Onderzoek naar de functie van Coronin A in de vroege honger Reactie

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de Coronin-A-afhankelijke vroege uithongeringsrespons van Dictyostelium discoideum te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ontwikkelingsbiologie, zoals de identificatie van signaleringspaden en factoren die betrokken zijn bij de vroege ontwikkeling van Dictyostelium discoideum. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze potentieel een instrument biedt voor geautomatiseerde high-throughput screening van ontwikkelingsinducerende factoren en eiwitten die betrokken zijn bij vroege ontwikkelingssignalering.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de meerdere variabelen die inherent zijn aan de assay, zoals celdichtheden, hechtingstijd en ontwikkeltijd. Om deze procedure te starten, kweekt u DH1.10-cellen of corA-deficiënte cellen in een Erlenmeyerkolf met HL-5-medium, bij 22 °C, in een schudincubator op 160 rpm. Houd de cellen op een dichtheid tussen 1 × 10⁴ en 2 × 10⁶ cellen per milliliter.

Om celaggregatie te onderzoeken, oogst 10 tot 50 milliliters log-fase-groeiende DH1.10-cellen of corA-deficiënte cellen gegenereerd op de DH1.10-achtergrond. Centrifugeer deze gedurende drie minuten bij 400 ×g. Was de cellen vervolgens tweemaal in BSS.

Tel daarna de cellen met een hemocytometer. Zaai de cellen vervolgens uit in een 24-wellplaat. Laat ze één uur hechten bij 22 degrees Celsuis in BSS.

Visualise vervolgens de celaggregatie met time-lapse microscopie en neem elke 135 seconden beelden op. Om het effect van de extern toegepaste cyclisch AMP-pulsen op de ontwikkeling van DH1.10-cellen, of corA-deficiënte DH1.10-cellen te onderzoeken, oogst dan 10 tot 50 milliliter van de cellen en centrifugeer deze drie minuten bij 400 ×g. Was ze daarna twee keer in BSS.

Tel de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer de cellen vervolgens tot een dichtheid van 1 × 10⁷ cellen per milliliter in BSS. Schud de culturen daarna twee uur lang bij 22 °C op 160 rpm voordat de pulsen worden toegediend.

Pas vervolgens pulsen van cyclisch AMP toe met behulp van een peristaltische pomp die door een timer wordt aangestuurd. Programmeer de pomp om gedurende een periode van vijf uur elke zes en een halve minuut een puls van vijf seconden cyclisch AMP af te geven. Een cruciale stap is om ervoor te zorgen dat de tip van de injectie van cyclisch AMP niet continu in de oplossing is ondergedompeld, maar slechts periodiek in de golven die door de shaker worden gegenereerd.

Tel na toevoeging van cyclisch AMP de cellen opnieuw met een hemocytometer. Zaai de cellen vervolgens uit in een 24-wellplaat en laat ze één uur hechten in BSS. Visualiseer na 16 uur de celaggregatie bij 22 °C met bright-field microscopie met een 5x objectief.

In deze procedure wordt vers geconditioneerd medium bereid door DH1.10-cellen in de logaritmische fase of DH1.10 corA-deficiënte cellen te oogsten uit schudcultures met HL5-medium bij 22 °C. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 400 ×g. Was ze daarna drie keer met PBM.

Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer ze daarna in PBM bij een dichtheid van 1 × 10⁷ cellen per milliliter en schud ze gedurende 20 uur bij 22 °C op 110 rpm. Centrifugeer de cellen vervolgens bij 400 ×g gedurende drie minuten en verzamel daarna het geconditioneerde medium. Clarificeer het medium vervolgens door centrifugatie bij 8.000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C.

Filter vervolgens het geconditioneerde medium door een 0,45 micrometer filter en verdun het drievoudig in PBM. Tel de cellen met een hemocytometer, zaai ze uit in een 24-wellplaat en laat ze één uur hechten bij 22 °C. Vervang daarna het supernatant van de cellen door een eerder bereid geconditioneerd medium.

Visualiseer na 16 uur de celaggregatie met lichtveldmicroscopie met een 5x objectief. Hier vertonen de cellen die deficiënt zijn voor Coronin-A een defect in de vroege ontwikkeling en waren zij niet in staat om multicellular aggregaten te vormen, wat de eerste stap is tijdens de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum. In deze figuur werden de vegetatieve wildtype- en corA-deficiënte cellen gewassen en twee uur uitgehongerd voordat zij in suspensie gedurende vijf uur, elke zes en een halve minuut, werden gepulst met of zonder 15 animal of cyclic AMP.

De toepassing van exogene cyclisch AMP-pulsen herstelde het wildtype-fenotype volledig. In deze figuur werden exponentieel groeiende wildtype- en corA-deficiënte cellen gewassen in PBM, gezaaid in multi-wellplaten en geïncubeerd in geconditioneerd medium verkregen van wildtype of corA-deficiënte uithongerde cellen. De beelden zijn genomen 16 uur na het zaaien van de cellen.

corA-deficiënte Dictyostelium discoideum waren in staat om alle benodigde factoren voor de ontwikkelingsinductie te produceren, maar konden hier niet op reageren. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in 20 uur worden voltooid, inclusief de incubatietijd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat voor verschillende stammen een aanpassing van meerdere variabelen van de assay vereist zal zijn, zoals celdichtheden, adhesietijd en ontwikkeltijd.

Na deze procedure kunnen biochemische fractionering en daaropvolgende proteomische analyse worden uitgevoerd om factoren te identificeren die betrokken zijn bij de vroege uithongeringsrespons van Dictyostelium discoideum. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe de vroege ontwikkeling van Dictyostelium discoideum onder ondergedompelde omstandigheden kan worden geïnduceerd, gebruikmakend van zowel geconditioneerd medium als cyclisch AMP-pulsen.