Onderzoek naar de functie van Coronin A in de vroege honger Reactie Dictyosteliumcellen discoideum Door Aggregation Assays
18 juni 2016
De sociale amoebe Dictyostelium discoideum ondergaat een ontwikkelingsovergang naar een meercellig organisme wanneer het verhongert. Het evolutionair geconserveerde eiwit coronine A speelt een cruciale rol bij het initiëren van de ontwikkeling. Met behulp van aggregatie-assays als onze belangrijkste methode, streven we ernaar de rol van coronine A in de vroege ontwikkeling te verduidelijken.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de Coronin-A afhankelijke vroege hongerrespons van Dictyostelium discoideum te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van de ontwikkelingsbiologie, zoals de identificatie van signaalroutes en factoren die betrokken zijn bij de vroege ontwikkeling van Dictyostelium discoideum. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze de potentie heeft om een hulpmiddel te bieden voor geautomatiseerd en grootschalig screening van ontwikkelings-inducerende factoren en eiwitten die betrokken zijn bij vroege ontwikkelingssignalering.
In het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode, worstelen vanwege meerdere variabelen die inherent zijn aan de test, zoals celdichtheden, hechtingstijd en ontwikkelingstijd. Om deze procedure te beginnen, laat DH1.10-cellen of corA-deficiënte cellen groeien in een Erlenmeyer-kolf met HL-5-medium, bij 22 graden Celsius, in een schudende incubator bij 160 rpm. Houd de cellen op een dichtheid tussen één maal 10 tot de vier en twee maal 10 tot de zes cellen per milliliter.
Om celaggregatie te onderzoeken, oogst u 10 tot 50 milliliter log-fase groeiende DH1.10-cellen of corA-deficiënte cellen gegenereerd in de DH1.10 achtergrond. Centrifugeer ze gedurende drie minuten bij 400 maal g. Was vervolgens de cellen twee keer in BSS.
Tel daarna de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaats vervolgens de cellen in een 24-wellplaat. Laat ze een uur hechten bij 22 graden Celsius in BSS.
Bekijk vervolgens de celaggregatie met behulp van tijd-lapse microscopie en maak elke 135 seconden een foto. Om het effect van de extern toegepaste cyclische AMP-pulsen op de ontwikkeling van DH1.10-cellen, of DH1.10 corA-deficiënte cellen te onderzoeken, oogst u 10 tot 50 milliliter van de cellen en centrifugeer ze gedurende drie minuten bij 400 maal g. Was ze vervolgens twee keer in BSS.
Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaats vervolgens de cellen opnieuw in suspensie tot een dichtheid van één maal 10 tot de zeven cellen per milliliter in BSS. Schud de culturen vervolgens gedurende twee uur bij 22 graden Celsius bij 160 rpm voordat u pulsen toepast.
Pas vervolgens cyclische AMP-pulsen toe met behulp van een timergestuurde peristaltische pomp. Programmeer de pomp om een vijf seconden durende puls van cyclisch AMP elke zes en een halve minuut gedurende een periode van vijf uur te leveren. Een cruciale stap is ervoor te zorgen dat de punt van de cyclische AMP-injectie niet continu ondergedompeld is in de oplossing, maar slechts periodiek ondergedompeld is in de golven die door de shaker worden gegenereerd.
Na toediening van cyclisch AMP telt u de cellen opnieuw met behulp van een hemocytometer. Plaats vervolgens de cellen in een 24-wellplaat en laat ze een uur hechten in BSS. Na 16 uur visualiseert u de celaggregatie bij 22 graden Celsius met behulp van helderveldmicroscopie met een vijf x subjectief.
Bereidt in deze procedure vers geconditioneerd medium voor door log-fase DH1.10-cellen of DH1.10 corA-deficiënte cellen te verzamelen uit de schudende culturen met HL5-medium bij 22 graden Celsius. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 400 maal g. Was ze vervolgens drie keer in PBM.
Tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer, Plaats ze vervolgens opnieuw in suspensie in PBM met een dichtheid van één maal 10 tot de zeven cellen per milliliter en schud ze gedurende 20 uur bij 22 graden Celsius bij 110 rpm. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende drie minuten bij 400 maal g, gevolgd door het verzamelen van het geconditioneerde medium. Helder vervolgens het medium door centrifugatie bij 8.000 maal g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.
Filter vervolgens het geconditioneerde medium door een 0,45 micrometer filter en verdun het drievoud in PBM. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer, plaats ze in een 24-wellplaat en laat ze een uur hechten bij 22 graden Celsius. Wissel vervolgens het supernatant van de cellen uit met een eerder bereid geconditioneerd medium.
Na 16 uur visualiseert u de celaggregatie met helderveldmicroscopie met een vijf x subjectief. Hier laten de cellen die een tekort aan Coronin-A hebben een defect zien in de vroege ontwikkeling en waren niet in staat om meercellige aggregaten te vormen, wat de eerste stap is tijdens de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum. In deze figuur werden de vegetatieve wilde type en corA-deficiënte cellen twee uur gewasen en uitgehongerd voordat ze werden gepulseerd met, of zonder, 15 dierlijke of cyclische AMP, elke zes en een halve minuut gedurende vijf uur in suspensie.
De toepassing van exogene cyclische AMP-pulsen herstelde volledig het fenotype van het wilde type. In deze figuur werden exponentieel groeiende wilde type en corA-deficiënte cellen gewassen in PBM, gezaaid in multi-wellplaten en geïncubeerd in geconditioneerd medium verkregen van wilde type of corA-deficiënte uitgehongerde cellen. De beelden werden 16 uur na het zaaien van de cellen gemaakt.
corA-deficiënte Dictyostelium discoideum, waren in staat om alle vereiste factoren voor de ontwikkelingsinductie te produceren, maar waren niet in staat om hierop te reageren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 20 uur worden uitgevoerd, inclusief incubatietijd, als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat voor verschillende stammen een aanpassing van meerdere variabelen van de test, zoals celdichtheden, hechtingstijd en ontwikkelingstijd, vereist zal zijn.
Na deze procedure kunnen biochemische fractierings- en daaropvolgende proteomische analyse worden uitgevoerd om factoren te identificeren die betrokken zijn bij de vroege hongerrespons van Dictyostelium discoideum. Na het bekijken van deze video, zou men een goed begrip moeten
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van coronin A in de vroege hongerreactie van de sociale amoeben Dictyostelium discoideum. Het onderzoek heeft tot doel de signaalroutes te verduidelijken die betrokken zijn bij de overgang van het organisme naar meercelligheid tijdens honger.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
- Microbiologie
Achtergrond
- Dictyostelium discoideum is een modelorganisme voor het bestuderen van cellulaire ontwikkeling.
- Coronin A is een evolutionair geconserveerd eiwit dat cruciaal is voor het initiëren van ontwikkeling.
- Het organisme ondergaat een significante overgang van eencellig naar meercellig onder hongeromstandigheden.
- Het begrijpen van dit proces kan inzichten bieden in ontwikkelingssignaleringsmechanismen.
Doel van het onderzoek
- Om de Coronin-A afhankelijke vroege hongerreactie in Dictyostelium discoideum te onderzoeken.
- Om belangrijke signaalroutes en factoren te identificeren die betrokken zijn bij vroege ontwikkeling.
- Om een methode te ontwikkelen voor high-throughput screening van ontwikkeling-inducerende factoren.
Gebruikte methoden
- Aggregatie-assays om ontwikkelingsovergangen te bestuderen.
- Groei van DH1.10 en corA-deficiënte cellen in HL-5 medium.
- Het onderhouden van specifieke celdichtheden tijdens het experiment.
- Gebruik van een schuddende incubator voor optimale groeiomstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- Coronin A speelt een belangrijke rol in de vroege ontwikkeling van Dictyostelium discoideum.
- Belangrijke factoren en routes betrokken bij de hongerreactie geïdentificeerd.
- Het potentieel voor geautomatiseerde screening van ontwikkelingsfactoren aangetoond.
- Uitdagingen aangepakt die nieuwkomers bij de methode ondervinden.
Conclusies
- De studie vergroot de kennis van ontwikkelingsbiologie in Dictyostelium discoideum.
- Coronin A is essentieel voor het initiëren van meercellig ontwikkeling.
- De bevindingen kunnen leiden tot verder onderzoek naar ontwikkelingssignaleringsroutes.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Early-stage aggregation assays in Dictyostelium discoideum enable mechanistic de-risking of protein function upstream of key signaling cascades. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating the role of coronin A in multicellular development initiation. The method provides a robust platform for functional interrogation of signaling components relevant to developmental and cell signaling research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional dissection of protein roles in early developmental signaling.
- Supports biological de-risking by clarifying upstream pathway dependencies.
- Facilitates predictive confidence in target selection for further study.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for high-throughput screening of development-inducing factors.
- Standardizes aggregation readouts for reproducibility and quantitative comparison.
- Enables scalable evaluation of protein function in multicellular transition models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early mechanistic findings with downstream pathway analysis in disease-relevant systems.
- Provides continuity from discovery-stage functional assays to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying pathway bottlenecks.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation assay positions upstream of cAMP signaling, bridging early discovery biology with downstream screening and analytics in the developmental signaling workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for protein function in starvation-induced development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables measurement of aggregation phenotypes and response to exogenous factors.
- Translational Research: Provides mechanistic insights that inform preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform for functional genomics and pathway interrogation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes assay conditions for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of signaling targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, aggregation assays, and time-lapse microscopy.
- Needs access to controlled incubators, peristaltic pumps, and quantitative imaging systems.
- Demands cross-team standardization of cell densities, adherence times, and development intervals.
- May require adaptation of assay variables for different genetic backgrounds or model systems.
- Dependent on precise control of exogenous factor delivery and environmental conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Observe the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Time-lapse Microscopy
2:14
cAMP Pulsing of Dictyostelium discoideum Cells During Starvation
3:54
Induction of Dictyostelium discoideum Development Through Exposure to Conditioned Medium
5:32
Results: cAMP Pulses Rescue the Early Developmental Defect of corA- Dictyostelium discoideum
6:45
Conclusion
