Name: Een hele berg In Situ Hybridisatie Methode voor de slak, Poelslak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer een efficiënte methode voor whole mount in situ hybridisatie bij Lymnaea stagnalis embryo's en larven. Dit protocol maakt snelle decapsulatie mogelijk voor visualisatie van genexpressiepatronen in ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de financiering aan DJJ door de DFG-project # JA2108 / 2-1.

LET OP: De volgende stappen schets onze methode voor het uitvoeren van een in situ experiment op de embryonale en larvale stadia van L. stagnalis. Wanneer een stap omvat het gebruik van een gevaarlijk chemisch dit wordt aangegeven door het woord &#39;LET OP&#39; en de nodige veiligheidsprocedures moeten worden aangenomen. Links naar representatieve MSDS sheets voor gevaarlijke chemische stoffen zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. Recepten voor alle reagentia zijn aanwezig bij het ​​tweede Aanvullend File 2. 1. Vergadering van decapsulation Apparatus <ol><li> Hiertoe sluit een 20 ml wegwerpspuit te siliconenslang (met een binnendiameter van 1 mm en een buitendiameter van 3 mm) met een P1,000 tip gesneden tot een geschikte lengte zoals getoond in figuur 2A. </li><li> Tape een standaard microscoop dia naar een omgekeerde grote petrischaal. Tape de siliconenslang direct naast het microscoopglaasje zie figuur60; 2C en 2D. </li><li> Rusten getrokken glas naald op de microscoop glijbaan en steekt hem voorzichtig in het silicium slang totdat de punt van de naald steekt ongeveer 20% van de weg over de binnendiameter van de buis (zie figuur 2C en 2D). Zodra de naald in positie tape het naar beneden naar de petrischaal. </li><li> Laat het vrije uiteinde van de siliconenslang te rusten in een petrischaal die de decapsulated materiaal verzamelt. </li></ol> 2. Sample Collection, Fixatie en decapsulation LET OP: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd, tenzij anders vermeld. <ol><li> Verzamel zorgvuldig ei strings van de muren van een aquarium. Om dit te doen, gebruik dan een vlak stuk van flexibele kunststof als een spatel om het ei koord uit de ondergrond te schrapen, en gebruik een plastic theezeefje naar de drijvende ei snaar te vissen uit het water. Fase en het materiaal onder een microscoop met de geleider verschaft in figuur sorteren1. </li><li> Leg het ei koord op een papieren handdoek en maken een longitudinale incisie langs het ei massa met behulp van de vedergewicht tang. Rol het ei capsules uit het ei string en verwijder zoveel mogelijk van de jelly materiaal mogelijk uit elke capsule door ze rond de papieren handdoek met behulp van de vedergewicht tang. </li><li> Met de vedergewicht tang, overdracht van de eikapsels in een petrischaal met 5 ml leidingwater. Doorgaan met-de jellied ei capsules van de gewenste ontwikkelingsstadia verzamelen in dit gerecht. Verzamel genoeg capsules uit alle ontwikkelingsstadia van de geplande WMISH experiment ga dan naar de volgende stap. </li><li> Bij het werken met meer ontwikkelde larven (5 dagen na de eerste splitsing (dpfc) en ouder) verdoven hen voorafgaand aan de fixatie. OPMERKING: Hiermee wordt voorkomen dat de spieren van de aanbestedende waarvan de interpretatie van in situ kleurpatronen erg moeilijk maakt. <ol><li> Relax larven (terwijl ze nog in hun capsules) in een 2% w / v oplossing van MgCl2 • 6H 2 O 30 minuten voor fixatie. </li><li> Beoordeel de mate van ontspanning na 30 min door onderdompeling een aantal larven terwijl nog in hun ei capsules in fixerende oplossing en het toezicht op hun reactie onder een microscoop. Onvolledig ontspannen larven in te schuiven in hun schelpen, terwijl volledig ontspannen larven niet zullen reageren. Zodra deze larven zijn versoepeld doorgaan naar de volgende stap. </li></ol></li><li> Breng de eikapsels met een wijde boring plastic pipet in een afsluitbare buis die 10 maal het volume van eikapsels verschaft (bijv., Zou 1 ml van vaste capsules een 10+ ml tube vereist). </li><li> Aspireren zoveel mogelijk vloeistof uit de buis en vervangen door een volume fixatief oplossing die 10x de hoeveelheid vaste eikapsels. Voorzichtig zwenken de eikapsels in fixeermiddel bij kamertemperatuur gedurende de geschikte tijd voor elke ontwikkelingsfase (zie figuur 1). </li><li> Discontinue rotatie en laat de capsules te zinken en zuig de fixerende oplossing in een geschikte afvalcontainer. </li><li> Was het ei capsules door vervanging van de fixeeroplossing met fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (PBTw) en roteren bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Zuig het PBTw en tweemaal herhalen. </li><li> Verwijderen embryo&#39;s en larven van de capsules met de inrichting (zie paragraaf 1 voor details) getoond in figuur 2. Trek de capsules tot in de 20 ml spuit, sluit de buis en verdrijven de capsules door de buis en voorbij de glazen naald uit in de collectie schotel. OPMERKING: Normaal moet de meerderheid (&gt; 90%) van alle capsules slechts één doorgang door de inrichting nodig. In veel gevallen is de capsule membraan beschadigd maar embryo&#39;s en larven blijven in de gescheurde capsule. Opnieuw verwerken van dit materiaal door simpelweg het opstellen ervan in de spuit en opnieuw wegnemen het. </li><li> Verzamel de decapsulated embryo&#39;s en larven in een 1,5 ml buis met behulp van een microfoonropipette (een P20 voor 0-3 dagen oude larven, en een P200 voor oudere larven met het einde van de tip afgesneden). OPMERKING: Een pauze (tot enkele maanden) het protocol kan in dit stadium. Indien dit vereist is, dient de decapsuled materiaal worden verzameld in een 1,5 ml buis voor opslag (verder met de volgende stap). Anders onmiddellijk blijven Protocol 3. </li><li> Toestaan ​​embryo&#39;s en larven zinken naar de bodem van de buis en zuig de supernatant. Vervang met 33% ethanol (EtOH) in PBTw en laat zitten voor 5-10 min. Herhaal dit met 66% EtOH in PBTw en 100% EtOH. Wassen larven tweemaal in 100% EtOH bij kamertemperatuur. Bewaar het materiaal bij -20 ° C in 100% EtOH. </li><li> Als u klaar bent om verder te gaan, opnieuw te hydrateren de monsters door het verwijderen van de 100% EtOH en te vervangen door 66% EtOH in PBTw, laat zitten voor 5-10 min. Herhaal dit met 33% EtOH in PBTw, laat zitten voor 5-10 min. Tot slot was met 3x 5 minuten wassen van PBTw te zorgen dat alle EtOH wordt verwijderd. </li></ol> 3. Proteinase-K, TEA en Post-fixation LET OP: Wij vinden het uitvoeren van de volgende stappen in kleine manden met een maaswijdte vloer de meest efficiënte en zachte methode voor het snel uitwisselen van tijdkritische oplossingen. Hoewel deze woning kan worden gemaakt, maken we gebruik van manden (middelgroot) die compatibel zijn met de Intavis InSituPro -Vsi vloeistof handlingrobot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc) zijn. Dergelijke korven kunnen snel en gemakkelijk worden verplaatst tussen de putjes van een 12 putjes weefselkweekplaat (TCD), teneinde de uitwisseling oplossingen of de oplossing kan worden weggezogen uit de put met een pipet. Als alternatief kunnen alle oplossing beurzen worden uitgevoerd zonder deze manden door simpelweg de bovenstaande vloeistof uit de larven opzuigen. In dit geval zal een zachte draaibeweging alle embryo&#39;s en larven geconcentreerd naar het midden van de schaal waardoor de bovenstaande vloeistof van de rand van de put te verwijderen. De volgende gaat uit van de gebruiker is het gebruik van manden voor oplossing uitwisselingen. <ol><li> Met behulp van een pipet, Overdracht van embryo&#39;s en larven in een mandje zitten in een 12 goed TCD met 2 ml PBTw. Opmerking. Het aantal embryo&#39;s en / of larven die kan worden toegevoegd is afhankelijk van het ontwikkelingsstadium onderzocht, maar een algemene vuistregel is ten minste 25% van het vloeroppervlak zonder embryo / larven (dwz handhaven, niet overladen het mandje). </li><li> Bereid een aangrenzend goed met 2 ml van het geschikte proteïnase-K-oplossing (zie figuur 1) en een 2 wells met 2 ml 0,2% Glycine elk. Beweeg elke mand in de put met de juiste concentratie van Proteïnase-K en meteen beginnen met timing. </li><li> Na 10 min bewegen elk mandje in een putje met 0,2% glycine en incubeer gedurende 5 min. Ga dan elke mand in de tweede put met 0,2% Glycine en incubeer gedurende 5 min. Spoel de Glycine met 3x 5 min uitwisseling van 3 ml PBTw. </li><li> Verwijder de PBTw oplossing en eenmaal de behandeling van de monsters met vers bereide Triethanolamine (TEA) solution gedurende 5 minuten LET OP! Niet schudden. Vervangen door 3 ml vers bereide TEA-oplossing gedurende 5 min. Niet schudden. Zuig het merendeel van de TEA-oplossing uit de monsters. Voeg de vers bereide Triethanolamine met azijnzuuranhydride (TEAAA) oplossing en incubeer gedurende 5 min. LET OP! Niet schudden. </li><li> OPTIE - Terwijl de bovenstaande stap incubatie, bereiden een verse partij van TEAAA oplossing en herhaal de bovenstaande stap. LET OP: Deze tweede behandeling met TEAAA is optioneel, maar kan helpen om alle achtergrond met sondes gevoelig zijn voor het genereren van de achtergrond volledig te elimineren. </li><li> Verwijder de TEAAA oplossing opzuigen uit de put en vervangen door 3 ml PBTw. Niet schudden. Verwijder de PBTw en 3 ml 3,7% formaldehyde toepassing PBTw. Zwenk af en toe tijdens een 30 minuten incubatie. </li><li> Verwijder het fixeermiddel door opzuigen uit de put en vervangen door 3 ml PBTw. Breng het materiaal in een 1,5 ml buis. RVervang het PBTw de hybridisatie buffer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur - Pas. </li><li> Plaats de buizen in een heet blok bij kamertemperatuur en de temperatuur op de gewenste hybridisatietemperatuur. OPMERKING: De hybridisatietemperatuur is probe specifiek en moet empirisch worden geoptimaliseerd, maar vinden we 55 ° C een goede temperatuur initieel proces zijn. Laat het blok naar de hybridisatietemperatuur komen en laat de monsters vooraf hybridiseren gedurende ongeveer 15 minuten (dat wil zeggen, de tijd die nodig is om de riboprobes bereiden, langer is niet nodig). Bereid voldoende volumes (normaal 100 pl) van de verdunde riboprobes. Wij doorgaans proef probe concentraties van 100 en 500 ng / ml als een eerste reeks. We bereiden riboprobes volgens 12. </li><li> Verwijder de hybridisatiebuffer uit de monsters en voeg de probe in hybridisatiebuffer aan de monsters. Overlay met 100 ui (of een voldoende volume om een ​​fase boven de hybridisatie buffe vormenr) minerale olie. OPMERKING: De minerale olie voorkomt uitgebreide condenswater dat tijdens de langdurige hybridisatiestap vormen. Uitgebreide condensatie aanzienlijk veranderen zowel de chemie van de hybridisatie oplossing en de concentratie van de probe. </li><li> Denatureren de probe en het doel-RNA door het verwarmen van de monsters tot 75 ° C gedurende 10 minuten, dan het vuur de gewenste hybridisatietemperatuur. Sta hybridisatie doorgaan gedurende minimaal 12 uur (O / N) of meer (24-48 uur). </li><li> Tijdens hybridisatie verwijderen van een enkele buis van de hitte blok, draai het snel tussen duim en wijsvinger aan de larven te schorten zonder de oliefase te verstoren, en te vervangen in de hitte blok. Herhaal dit eenmaal per 6-12 uur of zo. </li></ol> 4. Hot wast en Immunodetectie LET OP: Terwijl we een vloeistof handlingrobot gebruiken voor de volgende stappen, kunnen deze ook gemakkelijk met de hand worden gedaan. In dit geval, embryo&#39;s en larven shoULD in 1,5 ml buisjes ze werden gehybridiseerd in bewaard. Alle volgende oplossing uitwisselingen worden opgezogen en toegevoegd met een pipet P1,000. Bij het handmatig uitgevoerd elk van de volgende stappen 1 ml van elke oplossing moet gebruiken. <ol><li> Warmte adequate volumina (3 ml elk per monster) van de 4x, 2x en 1x wasoplossingen de hybridisatietemperatuur. </li><li> Was alle monsters driemaal 4x wasbuffer gedurende 15 min elk bij de hybridisatietemperatuur. Was alle monsters driemaal 2x wasbuffer gedurende 15 min elk bij de hybridisatietemperatuur. Was alle monsters driemaal in 1 x wasbuffer gedurende 15 min elk bij de hybridisatietemperatuur. </li><li> Was alle monsters één keer met 1x natriumchloride Natriumcitraat buffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) aan de hybridisatie temperatuur. Sta monsters afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Was alle monsters tweemaal in 1x SSC + 0,1% Tween gedurende 15 min Vervang dit 1x SSC oplossing met maleïnezuur Buffer (MAB) en laat zitten voor 10 min Herhaal de MAB was. Vervang MAB met blok-oplossing en incubeer gedurende 1,5 uur. </li><li> Wisselen het blok oplossing antilichaamoplossing (1: 10.000 verdunning van antilichaam in blokkeeroplossing) en incubeer 12 uur (O / N) bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li></ol> 5. Kleur Ontwikkeling en Montage <ol><li> Zuig het antilichaamoplossing en was 15 maal met PBTw gedurende 10 minuten elk. Vervang PBTw met 1x alkalisch fosfatase Buffer (AP) en incubeer gedurende 10 min. </li><li> Terwijl de bovenstaande incubatie stap verloopt, de voorbereiding van de AP kleuroplossing (zie aanvullende File 2) - LET OP. Transfer van het materiaal in een TCD goed en vervang de 1x AP oplossing AP kleuroplossing. Noteer de tijd zodat de tijd dat de kleurreactie plaats te kunnen worden opgenomen. Bewaken van de ontwikkeling van het kleurpatroon tot de signaal achtergrond verhouding optimaal. </li><li> Om kleur ontwikkeling te stoppen, verwijder de 1x AP kleuroplossing (afvoeren in de daarvoor bestemde waste container), en pas 2 ml PBTw en noteer de tijd. Spoel tweemaal met PBTw gedurende 5 minuten elk. Een van deze spoelingen om het materiaal in een 1,5 ml buis. </li><li> Verwijder de PBTw en 1 ml 3,7% formaldehyde toepassing PBTw en schudden of roteren gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (dit kan ook O / N). </li><li> Spoel het fixeermiddel met 3 wasbeurten van PBT (gooi het afval fixeermiddel in een geschikte afvalcontainer). Was de monsters 3 keer bij 50 ° C in gedeïoniseerd water. LET OP: Deze wasbeurten elimineren het neerslaan van zouten die tijdens het opruimen en visualisatie stappen zichtbaar kunnen worden. </li><li> Beslis of de monsters in benzylbenzoaat worden gemonteerd Benzylalcohol (BB: BA, ook bekend als Murray wissen) of glycerol. LET OP: Wij verkiezen de meer krachtige clearing-agent BB: BA als L. stagnalis embryo&#39;s zijn enigszins ondoorzichtig. Monsters in BB worden gemonteerd: BA zal eerst moeten worden ontwaterd door middel van een ethanol-serie. Monsters 60% te monterenglycerol kunnen direct worden gemonteerd. </li><li> Breng de monsters in de bevestigingsoplossing (BB: BA of 60% glycerol) met een pipet. LET OP: Bij montage in BB: BA dit moet gebeuren in een glazen goed (BB: BA zal polycarbonaat plastic smelten). </li><li> Laat de monsters vrij te maken voor 5-10 min, en vervolgens zet ze op een dia met behulp van een geschikt aantal gestapelde dekglaasjes als afstandhouders (1 dekglaasje voor monsters &lt;1 dpfc, 2 dekglaasjes voor monsters&gt; 1 dpfc). LET OP: Whole mounts kan nu worden afgebeeld met behulp van een samengestelde microscoop met DIC optiek. </li></ol>

<ol><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrusca%2C+RC+%22Invertebrates%22">Invertebrates</a>. , Sinauer. Sunderland. (2002).</li>
<li>Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en">http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en</a> (2013).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+in+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Week.+Epi.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li>
<li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slipper+snail%2C+Crepidula.%3A+an+emerging+lophotrochozoan+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Rep%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li>
<li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+gene+expression+with+larval+competence%2C+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li>
<li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel%2C+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li>
<li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li>
<li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+set+of+maternal+genes%3F+Insights+from+a+molluscan+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li>
<li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19(2015).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage%2C+with+special+reference+to+its%27+chemical+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li>
<li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod%2C+Lymnaea+palustris.%2C+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li>
<li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Emb.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li>
<li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29(1973).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li>
<li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li>
<li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li>
<li>Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160(2007).</li>
<li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15(2013).</li>
<li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li>
<li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43(2011).</li>
<li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited%2C+lateralized+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li>
<li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li>
<li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li>
<li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745(2011).</li>
<li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+%28LCav-beta%29+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941(2014).</li>
<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+genome+size+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode maakt de efficiënte visualisatie van RNA transcripten met vermoedelijk variërende expressieniveaus in alle ontwikkelingsstadia van poelslak. Embryo&#39;s en larven van de capsules te verwijderen we uitgetest diverse chemicaliën, osmotische shock en fysische behandelingen gerapporteerd voor andere encapsulated- het ontwikkelen van model organismen. In onze handen de hier beschreven werkwijze is het enige high-throughput techniek die de taaie capsulaire membraan verwijderd zonder bescha...

Weekdieren zijn een groep van dieren die het belang van een brede diversiteit aan wetenschappelijke disciplines te houden. Ondanks hun morfologische diversiteit 1, soortenrijkdom (tweede alleen voor de geleedpotigen in termen van soorten nummer 2) en relevantie voor een breed scala aan commerciële 3, 4 medische en wetenschappelijke kwesties 5-8, zijn er relatief weinig weekdieren soorten die aanspraak kunnen maken op zowel goed uitgerust wetenschappelijke modellen en onderhoudsvriendelijk in een laboratoriumomgeving. Een weekdier dat veel wordt gebruikt door disciplines zoals de neurobiologie 9, ecotoxicologie 10 en meer recentelijk de evolutionaire biologie 11,12, is poelslak, vooral vanwege de grote verspreiding en extreme gemak van onderhoud. Ondanks zijn populariteit als een &#39;model&#39; organisme en zijn lange geschiedenis van gebruik door ontwikkelingsstoornissen biologen 13-19, het bereik en de kracht van moleculaire technieken beschikbaar om de L. stagnalis wetenschappelijke gemeenschap ligt ver achter bij die van de meer traditionele diermodellen (Drosophila, muis, zee-egels, nematoden). Onze wens om Lymnaea ontwikkelen als een moleculair model komt voort uit een belang in de moleculaire mechanismen die shell vorming leiden. Dit motiveerde ons om een reeks technieken die het mogelijk maken voor de efficiënte, consistente en gevoelige visualisatie van genexpressie tijdens de ontwikkeling Lymnaea &#39;s te verfijnen. Ganse berg in situ hybridisatie (WMISH) wordt op grote schaal gebruikt voor een verscheidenheid van model organismen en is in gebruik voor meer dan 40 jaar 20. In de verschillende gedaanten kan ISH worden gebruikt om ruimtelijk lokaliseren specifieke loci op chromosomen, rRNA, mRNA en micro-RNAs. Een van de uitdagingen die we nodig hadden aan te pakken voorafgaand aan het verfijnen van een WMISH methode voor L. stagnalis was de kwestie van voorzichtig en efficiënt extraheren van embryo&#39;s en larven van verschillende stadia van tHij eikapsels waarin ze zijn gesteld. Deze extractie of &quot;decapsulation&quot;, efficiënt moet worden bereikt om voldoende materiaal te verzamelen voor een bepaald experiment in situ, terwijl tegelijkertijd handhaven morfologische en cellulaire integriteit. Terwijl andere model organismen ook ingekapselde ontwikkeling ondergaan, in onze handen geen van de gerapporteerd voor deze soorten methoden kunnen worden met succes toegepast bij L. stagnalis. De algemene doelstellingen van deze methode zijn dan ook: te extraheren L. stagnalis embryo&#39;s en larven van de capsules in een high-throughput fashion, pre-hybridisatie behandelingen die de WMISH signaal optimaliseren, embryo&#39;s en larven te bereiden met bevredigende WMISHsignals voor beeldvorming toegepast.

```html
<table><tbody><tr><td>Featherweight forceps</td><td>Ehlert &amp; Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Glasgerätebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 well tissue culture dishes</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>VOORZICHTIG - Kankerverwekkend zijn. Giftig bij inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt. Giftig: gevaar voor zeer ernstige onomkeerbare effecten door inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt.</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>VOORZICHTIG - KAN OOGIRRITATIE VEROORZAKEN. KAN IRRITATIES VAN DE ADEMHALING EN DE HUID VEROORZAKEN. Vermijd het inademen van stof. Vermijd contact met ogen, huid en kleding. Alleen gebruiken met voldoende ventilatie</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij inslikken.</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidon K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij inslikken.</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij bovien serumalbumine</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Zalmbrem</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>VOORZICHTIG - BIJWERKINGEN OMVATT BLOEDINGS, LOKALE IRRITATIE. MOGELIJK ALLERGISCHE REACTIE ALS GEÏNHAAL, GEÏNST/CONTACT. IRRITAANT VOOR OEGEN/HUID/ADEMHAALWEG. MOGELIJKE OVERGEVOELIGHED. TIJDENS ZWANGERSCHAP IS GERAPPORTEERD DAT HET HET RISICO VAN STILBORT VERHOOGT</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>De-ioniseerd formamide</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>VOORZICHTIG - Irriterend voor ogen en huid. Kan schadelijk zijn bij inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt. Kan schadelijk zijn voor de ongeboren baby. Hygroscopisch.</td></tr><tr><td>Standaard formamide</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>VOORZICHTIG - Irriterend voor ogen en huid. Kan schadelijk zijn bij inademing, bij contact met de huid en als het wordt ingeslikt. Kan schadelijk zijn voor de ongeboren baby. Hygroscopisch.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>VOORZICHTIG - Vermijd het inademen van dampen of mist. Vermijd contact met de ogen. Vermijd langdurig of herhaald contact met de huid. Was grondig na gebruik.</td></tr><tr><td>Acetaanzuuranhydride</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>VOORZICHTIG - KAN ERNSTIGE HUID- EN OOGVERBRANDINGEN VEROORZAKEN. REAGEERT GEWELDIG MET WATER. SCHADELIJKE ALS GEÏNST. DAMP IRRITATIE VOOR DE OGEN EN DE ADEMHAALWEG</td></tr><tr><td>Maleïnezuur</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>VOORZICHTIG - Zeer gevaarlijk bij contact met de ogen (irriterend), bij inname, . Gevaarlijk bij contact met de huid (irriterend), bij inademing (longirritant). Licht gevaarlijk bij contact met de huid (permeator). Corrosief voor ogen en huid.</td></tr><tr><td>Benzylbenzoaat</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Schadelijk als ingeslikt.</td></tr><tr><td>Benzylalcohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>VOORZICHTIG - Schadelijk als ingeslikt. Schadelijk bij inademing. Veroorzaakt ernstige oogirritatiem.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blocking powder</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragmenten AP-geconjugeerd</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blauw tetrazoliumboorchloride in dimethylformamide&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn voor de ongeboren baby. Schadelijk bij inademing en bij contact met de huid. Irriterend voor de ogen.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fosfaat</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>VOORZICHTIG - Potentieel schadelijk bij inname. Niet op huid, in ogen of op kleding komen. Mogelijke huid- en oogirritant.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetylcysteïne</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>VOORZICHTIG - Kan oog- en huidirritatiem veroorzaken. Kan irritatie van de luchtwegen en het spijsverteringskanaal veroorzaken. De toxicologische eigenschappen van dit materiaal zijn niet volledig onderzocht.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>VOORZICHTIG - Kan schadelijk zijn bij inademing. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij opname door de huid. Kan huidirritatiem veroorzaken. Kan oogirritatiem veroorzaken. Kan schadelijk zijn bij inslikken.</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>VOORZICHTIG - Schadelijk als ingeslikt. Giftig bij contact met de huid. Veroorzaakt huidirritatie. Veroorzaakt ernstige oogbeschadiging. Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken.</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr>

een hele berg<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie methode voor de slak,<em&gt; poelslak</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Ganse berg in situ hybridisatie (WMISH) is een techniek die het mogelijk maakt voor de ruimtelijke resolutie van nucleïnezuurmoleculen (vaak mRNA) binnen een &#39;hele mount&#39; het prepareren van weefsels of ontwikkelingsstadium (zoals een embryo of larve) van belang. WMISH is zeer krachtig omdat het aanzienlijk kunnen bijdragen tot de functionele karakterisatie van complexe metazoïsche genomen, een uitdaging die steeds meer een knelpunt wildgroei aan volgende generatie sequentiegegevens. Ondanks de conceptuele eenvoud van de techniek veel tijd vaak nodig om de verschillende parameters die inherent zijn aan WMISH experimenten nieuwe model te optimaliseren; subtiele verschillen in de cellulaire en biochemische eigenschappen tussen soorten weefsels en ontwikkelingsstadia dat één WMISH methode niet voor alle situaties. We hebben een set van WMISH methoden voor het opnieuw opkomende gastropod model poelslak die consistent genereren en ontwikkeldduidelijke WMISH signalen voor een reeks van genen, en in alle ontwikkelingsstadia. Deze werkwijzen zijn het inbrengen van larven van onbekende chronologische leeftijd een ontogenetische venster, het effectief verwijderen van embryo&#39;s en larven uit hun ei capsules, de toepassing van een geschikte proteïnase-K behandeling voor elk ontogenetische raam en hybridisatie, post-hybridisatie en immunodetectie stappen. Deze werkwijzen verschaffen een basis van waaruit het resulterende signaal voor een bepaald RNA-transcript verder verfijnd met probe specifieke aanpassingen (voornamelijk probe concentratie en hybridisatietemperatuur zijn).

De representatieve WMISH kleurpatronen figuur 3 werden gegenereerd met behulp van de hierboven beschreven techniek, en geven verschillende ruimtelijke expressiepatronen van genen betrokken bij diverse moleculaire processen gaande van shell formatie (nieuw gen 1, 2, 3 en 4), tot cel-cell signaling (Dpp) om transcriptie regulatie (Brachyury) in een heel scala van ontwikkelingsstadia. Hoewel we niet de expressieniveaus van deze genen verw...

Het doel van dit protocol is om gebruikers een reeks methoden te bieden voor de hoogwaardige decapsulatie van Lymnaea stagnalis embryo's en larven ter voorbereiding op gehele berging in situ hybridisatie, en voor daaropvolgende pre- en post-hybridisatie behandelingen.

Een hele berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Methode voor de slak,<em&gt; Poelslak</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Het algemene doel van dit protocol is om de ruimtelijke expressiepatronen van individuele genen in embryonale en larvale whole mounts van de zoetwatergastropode Lymnaea stagnalis efficiënt te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van Evo-Devo en ontwikkelingsbiologie, zoals waar en wanneer genen tot expressie komen, hoe ze met elkaar interageren en wat hun specifieke functies kunnen zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het verwijderen van embryonaal en larvaal materiaal uit hun eicapsules snel, eenvoudig en effectief is.Dit materiaal wordt vervolgens gecategoriseerd volgens een ontwikkelingsstroomschema dat we in het aanvullende materiaal verstrekken en daarna verwerkt via stadiumspecifieke pre-hybridisatiestappen. Om deze procedure te starten, sluit u een wegwerpspuit van 20 milliliter aan op een siliconen slang. Plak vervolgens een standaard objectglas op een grote omgekeerde Petrischaal.Plak vervolgens de siliconen slang direct naast het microscopische preparaatglas. Plaats daarna een getrokken glazen naald op het preparaatglas. Voer deze voorzichtig in de siliconen slang in totdat de punt van de naald ongeveer 20% van de binnendiameter van de slang beslaat.Zodra de naald in positie is, wordt deze met tape aan de Petrischaal vastgezet. Laat het vrije uiteinde van de siliconen slang rusten in een andere Petrischaal die het gedecapsuleerde materiaal zal opvangen. Om de eistammen van de wanden van een aquarium te verzamelen, wordt een stuk plat, flexibel plastic als spatel gebruikt om de eistam van het substraat af te schrapen.Gebruik vervolgens een plastic theezeefje om de drijvende eiercluster uit het water te vissen. Daarna kan het materiaal onder de microscoop worden geprepareerd en gesorteerd volgens deze handleiding. Plaats de eiercluster op een papieren handdoek en maak met de featherweight pincet een longitudinale incisie langs de eiermassa.Rol vervolgens de eikapsels uit het eizitje en verwijder zoveel mogelijk van het gelei-achtig materiaal van elk kapsel door deze over het papieren handdoekje te bewegen. Draag daarna de eikapsels met een pincet voor fijn werk over naar een Petrischaal met 5 milliliters kraanwater. Ga door met het verzamelen van ontgelei-de eikapsels van de gewenste ontwikkelingsstadia in deze schaal.Verzamel voldoende capsules van alle ontwikkelingsstadia voor het geplande WMISH-experiment voordat u naar de volgende stap gaat. Ontspan nu larven die ouder zijn dan vijf dagen na de eerste deling gedurende 30 minuten in een 2% gewicht-per-volume oplossing van magnesiumchloridehexahydraat vóór de fixatie. Beoordeel na 30 minuten de graad van ontspanning door enkele larven, terwijl ze nog in hun eicapsules zitten, onder te dompelen in de fixeersolutie en hun reactie onder een microscoop te monitoren.Onvolledig ontspannen larven zullen zich in hun schelpen terugtrekken. Volledig ontspannen larven zullen niet reageren. Zodra deze larven zijn ontspannen, worden de eikapsels met een plastic pipet met een brede opening overgebracht naar een afsluitbare buis die 10 keer het volume van de eikapsels biedt.Aspireer vervolgens zoveel mogelijk vloeistof uit de buis en vervang deze door de fixeeroplossing met een volume dat 10 keer groter is dan dat van de bezonken eicapsules. Roteer de eicapsules voorzichtig in de fixeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende de juiste tijd voor elke ontwikkelingsfase. Stop daarna met roteren en laat de capsules naar beneden zakken.Zuig de fixeeroplossing op in een geschikte afvalcontainer. Was de eikapsels door de fixeeroplossing te vervangen door PBTw en roteer deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Aspireer de PBTw en was nog twee keer. Verwijder daarna de embryo's en larven uit hun capsules met behulp van het apparaat. Trek de capsules in een spuit van 20 milliliter.Bevestig vervolgens de spuit aan de slang. Druk de capsules door de slang en de glazen naald in de opvangschaal. Verzamel daarna de gedecapsuleerde embryo's en larven in een 1,5-milliliter buisje met behulp van een micropipet.Dehydrate vervolgens het gefixeerde materiaal en bewaar het, of voer de Proteinase K-, TEA- en post-fixatiestappen uit. Zodra deze stappen zijn voltooid, wordt het materiaal kort geprehybridiseerd en worden de riboprobes toegevoegd. Het belang van een passende Pro K-behandeling voor de uiteindelijke resultaten van een in situ experiment is van cruciaal belang voor Lymnaea stagnalis.Dit komt tot uiting in een breed scala aan Pro K-concentraties die vereist zijn voor verschillende ontwikkelingsstadia, variërend van 0 tot 500 micrograms to mil. Verwijder tijdens de hybridisatie één enkele buis uit het warmteblok. Draai deze snel tussen duim en wijsvinger om de larven te suspenderen zonder de oliefase te verstoren, en plaats de buis vervolgens terug in het warmteblok.Herhaal deze procedure één keer elke zes tot 12 uur. De hier getoonde genexpressiepatronen zijn gegenereerd met larven uit verschillende ontwikkelingsstadia. Alle monsters zijn gemonteerd en gefotografeerd in Murray's Clear.Benaderde leeftijden zijn aangegeven rechtsboven in elke afbeelding. De oriëntatie van het beeld is aangegeven rechtsonder en de gen-orthologie is aangegeven linksonder. Deze resultaten illustreren de expressiepatronen van genen die betrokken zijn bij diverse moleculaire processen, variërend van schelpvorming tot transcriptie en cel-naar-cel-signalering.In alle gevallen is een uniek en duidelijk cellulair kleuringspatroon zichtbaar; de resultaten zijn zeer consistent tussen individuele larven binnen een experiment en zeer reproduceerbaar tussen verschillende experimenten. Eenmaal beheerst, vergt de totale actieve tijd van deze techniek minder dan twee dagen. Het grootste deel van de tijd wordt besteed aan het verzamelen en voorbereiden van embryonaal en larvemateriaal voor hybridisatie en het vastleggen van de beelden van de resultaten.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elke riboprobe waarschijnlijk subtiele aanpassingen vereist van belangrijke parameters zoals de hybridisatietemperatuur, de probeconcentratie en de duur van de hybridisatie. Na de ontwikkeling stelde deze techniek ons in staat om een reeks genen die betrokken zijn bij de schelpvorming, en die via eerdere transcriptomische en proteomische screenings zijn geïdentificeerd, accuraat te karakteriseren.

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

In deze video laten we een methode zien om een ontwikkelingsgesynchronleerde populatie steriele volwassen C. elegans teproduceren. Het voorbeeldprotocol synchroniseert wormen om zuurstofverbruik bij levende dieren te bestuderen.

Nematodensynchronisatie: een methode om populaties wormen in identieke stadia van ontwikkeling te verkrijgen

Door het combineren van methoden voor RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie in Hele Mount Embryo&#39;s en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen

-Visserij-geïnduceerde veranderingen om uitgebuit schaaldier visserij, zoals de Amerikaanse kreeft visserij, kan mogelijk invloed hebben op hun reproductieve dynamiek, wat leidt tot een vermindering van de paring succes. Het doel van deze studie was om een ​​niet-invasieve methode voor het vaststellen van de paring succes van vrouwelijke kreeften die fysiologisch of functioneel volwassen kunnen ontwikkelen.

Een niet-invasieve methode voor<em&gt; In situ</em&gt; Bepaling van het Koppelen van Succes in vrouwelijke Amerikaanse Kreeften (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Dit videoprotocol demonstreert een methode om effecten van zaadvloeistof bij weekdieren te bestuderen, met behulp van de hermafroditische zoetwaterslak Lymnaea stagnalis.

Effect van Accessory Gland producten op eierleggende in buikpotigen

De diagnose van Eimeria-infectie bij kippen blijft veeleisend. Aanpakken gebaseerd op parasietenmorfologie en pathologie van de gastheer zijn vaak niet doorslaggevend, terwijl moleculaire benaderingen op basis van PCR veeleisend zijn gebleken in termen van kosten en expertise. Het doel van dit protocol is om lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) te vestigen als een eenvoudige moleculaire diagnose voor eimerian-infectie.

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van<em&gt; Eimeria</em&gt; Dat Kippen infecteren

Visualisatie van de expressie van genen in embryonale Astyanax cavefish kunnen dit protocol. Deze aanpak is ontwikkeld met als doel het maximaliseren van gen expressie signaal, terwijl het minimaliseren van aspecifieke achtergrondkleuring.

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

Het doel van dit protocol is het genotype van de zeeanemonen Nematostella vectensis tijdens de gastrulatie zonder het embryo op te offeren.

Genotypering van zeeanemonen tijdens de vroege ontwikkeling

Het behoud van zoet water mossel is afhankelijk van het monitoren van voortplantings patronen en processen van soorten. Deze studie standaardiseert een niet-dodelijk protocol voor het bemonsteren van Gill-inhoud, het karakteriseren van de larvale ontwikkeling en het verstrekken van een digitale repository voor verzamelde gegevens. Dit protocol-database-pakket zal een belangrijk hulpmiddel zijn voor mossel onderzoekers die niet-verontreinigde soorten herstellen.

Standaardiseren van een niet-dodelijke methode voor het karakteriseren van de reproductieve status en de larvale ontwikkeling van zoetwatermosselen (Bivalvia: Unionida)

Het artikel presenteert methoden voor larvale cultuur van de gastropode Crepidula fornicata in een klein-volume laboratoriumschaal systeem en in een ambient-zeewater mesokosmos systeem dat in het veld kan worden ingezet.

Laboratorium- en veldcultuur van larven van de pantoffellimpet, Crepidula fornicata

Leer een efficiënte methode voor whole mount in situ hybridisatie bij Lymnaea stagnalis embryo's en larven. Dit protocol maakt snelle decapsulatie mogelijk voor visualisatie van genexpressiepatronen in ontwikkelingsbiologie.

Een hele berg

Meer video's verkennen