Name: Onderzoek naar de functie van Coronin A in de vroege honger Reactie Dictyosteliumcellen discoideum Door Aggregation Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Ontdek hoe coronin A de vroege hongerrespons reguleert in Dictyostelium discoideum met aggregatie-assays. Deze methode onthult signaleringsroutes voor multicellulaire ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het Dictyostelium Stock Center voor stammen en reagentia. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de Swiss National Science Foundation en het kanton Bazel.

<ol><li> Let op de vroege hongerdood reactie van Dictyostelium discoideum door time-lapse microscopie. <ol><li> Groeien DH1.10 cellen of corA deficiënte cellen in een conische kolf die HL-5 medium (voor 1 L: 5 g proteosepepton, 5 g thiotone E pepton, 10 g glucose, 5 g gistextract, 0,35 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2PO 4, 0,05 g dihydrostreptomycine sulfaat, pH 6,6) bij 22 ° C in een schudincubator met een rotatie van 160 opm. Houd cellen met een dichtheid tussen 0,01 x 10 6 cellen / ml en 2 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Onderzoek cel aggregatie, door het oogsten log-fase groeiende DH1.10 cellen 21 of corA deficiënte cellen 10 gegenereerd in de DH1.10 achtergrond, geteeld in schudden cultuur met HL-5 medium bij 22 ° C. Hiervoor passende hoeveelheid cellen (meestal tussen 10 en 50 ml), centrifugeer gedurende 3 min bij 400 xg en was de cellen tweemaal BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5). </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer. Vervolgens plaat cellen bij een dichtheid van (5, 10, 20 of 40) x 10 4 cellen / cm2 in een 24-wells plaat. Laat ze hechten gedurende 1 uur bij 22 ° C in BSS. </li><li> Visualiseer aggregatie door time-lapse microscopie, zoals beschreven voor 10, het nemen van beelden elke 135 sec. met een live cell imaging opgezet met 5x objectief en een elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting camera automatisch de juiste software (zie Materialen tabel). </li></ol></li><li> cAMP pulserende van Dictyostelium discoideum cellen tijdens de hongerdood. <ol><li> Onderzoekt het effect van extern aangelegde cAMP pulsen op de ontwikkeling van DH1.10 cellen 21 of DH1.10 corA deficiënte cellen 10, door het oogsten van cellen. Hiervoor passende hoeveelheid cellen (meestal tussen 10 en 50 ml), centrifugeer gedurende 3 min bij 400 x g en tweemaal wassen BSS. </li><li> Count cellen met een hemocytometer en resuspendeer de cellen tot een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml in BSS. Schud de cultures (160 rpm) bij 22 ° C gedurende 2 uur voordat pulsen. Voeg cAMP pulsen met behulp van een timer gestuurde peristaltische pomp. Programmeer de pomp op een 5 sec puls te leveren elke 6,5 min van 15 ul van 50 nM cAMP (uiteindelijke concentratie) over een periode van 5 uur. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer. Vervolgens plaat de cellen bij een dichtheid van (5, 10, 20 of 40) x 10 4 cellen / cm2 in een 24-wells plaat. Laat zich te houden gedurende 1 uur in BSS. </li><li> Visualiseren aggregatie na 16 uur bij 22 ° C met helderveld microscopie met een 5X doel. </li></ol></li><li> Inductie van Dictyostelium discoideum ontwikkeling door middel van blootstelling aan geconditioneerd medium. <ol><li> Bereid verse geconditioneerd medium zoals beschreven 22. Verzamel log-fase DH1.10 cellen 21 of DH1.10 corA deficiënte cellen 10, van het schudden cultgelen met HL-5 medium bij 22 ° C met een pipet, centrifugeer gedurende 3 min bij 400 xg en wassen cellen drie keer in PBM (0,02 M kaliumfosfaat, 10 pM CaCl2 en 1 mM MgCl2, pH 6,1). </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer, resuspendeer in deze PBM bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml en schud gedurende 20 uur bij 110 rpm / 22 ° C. </li><li> Verzamelen geconditioneerd medium na centrifugatie bij 400 xg gedurende 3 min en verhelderen door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Filter geconditioneerd medium door een 0,45 pm filter (zie Materialen Table) en verdun drievoudige in PBM. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer en plaat bij een dichtheid van (5, 10, 20 of 40) x 10 4 cellen / cm2 in een 24-wells plaat. Laat ze hechten gedurende 1 uur bij 22 ° C. </li><li> Uitwisseling supernatant van de cellen met de eerder bereide geconditioneerde medium. </li><li> Visualiseer een aggregatieN a 16 uur door heldere-microscopie met behulp van een 5X doelstelling. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li>
<li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li>
<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signal+transduction+pathways+regulating+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum.</a> Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).</li>
<li>Clarke, M., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+and+CMF%2C+autocrine+factors+that+regulate+gene+expression+during+growth+and+early+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium.</a> Experientia. 51, 1124-1134 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aggregation+in+Dictyostelium+discoideum+by+an+External+Periodic+Pulse+of+Cyclic+Adenosine+Monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate.</a> Science. 175, 333-335 (1972).</li>
<li>Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cyclic+AMP+in+Dictyostelium+discoideum+and+Polysphondylium+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum.</a> Nature. 224, 1211-1212 (1969).</li>
<li>Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analyses+of+gene+regulation+during+early+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum.</a> Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).</li>
<li>Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signals+induce+cell+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).</li>
<li>Mann, S. K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+regulation+of+early+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%3A+mediation+via+the+cell+surface+cyclic+AMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor.</a> Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).</li>
<li>Vinet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li>
<li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin%2C+defines+a+new+subfamily%2C+and+predicts+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268(2011).</li>
<li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+guard%3A+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li>
<li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Leukocyte+Plasma+Membrane+with+the+Actin+Cytoskeleton+through+Coiled+Coil-mediated+Trimeric+Coronin+1+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules.</a> Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).</li>
<li>Kammerer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+trimerization+motif+controls+the+topology+of+short+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).</li>
<li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronins%3A+the+return+of+the+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronins: the return of the crown.</a> Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).</li>
<li>Jayachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin+1+Regulates+Cognition+and+Behavior+through+Modulation+of+cAMP%2FProtein+Kinase+A+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling.</a> PLoS Biol. 12, e1001820(2014).</li>
<li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li>
<li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li>
<li>de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin%2C+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections%2C+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li>
<li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li>
<li>Cornillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phg1p+is+a+nine-transmembrane+protein+superfamily+member+involved+in+dictyostelium+adhesion+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).</li>
<li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+80+x+10%283%29+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li>
<li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+science%22%5BJournal%5D)">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li>
<li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li>
<li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

De coronin eiwitten worden gevonden in de meeste taxa van de eukaryote clade. Dictyostelium discoideum coronin A, het homoloog van zoogdier coronin 1, is betrokken bij de vroege hongerdood reactie, aangezien coronin A-deficiënte cellen zijn niet in staat om aggregatie maken samen tijdens de vroege ontwikkeling cyclus 10. In staat zijn om de vertraging in ontwikkeling tussen de stammen kwantitatief en nauwkeurig te beoordelen, een microscoop live cell imaging set-up met de geautomatiseerde podium cont...

De coronin familie van eiwitten is sterk geconserveerd hele eukaryoten. Deze eiwitten worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een amino-eindstandige tryptofaan-aspartaat (WD) herhaling-bevattend gebied, gevolgd door een unieke regio verbonden met een carboxy-eindstandig coiled-coil domein 13,14 (Figuur 1). Coronins zijn betrokken bij diverse celfuncties, waaronder cytoskelet regulatie en signaaltransductie 12. In zoogdieren, tot zes korte coronin moleculen (coronin 1-6) en een &quot;tandem&quot; coronin 7, samen worden uitgedrukt 12,15. Coronin 1 is de meest uitgebreid onderzochte familielid, en bleek betrokken te zijn bij de vernietiging pathogene T celoverleving en neuronale signalering. Hoe precies, coronin 1 voert deze werkzaamheden blijft onduidelijk. Terwijl coronin 1 werd aangetoond dat Ca2 + en cAMP-afhankelijke signalering en F-actine cytoskelet modulatie 16-18, de eventuele co reguleren-expressie tot 7 familieleden in zoogdieren heeft het een uitdaging om de moleculaire functie van coronins bestuderen deze systemen, vanwege mogelijke ontslagen. In tegenstelling tot zoogdieren organismen, hoe lager eukaryoot Dictyosteliumcellen discoideum uitdrukt slechts twee coronin familieleden (coronin A, de ortholoog van zoogdier coronin 1 en coronin B, de ortholoog van zoogdier coronin 7) met schijnbaar niet-redundante functies 15,19,20. Dit feit maakt Dictyostelium discoideum een krachtig model om de functie van coronins bestuderen. Om de rol van coronin A in Dictyostelium discoideum bestuderen, geïnduceerd we de ontwikkelingscyclus door verhongering in weefselkweek platen met gebalanceerde zoutoplossing (BSS) buffer met behulp van wildtype cellen of cellen zonder coronin A 10. We vonden dat cellen zonder coronin A waren niet in staat om meercellige aggregaten op hongerdood te vormen. Voor een nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van dit fenotype hetgeautomatiseerde live cell imaging beschreven in dit protocol is een essentieel instrument. Het defect in de inleiding van het begin van de hongerdood reactie in cellen zonder coronin A kan worden gered door het leveren van pulsen van cAMP, wat suggereert dat coronin Een handelingen stroomopwaarts van de cAMP cascade. De exogene toepassing van cAMP pulsen op de inleiding van de ontwikkeling van de simulatie is gebruikt door verschillende laboratoria in het verleden 8,9. Maar deze procedure ook bekend sterk afhankelijk celdichtheden en timing zijn. Daarom is het protocol hier beschreven beoogd deze variabiliteit om een ​​hoge mate van reproduceerbaarheid te garanderen verminderen. Samengevat, de technieken toegepast in deze studies krachtige hulpmiddelen om de functies van eiwitten onderzocht tijdens de vroege stadia van de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum en hebben het potentieel om up- identificeren en effectoren van coronin Een functie.

<table><tbody><tr><td>HL-5 media (voor 1 L: 5 g proteose pepton, 5 g thiotone E pepton, 10 g glucose, 5 g gistextract, 0,35 g Na2HPO4*2H2O, 0,35 g KH2PO4, 0,05 g dihydrostreptomycin-sulfaat, pH 6,6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteose pepton</td><td>BD Bioscience</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Thiotone E pepton</td><td>BD Bioscience</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4*2H2O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>dihydrostreptomycin-sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (0,02 M kaliumfosfaat, 10 &mu;M CaCl2 en 1 mM MgCl2, pH 6,1)</td><td></td><td></td><td>zelf gemaakt</td></tr><tr><td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)</td><td></td><td></td><td>zelf gemaakt</td></tr><tr><td>0,45-&mu;m Filtropure S-filter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-wells weefselkweekplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>Cellobserver microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>op maat gemaakt</td></tr><tr><td>AxioVision software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPC Microprocessor&ndash;gestuurde doseerpomp</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 135M microscoop</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Incubatieschuddel</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek naar de functie van coronin a in de vroege honger reactie<em&gt; dictyosteliumcellen discoideum</em&gt; door aggregation assays

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoebe zijn te vinden in de bodem en voeden zich met bacteriën. Toen voedselbronnen schaars geworden, ze scheiden factoren een meercellige ontwikkelingsprogramma, waarin enkele cellen chemotax richting aggregatie centra 1-4 te starten. Dit proces is afhankelijk van de afgifte van cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) 5. cAMP wordt in golven door de gecoördineerde werking van adenylaatcyclase en fosfodiësterasen en bindt aan G-eiwit gekoppelde receptoren cAMP 6,7. Een veel gebruikte bepaling voor de bij de ontwikkelingscyclus van de lagere eukaryote Dictyostelium discoideum mechanismen is gebaseerd op de waarneming van celaggregatie in ondergedompelde omstandigheden 8,9 analyseren. Dit protocol beschrijft de analyse van de rol van coronin A in de ontwikkelingscyclus door verhongering in weefselkweek platen ondergedompeld in gebalanceerde zoutoplossing (BSS) 10. Coronin A is een lid van de zeer geconserveerde protein familie van coronins die zijn betrokken bij een breed scala aan activiteiten 11,12. Dictyostelium cellen die coronin A zijn niet multicellulaire aggregaten, en dit gebrek kan worden gered door pulsen toevoeren van cAMP, wat suggereert dat coronin Een handelingen stroomopwaarts van de cAMP cascade 10. De in deze studies beschreven technieken krachtige hulpmiddelen om de functies van eiwitten te onderzoeken in de beginfase van de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum stroomopwaarts van de cAMP cascade. Daarom is het gebruik van deze samenvoeging test kan de verdere studie van coronin Een functie mogelijk te maken en ons begrip van coronin biologie.

Cellen deficiënt coronin A tonen een defect in de vroege ontwikkeling (figuur 2). Aangezien coronin A cellen niet in staat om multicellulaire aggregaten, die de eerste stap in de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum vormen. Daarom coronin A lijkt een rol te spelen tijdens de vroege respons hongerdood en / of cAMP-signalering. Inderdaad is het ontbreken van meercellige aggregaatvorming in afwezigheid van coronin A gepaard met verlaagde cAMP signalerin...

De sociale amoebe Dictyostelium discoideum ondergaat een ontwikkelingsovergang naar een meercellig organisme wanneer het verhongert. Het evolutionair geconserveerde eiwit coronine A speelt een cruciale rol bij het initiëren van de ontwikkeling. Met behulp van aggregatie-assays als onze belangrijkste methode, streven we ernaar de rol van coronine A in de vroege ontwikkeling te verduidelijken.

Onderzoek naar de functie van Coronin A in de vroege honger Reactie<em&gt; Dictyosteliumcellen discoideum</em&gt; Door Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de Coronin-A-afhankelijke vroege uithongeringsrespons van Dictyostelium discoideum te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ontwikkelingsbiologie, zoals de identificatie van signaleringspaden en factoren die betrokken zijn bij de vroege ontwikkeling van Dictyostelium discoideum. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze potentieel een instrument biedt voor geautomatiseerde high-throughput screening van ontwikkelingsinducerende factoren en eiwitten die betrokken zijn bij vroege ontwikkelingssignalering.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de meerdere variabelen die inherent zijn aan de assay, zoals celdichtheden, hechtingstijd en ontwikkeltijd. Om deze procedure te starten, kweekt u DH1.10-cellen of corA-deficiënte cellen in een Erlenmeyerkolf met HL-5-medium, bij 22 °C, in een schudincubator op 160 rpm. Houd de cellen op een dichtheid tussen 1 × 10⁴ en 2 × 10⁶ cellen per milliliter.Om celaggregatie te onderzoeken, oogst 10 tot 50 milliliters log-fase-groeiende DH1.10-cellen of corA-deficiënte cellen gegenereerd op de DH1.10-achtergrond. Centrifugeer deze gedurende drie minuten bij 400 ×g. Was de cellen vervolgens tweemaal in BSS.Tel daarna de cellen met een hemocytometer. Zaai de cellen vervolgens uit in een 24-wellplaat. Laat ze één uur hechten bij 22 degrees Celsuis in BSS.Visualise vervolgens de celaggregatie met time-lapse microscopie en neem elke 135 seconden beelden op. Om het effect van de extern toegepaste cyclisch AMP-pulsen op de ontwikkeling van DH1.10-cellen, of corA-deficiënte DH1.10-cellen te onderzoeken, oogst dan 10 tot 50 milliliter van de cellen en centrifugeer deze drie minuten bij 400 ×g. Was ze daarna twee keer in BSS.Tel de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer de cellen vervolgens tot een dichtheid van 1 × 10⁷ cellen per milliliter in BSS. Schud de culturen daarna twee uur lang bij 22 °C op 160 rpm voordat de pulsen worden toegediend.Pas vervolgens pulsen van cyclisch AMP toe met behulp van een peristaltische pomp die door een timer wordt aangestuurd. Programmeer de pomp om gedurende een periode van vijf uur elke zes en een halve minuut een puls van vijf seconden cyclisch AMP af te geven. Een cruciale stap is om ervoor te zorgen dat de tip van de injectie van cyclisch AMP niet continu in de oplossing is ondergedompeld, maar slechts periodiek in de golven die door de shaker worden gegenereerd.Tel na toevoeging van cyclisch AMP de cellen opnieuw met een hemocytometer. Zaai de cellen vervolgens uit in een 24-wellplaat en laat ze één uur hechten in BSS. Visualiseer na 16 uur de celaggregatie bij 22 °C met bright-field microscopie met een 5x objectief.In deze procedure wordt vers geconditioneerd medium bereid door DH1.10-cellen in de logaritmische fase of DH1.10 corA-deficiënte cellen te oogsten uit schudcultures met HL5-medium bij 22 °C. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 400 ×g. Was ze daarna drie keer met PBM.Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer ze daarna in PBM bij een dichtheid van 1 × 10⁷ cellen per milliliter en schud ze gedurende 20 uur bij 22 °C op 110 rpm. Centrifugeer de cellen vervolgens bij 400 ×g gedurende drie minuten en verzamel daarna het geconditioneerde medium. Clarificeer het medium vervolgens door centrifugatie bij 8.000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C.Filter vervolgens het geconditioneerde medium door een 0,45 micrometer filter en verdun het drievoudig in PBM. Tel de cellen met een hemocytometer, zaai ze uit in een 24-wellplaat en laat ze één uur hechten bij 22 °C. Vervang daarna het supernatant van de cellen door een eerder bereid geconditioneerd medium.Visualiseer na 16 uur de celaggregatie met lichtveldmicroscopie met een 5x objectief. Hier vertonen de cellen die deficiënt zijn voor Coronin-A een defect in de vroege ontwikkeling en waren zij niet in staat om multicellular aggregaten te vormen, wat de eerste stap is tijdens de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum. In deze figuur werden de vegetatieve wildtype- en corA-deficiënte cellen gewassen en twee uur uitgehongerd voordat zij in suspensie gedurende vijf uur, elke zes en een halve minuut, werden gepulst met of zonder 15 animal of cyclic AMP.De toepassing van exogene cyclisch AMP-pulsen herstelde het wildtype-fenotype volledig. In deze figuur werden exponentieel groeiende wildtype- en corA-deficiënte cellen gewassen in PBM, gezaaid in multi-wellplaten en geïncubeerd in geconditioneerd medium verkregen van wildtype of corA-deficiënte uithongerde cellen. De beelden zijn genomen 16 uur na het zaaien van de cellen.corA-deficiënte Dictyostelium discoideum waren in staat om alle benodigde factoren voor de ontwikkelingsinductie te produceren, maar konden hier niet op reageren. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in 20 uur worden voltooid, inclusief de incubatietijd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat voor verschillende stammen een aanpassing van meerdere variabelen van de assay vereist zal zijn, zoals celdichtheden, adhesietijd en ontwikkeltijd.Na deze procedure kunnen biochemische fractionering en daaropvolgende proteomische analyse worden uitgevoerd om factoren te identificeren die betrokken zijn bij de vroege uithongeringsrespons van Dictyostelium discoideum. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe de vroege ontwikkeling van Dictyostelium discoideum onder ondergedompelde omstandigheden kan worden geïnduceerd, gebruikmakend van zowel geconditioneerd medium als cyclisch AMP-pulsen.

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

De sociale amoeben Dictyostelium discoideum is onlangs vastgesteld als een systeem om eiwitmisvouwen en proteostase te bestuderen. Hier beschrijven we een nieuwe op beeldvorming gebaseerde methodologie om temperatuur-geïnduceerde eiwitaggregatie en de cellulaire stressrespons in D. discoideum te bestuderen.

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van<em&gt; D. discoideum</em&gt; Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

Macropinocytosis, grootschalige aspecifieke vloeibare opname, is belangrijk in veel gebieden van de klinische biologie met inbegrip van immunologie, infectie, kanker en neurodegeneratieve ziekten. Hier, zijn bestaande technieken aangepast om high-throughput, eencellige resolutie meting van macropinocytosis in het macropinocytosis model organisme Dictyostelium discoideum met stroom cytometry.

High-throughput meting van Dictyostelium discoideum Macropinocytosis door Stroom Cytometry

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Dit protocol beschrijft de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit Escherichia coli na behandeling met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het volgen van deze procedure maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in vivo in verschillende bacteriestammen en/of tussen behandelingen.

Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Ontdek hoe coronin A de vroege hongerrespons reguleert in Dictyostelium discoideum met aggregatie-assays. Deze methode onthult signaleringsroutes voor multicellulaire ontwikkeling.

Onderzoek naar de functie van Coronin A in de vroege honger Reactie

Meer video's verkennen