Name: De combinatie van Double Fluorescentie In Situ Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer een methode voor gelijktijdige detectie van drie genexpressies in muizenhersenen met dubbele fluorescentie in situ hybridisatie en immunolabeling. Dit protocol maakt celtype-specifieke lokalisatie mogelijk zonder antilichamen voor alle doelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in de laboratoria van de auteurs werd ondersteund door de UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 en BB/L003236/1), de Wellcome Trust (WT100269MA) en de European Research Council (ERC, "Ideas" Programma 293544). SJ werd ondersteund door een EMBO langetermijnbeurs. De auteurs danken Stephen Grant voor zijn technische assistentie.

Ethiek Verklaring: Muis veehouderij en de behandeling zijn in overeenstemming met de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken verordeningen en de UCL richtlijnen ethische commissie, die voldoet aan de Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 van het Verenigd Koninkrijk en zijn amendement Regulations 2012. LET OP: Alle oplossingen moeten worden gemaakt met diethylpyrocarbonaat (DEPC) - behandeld water om eventueel achtergebleven RNase vernietigen. Voor DEPC behandeling, voeg DEPC (1 ml per liter), schud krachtig tot alle DEPC bolletjes vervolgens verdwenen Autoclaveer de DEPC degraderen. 1. RNA Probe Synthesis <ol><li> LET OP: Bij het hanteren van formamide, Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en gebruik een veiligheidskabinet. Bereid hybridisatiebuffer:-DEPC behandeld gedeïoniseerd water met 50% (v / v) gedeïoniseerd formamide, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml gist tRNA, 1 x Denhardt&#39;s solution, en 10% w / v dextran sulfaat. </li><li> Kies een DNA kloon die de cDNA-sequentie van het gen van belang in een plasmide met RNA polymerase promoters bevat. Voor dit voorbeeld, gebruik dan een pCMV-sport6 ​​kloon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), met T7 en Sp6 RNA-polymerase promoters voor Aspa (aanvullende figuur 1). </li><li> Bereid gelineariseerd plasmide-DNA als template. <ol><li> Groeien de DNA-kloon, extraheer het plasmide met een kleinschalige plasmide zuivering kit volgens het protocol van de fabrikant en de sequentie met T7 en Sp6 universele primers. </li><li> Digest 1020 ug plasmide-DNA met een restrictie enzym dat knipt op het 5&#39;-uiteinde van de sense streng van het cDNA. Voor dit voorbeeld gebruiken 100 unit Sall aan de pCMV-SPORT6- Aspa plasmide verteren. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 oC </li><li> Voer een kleine hoeveelheid op een agarosegel om te controleren of het plasmide volledig lineair. </li></ol></li><li> Zuiver hetgelineariseerde plasmide met behulp van fenol-chloroform. <ol><li> Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat, één volume 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) - geëquilibreerde fenol en één volume chloroform / isoamylalcohol (IAA) (24: 1). </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur (20 - 25 ° C, RT) en extraheer bovenste waterfase. </li><li> Dient een hoeveelheid chloroform / IAA, centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 min en extraheer bovenste waterfase. </li><li> Herhaal stap 1.4.3. </li><li> Voeg 2 volumina ethanol en laat bij -20 ° C gedurende 1 uur of O / N. </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Was de pellet met 70% koude ethanol en resuspendeer in bij benadering 1 ug cDNA per 2,5 pl in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Synthetiseren de twee probes, een gelabeld met digoxigenine (DIG) en een met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC). <ol><li> Selecteer de geschikte RNA polymerase om de anti-se makenNSE probe (complementair aan het doel mRNA). Voor dit voorbeeld gebruikt T7 RNA polymerase te maken Aspa probe. </li><li> Bereid in vitro transcriptiereactie: voeg 1 ug van het gelineariseerde DNA, 4,0 ui 5 x transcriptiebuffer, 6,0 pl 100 mM DTT, 2,0 ui 10X DIG of FITC RNA labeling mix met dNTPs, 1 pl RNase inhibitor, en 20 - 40 eenheden van RNA-polymerase; de uiteindelijke volume tot 20 ul met DEPC behandeld water. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5 uur. </li></ol></li><li> Run1 ul van de transcriptie reactie op een 1,0% agarosegel om te controleren of de reactie heeft gewerkt. De gel moet de lineaire sjabloon en een lichte band van de sonde te laten zien. </li><li> Voeg een volume van 100 ul met hybridisatiebuffer en bewaar 10 gl aliquots bij -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusie, Fixatie en Tissue Collection <ol><li> LET OP: Bij het hanteren van paraformaldehyde (PFA), zowel vast alswaterige, slijtage PPE en het gebruik van een veiligheidskabinet. Bereid formaldehyde oplossing door het oplossen van 4% (w / v) PFA in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing met warmte (55 ° C). Filter de formaldehyde-oplossing met filter papier. </li><li> Bereid sucrose oplossing door het oplossen van 20% (w / v) sucrose in gedestilleerd water en voeg 0,1% (v / v) DEPC oplossing. Laat O / N bij kamertemperatuur met een losse deksel en vervolgens autoclaaf. </li><li> Terminaal verdoven een muis door intraperitoneale injectie van pentobarbiton (50 mg / kg). Beoordeel de diepte van de anesthesie door teen knijpen en de afwezigheid van de terugtrekking reflex duidt diepe narcose. </li><li> Zodra de muis onder diepe narcose, een insnijding onder de ribbenkast en doorsnijden de ribbenkast aan beide zijden te tillen om het hart bloot te leggen. </li><li> Plaats een 25-G naald in de linker ventrikel van het hart. Maak een kleine incisie in de rechterboezem van het hart. </li><li> Perfuseren het dier met 20 ml PBS en 40 ml formaldehyde-oplossing. Voor P30 en oudermuizen, gebruikt een perfusie snelheid van 12 ml / min maar jonge dieren gebruiken een lagere (7-10 ml / min). </li><li> Ontleden de hersenen. <ol><li> Sever de muis hoofd met chirurgische schaar door het maken van een snede posterior uit de oren. Maak een caudale middellijn incisie in de huid en werken rostraal om de huid van de schedel te verwijderen. </li><li> Vanaf het caudale deel, dwars door de bovenkant van de schedel middellijn langs en tussen de ogen met Iris schaar. Verwijder de pariëtale en frontale bot platen door het kantelen van de ene kant van een bot plaat elke keer en snapping het af met een pincet. </li><li> Kantel de hersenen naar boven uit het voorste deel met een pincet en snijd de optische zenuwen en andere hersenzenuwen. Til de hersenen uit de schedel. </li></ol></li><li> Plaats de hersenen in een muis coronale hersenen matrix. Snijd de hersenen in het 3 ongeveer 4 mm stuks met een veer scheermesje. </li><li> Breng de plakjes in 4% PFA-oplossing en incubeer O / N bij 4 ° C. </li><li> overdracht hersenenplakjes DEPC-behandeld 20% sucrose-oplossing en incubeer O / N bij 4 ° C </li><li> Plaats elke hersenen slice in een droge cryomould, omringen met optimale snij-temperatuur (LGO) medium en vries op droog ijs. Bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Snij 15 micrometer secties van ingevroren weefsel in een cryostaat en het verzamelen van de secties op microscoop dia&#39;s. Indien nodig, nat van de secties met DEPC behandeld PBS en druk ze plat met een fijn penseel. </li><li> Laat de dia&#39;s drogen gedurende ongeveer 1 uur zodat het weefsel hecht aan de dia. </li></ol> 4. hybridisatie <ol><li> Bereid 65 ° C wasbuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x saline natriumcitraat), 50% (v / v) formamide en 0,1% (v / v) Tween- 20. </li><li> Bereid MABT buffer: 100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5. </li><li> Verdun de twee sondes (DIG gemerkte en FITC-gelabelded) 1/1000 in hybridisatiebuffer voorverwarmd tot 65 ° C en meng. </li><li> Toepassen ongeveer 300 gl hybridisatiemengsel op elke dia coverslipwith oven gebakken (200 ° C) dekglaasjes en geïncubeerd O / N bij 65 ° C in een bevochtigde kamer. </li><li> Overdracht van de dia&#39;s in een Coplin pot met voorverwarmde wasbuffer. Was de dia&#39;s voor 30 minuten tweemaal bij 65 ° C met wasbuffer. </li><li> Was de dia&#39;s voor 10 min driemaal met MABT bij kamertemperatuur. </li></ol> 5. Visualisatie van de FITC Probe <ol><li> Bereid ISH blokkeerbuffer: MABT met 2% blokkeerreagens en 10% door warmte geïnactiveerd serum schapen. </li><li> Optioneel: gebruik een hydrofoob pen om cirkels rond de weefselcoupes maken van de schuif naar volume antilichaam oplossingen vereist verminderen. </li><li> Incubeer de glaasjes gedurende 1 uur bij KT met ISH blokkerende buffer in een bevochtigde kamer. </li><li> Incubeer de glaasjes O / N bij 4 ° C met een mierikswortel peroxidase (POD) - conjugaatd anti-FITC antilichaam verdund 1/500 (v / v) in blokkeerbuffer ISH. </li><li> Plaats de objectglaasjes in een Coplin pot met PBS met 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Was 3 keer voor 10 min in PBST en vervangen door verse PBST elke keer. </li><li> Vlak voor het gebruik, de voorbereiding van de fluorescerende tyramide door verdunning 100 keer in de Amplification verdunner. Voor dit voorbeeld gebruiken FITC-tyramide. </li><li> Voeg dit toe aan de dia en laat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de objectglaasjes in een Coplin jar en was 3 keer in PBST gedurende 10 minuten. </li></ol> 6. Visualisatie van de DIG Probe <ol><li> Bereid 0,1 M Tris-HCl pH 8,2. </li><li> Incubeer de glaasjes met ISH blokkerende buffer gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Incubeer de glaasjes O / N bij 4 ° C met alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd anti-DIG antilichaam verdund 1/1500 (v / v) in blokkeerbuffer ISH. </li><li> Wassen met MABT gedurende 10 min driemaal. </li><li> Was tweemaal met 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li>Vlak voor het gebruik, voor te bereiden Fast Rode oplossing door het oplossen van de tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2. Filtreer de oplossing door een 0,22 pm filter. </li><li> Incubeer de glaasjes bij 37 ° C met Fast Red-oplossing in een bevochtigde kamer. Aangezien de tijd voor een optimale ontwikkeling varieert, controleer de objectglaasjes regelmatig met een fluorescentiemicroscoop om de neerslagvorming te controleren. Voor dit voorbeeld, stop de reactie na 2-3 uur. </li><li> Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal. </li></ol> 7. Immunohistochemie <ol><li> Bereid IHC blokkerende buffer: 10% (v / v) serum (van een andere soort dan primair antilichaam host) in PBST. </li><li> Incubeer dia&#39;s met IHC blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. </li><li> Bereid primaire antilichaam: verdun het primaire antilichaam in een geschikte verdunning in PBST met 5% serum (van een andere soort dan primaire antilichaam host). Voor dit voorbeeld, gebruik maken van een konijn anti-Olig2 antilichaam bij 1/400 (v / v) verdunning. </li><li>Incubeer in het primaire antilichaamoplossing bij 4 ° CO / N. </li><li> Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal. </li><li> Bereid secundair antilichaam: verdun een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam bij een passende verdunning in PBST met 5% (v / v) serum (van een andere soort dan primair antilichaam host) en 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Voor dit voorbeeld gebruik een ezel anti-konijn secundair antilichaam bij Alexa647 1/1000 (v / v) verdunning. </li><li> Incubeer in het secundaire antilichaamoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal. </li></ol> 8. Montage <ol><li> Gedeeltelijk Droog de glaasjes bij kamertemperatuur, en monteer met een fluorescentie montage medium. Laat de dia&#39;s beeld, 20X en 63X doelstellingen gebruikt 4 verschillende kanalen met de volgende golflengten drogen en in een confocale microscoop onder 10X: 570 nm voor Fast Red, 488 nm voor FITC, 647 nm voor Olig2 immunolabeling en 350 nm voor Hoechst . </li></ol>

<ol><li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li>
<li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain%3A+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li>
<li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canavan+disease%3A+clinical+features+and+recent+advances+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Int%22%5BJournal%5D)">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li>
<li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li>
<li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li>
<li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li>
<li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylaspartate+in+the+CNS%3A+from+neurodiagnostics+to+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li>
<li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+%28aminoacylase+II%29+in+the+developing+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li>
<li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li>
<li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aspartoacylase+%28ASPA%29+and+Canavan%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li>
<li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li>
<li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li>
<li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li>
<li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS%3A+therapeutic+implications+for+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol wordt stap-voor-stap procedure voor een dubbele RNA in situ hybridisatie gevolgd door immunokleuring. We hebben dit protocol dat wordt gebruikt om te bevestigen dat Aspa wordt uitgedrukt in mature oligodendrocyten in verschillende hersengebieden. Deze multi-step procedure vele valkuilen die gevoeligheid kan beïnvloeden en moeten worden vermeden. Ten eerste, alle oplossingen en buffers voor opslag transcriptiereactie nodig RNase-vrij zijn. Ten tweede, de keuze v...

Gliacellen, die de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel (CNS) zijn, omvatten oligodendrocyten (de myeliniserende cellen van CNS), oligodendrocyten precursors (OP&#39;s, ook bekend als &quot;NG2 cellen&quot;), astrocyten en microglia. Er is toenemende interesse in de functies van gliacellen en hun potentiële rol bij neurologische aandoeningen 1. Bijvoorbeeld, ziekte van Canavan (CD) is een erfelijke neurodegeneratieve aandoening de aanvang van de kinderjaren met spongiforme leukodystrofie en een progressief verlies van neuronen, wat leidt tot de dood gewoonlijk voor 10 jaar 2,3. Mutaties in de Aspartoacyclase (ASPA) gen die leiden drastisch verminderde activiteit ASPA 4 CD geïdentificeerd. ASPA is een enzym katalyseert de deacetylering van N-acetylaspartate (NAA), een molecuul sterk geconcentreerd in de hersenen, het genereren acetaat en aspartaat 5-7. Veel cd patiënten vertonen hogere NAA door gebrek aan ASPA acteit. Sommige studies speculeren dat NAA-afgeleide acetaat een belangrijke bron van vetzuren / lipiden in de hersenen tijdens de ontwikkeling zou kunnen zijn en CD gevolg kunnen zijn van verminderde myeline synthese tijdens de ontwikkeling veroorzaakt door het falen van NAA worden afgebroken 3,5,6. ASPA wordt vooral aangetroffen in de nieren, de lever en witte stof van de hersenen, en gezien de belangrijke rol van ASPA in CD, heeft de cellulaire expressie van dit enzym in de hersenen bestudeerd door verschillende laboratoria. Door te kijken naar ASPA enzymatische activiteit in de hersenen, eerdere studies bleek dat de toename van ASPA activiteit tijdens hersenontwikkeling loopt parallel met het tijdsverloop van myelinisatie 8-10. Op cellulair niveau assays voor enzymactiviteit als in situ hybridisatie (ISH) en immunohistochemie (IHC) analyses blijkt dat ASPA vooral uitgedrukt in oligodendrocyten in de hersenen, maar niet in neuronen en astrocyten 11-16. Een paar studies bleek dat ASPA zou ookuitgedrukt in microglia in het CZS 12,14. Tot nu toe gegevens over ASPA meningsuiting in OP&#39;s zijn beperkt. Volgens een recente studie waarin transcriptomes verschillende celtypen bij muizen cerebrale cortex inclusief neuronen, astrocyten, OP&#39;s, nieuw gevormde oligodendrocyten, myeliniserende oligodendrocyten, microglia, endotheelcellen en pericyten werden geanalyseerd door RNA sequentie 17 wordt ASPA uitsluitend uitgedrukt in oligodendrocyten , in het bijzonder in myelinating oligodendrocyten (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Ondanks deze studies ASPA expressiepatroon in de hersenen, een aantal onzekerheden blijven. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om genexpressie patronen bestuderen. IHC is een algemeen gebruikte werkwijze voor het detecteren van functionele product (dwz eiwit) van genexpressie in weefselcoupes. Ondanks zijn grote nut, deze techniek heeft beperkingen als de toepassing ervan en specificiteit zijn afhankelijk van to de beschikbaarheid en specificiteit van het antilichaam nodig is. Ter vergelijking, ISH heeft het voordeel dat de expressie van elk gen onthullen op het mRNA-niveau. Het kan echter technisch moeilijk om meerdere probes tegelijkertijd om een ​​genexpressie tot specifieke celtypen te lokaliseren. In dit artikel beschrijven we een protocol combineert dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie met fluorescentie immunolabel van een eiwit. We hebben deze set van technieken die worden gebruikt om de expressie patroon van Aspa in muizenhersenen te onderzoeken. Deze methode kan de precieze studie van genexpressie met behulp van confocale microscopie.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>voor ISH blokkeer buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt's solution</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA clone</td><td>Source Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Equilibrated phenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher scientific</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>voor 65 &deg;C was buffer</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha;-FITC POD-conjugated antibody</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade; Plus Fluorescein System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&alpha;-DIG AP-conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast red tablets</td><td>Roche</td><td>11496549001</td><td></td></tr><tr><td>.22 &micro;M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Olig2 Rabbit antbody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-conjugated &alpha;-rabbit antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de combinatie van double fluorescentie<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen secties

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detectie van genexpressie in verschillende hersencellen bijvoorbeeld neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, oligodendrocyt voorlopers en microglia, kan worden belemmerd door het gebrek aan specifieke primaire of secundaire antilichamen voor immunokleuring. Hier beschrijven we een protocol voor de expressie van drie verschillende genen in dezelfde hersenpreparaat met dubbelzijdige fluorescentie in situ hybridisatie detecteren met twee genspecifieke probes, gevolgd door immunokleuring met een antilichaam met hoge specificiteit die is gericht tegen het eiwit dat wordt gecodeerd door een derde gen. De Aspartoacyclase (ASPA) gen, mutaties die leiden tot een zeldzame menselijke wittestofziekte - ziekte Canavan - wordt gedacht te worden uitgedrukt in oligodendrocyten en microglia, maar niet in astrocyten en neuronen. De precieze expressiepatroon van ASPA in de hersenen nog niet vastgesteld. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om te bepalen dat ASPA wordt uitgedrukt in een subset van volwassen oligodendrocyten eennd kan algemeen worden toegepast op een breed scala van genexpressiepatroon studies.

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor dubbel fluorescentie ISH gevolgd door immunolabeling in muizenhersenen secties. Een korte beschrijving van dit protocol wordt getoond in figuur 1. De eerste stap was probes specifiek voor Aspa en Mbp (myeline basisch eiwit) synthetiseren. Nagaan of de probes waren gesynthetiseerd, een kleine hoeveelheid van elke reactie werd over agarose gel. De zwakke lineaire template en een groot deel van de RNA probe te zien...

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Het algemene doel van dit experiment is om de expressie van drie verschillende genen gelijktijdig aan te tonen in hersencoupes, met behulp van dubbele fluorescentie in situ hybridisatie gevolgd door immunokleuring. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurowetenschappen, zoals: welk celtype tot expressie brengt mijn gen van belang? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een goed antilichaam voor het betreffende gen niet vereist is om de expressie ervan in een specifiek celtype te kunnen lokaliseren.Samenvattend worden op de eerste dag gefixeerde weefselcoupes gesneden en gedurende de nacht gehybridiseerd met twee verschillend gelabelde RNA-probes. Op de tweede dag worden de coupes gedurende de nacht geïncubeerd met een antilichaam dat zich richt op de FITC-gelabelde probe. Dit antilichaam is geconjugeerd met mierikswortelperoxidase, dat op de derde dag de toevoeging van een fluorescent Tyramide katalyseert.Vervolgens wordt een met alkalische fosfatase geconjugeerd antilichaam gebruikt om de DIG-gelabelde probe te targeten. Op dag vier katalyseert dit enzym de vorming van een fluorescent precipitaat wanneer het wordt geïncubeerd met Fast

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Een combinatie van verschillende technieken om het verzamelen van gegevens te maximaliseren van muis weefsel wordt gepresenteerd.

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal...

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

Source: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the detection of mRNA within cholinergic axons in fixed mouse hippocampal slices using fluorescent in situ hybridization and antibody staining. Fluorescence microscopy reveals the spatial localization of probe-tagged mRNAs and choline acetyltransferase in cholinergic neurons.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

Dit protocol op inleidend niveau beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn om immunohistochemische kleuring van knaagdierhersenen te voltooien, gebruikmakend van markeringen voor microglia en neuronale elementen als voorbeeld.

Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Leer een methode voor gelijktijdige detectie van drie genexpressies in muizenhersenen met dubbele fluorescentie in situ hybridisatie en immunolabeling. Dit protocol maakt celtype-specifieke lokalisatie mogelijk zonder antilichamen voor alle doelen.

De combinatie van Double Fluorescentie In Situ Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties (Video) | JoVE Journal

De combinatie van Double Fluorescentie

Meer video's verkennen