De combinatie van Double Fluorescentie In Situ Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties
26 maart 2016
Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.
Het algemene doel van dit experiment is om gelijktijdig de expressie van drie verschillende genen in hersensneden te detecteren, met behulp van dubbele fluorescentie in situ hybridisatie gevolgd door immunokleuring. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals welke celtype mijn gen van belang tot expressie brengt? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je geen goed antilichaam nodig hebt voor je gen van belang om zijn expressie in een specifiek celtype te kunnen lokaliseren.
Om deze procedure samen te vatten, worden op de eerste dag vaste weefselsneden gesneden en overnacht gehybridiseerd met twee verschillend gelabelde RNA-sondes. Op de tweede dag worden de sneden overnacht geïncubeerd met een antilichaam dat zich richt op de FITC-gelabelde sonde. Dit antilichaam is geconjugeerd met mierikswortelperoxidase, die op de derde dag de toevoeging van een fluorescente Tyramide katalyseert.
Vervolgens wordt een alkalisch fosfatase-geconjugeerd antilichaam gebruikt om de DIG-gelabelde sonde aan te vallen. Op de vierde dag katalyseert dit enzym de vorming van een fluorescente neerslag wanneer het wordt geïncubeerd met Fast Red-oplossing. Vervolgens worden de sneden overnacht geïncubeerd met een primaire antilichaam dat zich richt op een eiwit van belang.
Ten slotte wordt dit eiwit op de vijfde dag gevisualiseerd met een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam. Om deze procedure te starten, kies je een DNA-kloon die de cDNA-sequentie van het gen van belang bevat in een plasmide met RNA-polymerase promotoren. Kweek vervolgens de DNA-kloon, extraheer het plasmide met een kleinschalige plasmide-zuiveringskit en sequenceer het met een T7 en SP6 universele primers.
Verteer 10 tot 20 microgram plasmide-DNA met een restrictie-enzym dat aan het vijf-prim-uiteinde van de zinsdraad van de cDNA snijdt. Incubeer het gedurende 1,5 uur bij 37 graden Celsius. Voer vervolgens een kleine aliquot uit op een agarosegel om te controleren of het plasmide volledig gelineariseerd is.
Om het gelineariseerde plasmide te zuiveren, voeg je 1/10 van het volume van drie molare natriumacetaat, één volume van 10 millimolair Tris-HCl geëquilibreerde fenol en één volume van chloroform isoamy alcohol toe. Centrifugeer gedurende één minuut bij 16.000 Gs bij kamertemperatuur en extraheer de bovenste waterige fase. Voeg vervolgens één volume chloroform IAA toe.
Centrifugeer het gedurende één minuut bij 16.000 Gs en extraheer de bovenste waterige fase. Herhaal deze stap nog een keer. Voeg vervolgens twee volumes ethanol toe en bewaar het één uur of een nacht lang bij min 20 graden Celsius.
Centrifugeer daarna gedurende 10 minuten bij 16.000 Gs bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en was de pellet met 70% koude ethanol. Neem het vervolgens op in TE met een concentratie van één microgram cDNA per 2,5 microliter.
Om de twee sondes te synthetiseren, selecteer je eerst de juiste RNA-polymerase. Bereid vervolgens de in vitro transcriptiereactie voor en breng het eindvolume op 20 microliter met DEPC-behandeld water. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 graden Celsius.
Vervolgens voer je één microliter van de transcriptiereactie uit op een 1% agarosegel om te controleren of de reactie is gelukt. De gel moet het lineaire sjabloon en een heldere band van de sonde laten zien. Snijd in deze procedure 15 micrometer dikke secties van bevroren weefsel in een cryostat.
Verzamel de secties op de microscoopglazen en laat de glazen een uur drogen om ervoor te zorgen dat de weefsels aan de glazen hechten. De belangrijkste factor voor een goede werking van deze procedure is de kwaliteit van de secties. Dit hangt deels af van goed doorbloed en gefixeerd weefsel en deels van de techniek van het snijden om vlakke secties te verkrijgen die vrij zijn van RNase-besmetting.
Verdun vervolgens de twee sondes in hybridisatiebuffer voorverwarmd tot 65 graden Celsius en meng goed. Breng 300 microliter hybridisatiemengsel aan op elke dia en bedek met een in de oven gebakken dekglas. Incubeer vervolgens de dia's een nacht lang bij 65 graden Celsius in een bevochtigde kamer.
De volgende dag breng je de dia's over in een Coplin-pot met voorverwarmd wasbuffer en was de dia's gedurende 30 minuten, twee keer, bij 65 graden Celsius. Was daarna de dia's gedurende 10 minuten drie keer met MABT-wasoplossing bij kamertemperatuur. Gebruik in deze stap een hydrofobe pen om cirkels rond de weefselsneden te tekenen.
Vervolgens incubeer je de dia's gedurende één uur bij kamertemperatuur met ISH-blokkeerbuffer in een bevochtigde kamer. Incubeer vervolgens de dia's een nacht lang bij 4 graden Celsius met een mierikswortelperoxide-geconjugeerd anti-fitc-antilichaam. Plaats de dia's vervolgens in een Coplin-pot met PBST.
Was ze driemaal gedurende 10 minuten in PBST en vervang ze elke keer door vers PBST. Voeg daarna fluorescente tiromide toe aan de dia's en laat ze 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Plaats de dia's in een Coplin-pot en was ze driemaal gedurende 10 minuten in PBST.
Incubeer vervolgens de dia's gedurende één uur bij kamertemperatuur met ISH-blokkeerbuffer. Incubeer vervolgens de dia's een nacht lang bij vier graden Celsius met een alkalisch fosfatase-geconjugeerd anti-dig-antilichaam. Was ze daarna drie keer gedurende 10 minuten in MABT.
Was de dia's vervolgens twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in 0,1 molair tris HCL bij pH 8,2. Filtreer de fast red-oplossing en incubeer de dia's bij 37 graden Celsius met fast red-oplossing in een bevochtigde kamer. Aangezien de tijd voor optimale ontwikkeling varieert, controleer je de dia's regelmatig met een fluorescentiemicroscoop om de vorming van neerslag te controleren.
Was ze vervolgens driemaal gedurende 10 minuten in PBST. Om immunohistochemie uit te voeren, incubeer je de dia's met IHC-blokkeerbuffer gedurende één uur bij kamertemperatuur in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de simultane detectie van drie verschillende genexpressies in coupes van hersenweefsel. De methode combineert dubbele fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met immuunkleuring, waardoor onderzoekers genexpressie kunnen lokaliseren in specifieke typen hersencellen, zelfs wanneer er geen geschikte antilichamen beschikbaar zijn voor alle doelen. Het protocol wordt geïllustreerd door de expressie van het Aspartoacyclase (ASPA) gen te bestuderen in oligodendrocyten en andere hersencellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Moleculaire biologie
- Histologie
Achtergrond
- Genexpressieanalyse in hersenweefsel wordt vaak beperkt door de beschikbaarheid van specifieke antilichamen voor immunokleuring.
- In situ hybridisatie maakt de detectie van mRNA-transcripten mogelijk en biedt daarmee een alternatief voor antilichaamgebaseerde methoden.
- Het combineren van FISH met immunokleuring maakt de gelijktijdige visualisatie van meerdere genproducten in dezelfde weefselcoupe mogelijk.
- Het ASPA-gen is betrokken bij de ziekte van Canavan en wordt vermoedelijk tot expressie gebracht in oligodendrocyten en microglia, maar het precieze expressiepatroon in de hersenen was voorheen onduidelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen en demonstreren van een protocol voor het detecteren van drie verschillende genexpressies in dezelfde hersendoorsnede.
- Het bepalen van het celtype-specifieke expressiepatroon van het ASPA-gen in de hersenen.
- Het bieden van een breed toepasbare methode voor genexpressiestudies in diverse weefsels en ontwikkelingsstadia.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van gefixeerde hersenweefselcoupes en cryostaat-sectionering.
- Synthese van twee genspecifieke RNA-probes gelabeld met verschillende tags (FITC en DIG) via in vitro transcriptie.
- Dubbele fluorescentie in situ hybridisatie met behulp van de twee probes, waarbij elk wordt gedetecteerd met enzym-geconjugeerde antilichamen en fluorescente substraten (Tyramide en Fast Red).
- Vervolgende immunokleuring met een zeer specifiek antilichaam tegen een derde eiwit, gevisualiseerd met een fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam.
- Confocale microscopie voor beeldvorming en analyse van genexpressiepatronen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakte de gelijktijdige detectie van drie genproducten in dezelfde hersendoorsnede succesvol mogelijk.
- ASPA-expressie was gelokaliseerd in een subset van mature oligodendrocyten, zoals aangetoond door co-labeling met MBP- en OLIG2-markers.
- Sommige MBP-positieve, OLIG2-positieve cellen vertoonden geen expressie van ASPA, wat wijst op heterogeniteit tussen oligodendrocyten.
- De methode bleek aanpasbaar aan verschillende weefseltypen en ontwikkelingsstadia.
Conclusies
- Dit protocol maakt een nauwkeurige mapping van genexpressie naar specifieke hersenceltypen mogelijk zonder dat er voor alle targets antilichamen nodig zijn.
- Het biedt nieuwe inzichten in de celtype-specifieke expressie van ASPA in de hersenen.
- De techniek is breed toepasbaar voor het bestuderen van genexpressiepatronen in diverse biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Bij het ontdekken van geneesmiddelen in de neurowetenschappen is het nauwkeurig bepalen van genexpressie in specifieke typen hersencellen cruciaal voor targetvalidatie en het verminderen van mechanistische risico's. Deze methode maakt de gelijktijdige detectie van drie genen mogelijk zonder afhankelijk te zijn van hoogwaardige antilichamen, waarmee een belangrijk knelpunt bij de targetbevestiging wordt weggenomen. Door ruimtelijk opgeloste, gemultiplexte genexpressiegegevens te leveren, ondersteunt het de vroege hypothesetoetsing en portfolioprioritering bij de ontwikkeling van therapeutica voor het centrale zenuwstelsel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door genexpressie in kaart te brengen in oligodendrocyten, microglia, astrocyten of neuronen.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van de beschikbaarheid van antilichamen, waardoor de tijdlijnen voor targetvalidatie worden versneld.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van co-expressiepatronen van genen in ziekterelateerde celtypen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaar voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare fluorescentie-uitlezingen voor drie targets per sectie, waardoor kwantitatieve vergelijking tussen condities mogelijk is.
- Schaalbaarheid: Compatibel met imaging-platforms met een hoge resolutie, wat schaalbare analyse van genexpressie in preklinische modellen ondersteunt.
- Herbruikbaarheid van het platform: Aanpasbaar aan diverse hersenregio's en ontwikkelingsstadia, wat de consistentie tussen studies bij het profileren van target-expressie faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt bevindingen over genexpressie in de ontdekkingsfase met preklinische modellen door celtype-specifieke expressie in de muizenhersenen te bevestigen.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of een target wordt tot expressie gebracht in de beoogde cellulaire context, waardoor het risico op uitval op basis van het werkingsmechanisme wordt verminderd.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de identificatie van celtype-specifieke signalen die in latere stadia vertaald kunnen worden naar vloeistof- of beeldvormingsbiomarkers.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelhypothese tot leadidentificatie en biedt mechanistisch vertrouwen voorafgaand aan de compoundscreening.
- Discovery Biology: Test hypothesen over targetexpressie door RNA- en proteïne-colokalisatie te visualiseren in gedefinieerde celpopulaties.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde, gemultiplexte resultaten die een betrouwbare vergelijking van genexpressie tussen experimentele groepen mogelijk maken.
- Analytics: Levert kwantitatieve fluorescentie- en precipitaatgebaseerde read-outs die een statistische vergelijking van expressieniveaus ondersteunen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro- of in silico-bevindingen met in vivo expressiepatronen in ziekterelevante neurale weefsels.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor gemultiplexte genexpressieprofilering over meerdere CNS-projecten.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de doelbiologie door mechanistische ambiguïteit in genexpressie te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de workflow voor gemultiplexte detectie, waardoor de reproduceerbaarheid tussen locaties en teams wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door de expressie van het doelwit in relevante celtypen te bevestigen, wat het biologische risico in een later stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van gevalideerde expressieprofielen in ziekte-relevante systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in RNA in situ hybridisatie, immunohistochemie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van een RNase-vrije omgeving, kwalitatieve weefselfixatie en precisie bij het maken van coupes.
- Toegang tot hybridisatieovens, fluorescentiemicroscopen en reagentia voor Tyramide- en Fast Red-detectie is noodzakelijk.
- De probe-concentratie en antilichaamtitratie moeten voor elk target worden geoptimaliseerd om achtergrondruis te minimaliseren.
- Beperkt door autofluorescentie van het weefsel en potentiële signaaloverlap in gemultiplexte kanalen, wat zorgvuldige spectrale scheiding vereist.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Overview of Double Fluoresence In Situ Hybridization Followed by Immunostaining
1:44
RNA Probe Synthesis
4:12
Cryosectioning and Hybridization
5:33
Visualization of the FITC Probe and the DIG Probe
7:23
Immunohistochemistry and Mounting
8:16
Results: Expression of Aspa in Oligodendrocytes in the Cortex and the Corpus Callosum
8:45
Conclusion
