reagentia direct in de longen. Het is een snelle en zeer reproduceerbare werkwijze die geschikt is voor preklinische proeven.

Intubatie-gemedieerde Intratracheaal (IMIT) Blaasinstillatie: een niet-invasieve, Lung-specifieke Delivery System

Er is een algemene kennisgebrek over hoe vaccins werken. Hier stellen we het gecombineerde gebruik van omgekeerde genetica en botmerg chimerische muizen voor om inzicht te krijgen in de vroege gastheer immuunreacties op vaccins met een speciale focus op dendritische cellen en T-cel immuniteit.

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Dit protocol geeft instructies voor intranasale toediening van IAV en downstream-analyse van longbeschadiging bij muizen en bijbehorende transcriptionele veranderingen in longceltypen.

Modellering van dysplastisch en functioneel longalveolair herstel na griepinfectie

Leer intratracheale inoculatie van Haemophilus influenzae in muizen om luchtwegontsteking en immuunresponsen te bestuderen. Deze efficiënte methode levert betrouwbare resultaten voor inflammatieonderzoek.

Intratracheale toediening van

Meer video's verkennen