Name: Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Leer een geïntegreerde workflow voor identificatie en validatie van genomische enhancers in embryonale stamcellen. Deze methode gebruikt ChIP-seq-analyse en reporter-assays om transcriptieregulatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, Dr. Endre Barta, Dr. Balint L Balint en leden van het Nagy laboratorium bedanken voor discussies en opmerkingen over het manuscript. L.N wordt ondersteund door subsidies van de Hongaarse Wetenschappelijke Onderzoeksfonds (OTKA K100196 en K111941) en medefinancierd door het Europees Sociaal Fonds en het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling en Hongaars Hersenonderzoeksprogramma - Subsidienummer KTIA_13_NAP-A-I/9.

1. Enhancer selectie op basis van Chip-seq Analyse <ol><li> Download de RXR ChIP-seq ruwe data fastq file (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) van http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ </li><li> Download en pak het vereiste BWA-index bestand voor de uitlijning (in ons geval: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz OPMERKING: Bezoek aan https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts voor meer informatie over de stappen van bio-informatica-analyse en de scripts hieronder gebruikte downloaden. </li><li> Lijn het voorbeeld fastq bestand naar MM10 genoom (gebruik het script: perform_alignment.sh). Dit zal een map met een .bam file en statistieken van de uitlijning te creëren. Aligned RXR ChIP-seq data (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), en de bijbehorende index-bestand (.bai) zijn hier beschikbaar: http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ LET OP: BWA is een softwarepakket dat Rela uitgelijndtief korte sequenties (bijvoorbeeld ChIP-seq resultaten) een sequentie databank, zoals de muis referentie genoom (bijvoorbeeld, MM10) 13. </li><li> Voer het script (callpeaks.sh) voor de piek bellen en de novo motief analyse. Gebruik de .bam bestand als de input. Het script is gebaseerd op Homerus findPeaks 14. NB: De output file ons informatie over het totale aantal pieken, verrijking van de motieven, het percentage van de achtergrond en de doelsequenties met motieven, enzovoort. (Figuur 1). Typisch verschillende motieven zijn vermeld in volgorde van hun betekenis. </li><li> Remap de # 1 gerangschikt motief (NR half `AGGTCA`) (gebruik het script: remap_motif.sh) LET OP: Als resultaat, het script genereert een .bed bestand dat zal laten zien welke chip-pieken die genomische regio&#39;s die de canonieke bindingsplaats van de transcriptiefactor van belang bevatten. </li><li> Download en visualiseren van de resultaten van de uitgelijnde RXR ChIP-seq leest (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (ook .bai downloaden)) en de AGGTCA motief occurrences (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) van Integrative Genomics Viewer (belastingen) aan 15 vermeende identificeren RAR / RXR bindingsplaatsen (Figuur 2 en Figuur 3). LET OP: integratie van verschillende ChIP-seq data zal helpen om meer precies te voorspellen goede kandidaat enhancers 16,17. Recente studies toonden aan dat actieve enhancers gewoonlijk verrijkt zijn P300 en correleren met H3K4me1 en H3K27ac, en bevinden zich in de open chromatine gebieden, waardoor DNase-I overgevoeligheid afbeelden aanbevolen 18-21. </li><li> Gebruik de &quot;een van belang definiëren&quot; in IGV 15-200 verkrijgen - 400 bp sequentie van het geselecteerde genomische regio en gebruikt deze sequenties voor volgende primer design. </li></ol> 2. Reporter Assay LET OP: De luciferine / luciferase systeem wordt gebruiktals een zeer gevoelig reporter assay voor transcriptionele regulering. Afhankelijk van de transcriptieverhogeractiviteit luciferase enzym geproduceerd dat de oxidatie van luciferine zal katalyseren oxyluciferine gevolg bioluminescense die gedetecteerd kan. Als eerste stap moet geïdentificeerde vermoedelijke enhancer sequenties gesubkloneerd in een reporter vector (bv TK-Luciferase 22, of pGL3 NanoLuc). <ol><li> primer Ontwerp <ol><li> Ontwerp PCR-primers voor amplificatie van 200-400 bp van vermoedelijke enhancer regios op Primer3 (hier beschikbaar: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 </li><li> Copy-paste de genoomsequentie van IGV dat de vermoedelijke bindingsplaats in Primer3 bevat (zie stap 1.7). Set product grootte bereik 250-300 bp in Primer3. </li><li> Valideren van de PCR-primers met behulp van de UCSC Genome Browser is In silico PCR gereedschap (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24 LET OP: Dit protocol in een latere stap gebruikt HindIII en BamHI restrictie-enzymen voor het kloneren. Controleer of de PCR geamplificeerde sequentie zoals voorspeld door de UCSC In-silico PCR tool zal AAGCTT of GGATCC restrictieplaatsen bevatten (bijv http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). </li><li> Verkrijgen van de gewenste primers van een commerciële leverancier. </li></ol></li><li> PCR-amplificatie van Enhancer Sequence van Genomic DNA <ol><li> Zuiver template genoom DNA van primaire cellen (bijvoorbeeld primaire embryonale fibroblasten). Gebruik commerciële kit voor gDNA isolatie en volg de instructies van de fabrikant. LET OP: Hoge kwaliteit van gDNA is essentieel voor een succesvolle PCR-amplificatie. Geschikte BAC klonen kunnen worden gebruikt als PCR niet gemakkelijk vanaf gDNA. </li><li> Bereid 50 gl PCR reactie bevattende 100 ng gDNA, 5 ui 10 x buffer, 3 pl MgSO 4 (25 mM), 5 pl dNTP (2 mM elk), 1,5 gl Fwd primer (10 uM), 1,5 ui Rev primer (10 uM) , 1 pl DNA polymerase <li> Stel de PCR-cyclus (2 min 95 ° C, (20 sec 95 ° C, 10 sec 58-65 ° C, 18 sec 70 ° C) x25 repeat, 2 min 70 ° C, voor altijd 4 ° C). Stel hybridisatietemperatuur met de overweging van de primer voorspelde Tm-waarden. </li><li> Zuiver het PCR product met een commerciële PCR zuiveringssamenstel en de instructies van de fabrikant. </li><li> Voeren de restrictieplaatsen voor klonering door herhaaldelijk PCR met primers zoals hierboven toegepast, maar het toevoegen overhangen op hun 5 &#39;einden (bijv Fwd: 5&#39;-atat AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3&#39; (HindIII), Rev: 5&#39;-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 &#39;(BamHI)). </li><li> Run 5 ui van het PCR-product op agarose gel om te controleren op niet-specifieke PCR-producten. NB: Als er meer bands worden gedetecteerd, voert u het volledige PCR-product en zuiveren de juiste band door een commerciële gel extractie kit. </li></ol&gt; </li><li> Beperking OPMERKING: insert klonen stroomopwaarts van TK promoter 22 het gezuiverde PCR-product en de vector (bijv TK-Luc) worden gedigereerd met HindIII en BamHI. <ol><li> Bereid een 50 gl reactiemengsel dat 1 ug gezuiverd PCR product, 1 ui HindlII (20 U / ul), 1 ui BamHI (20 U / pl) en 5 gl 10x buffer. </li><li> Bereid een 250 ul reactiemengsel dat 5 ug vector (TK Luc of andere reporter vector), 5 gl HindlII (20 U / pl), 5 ui BamHI (20 U / pl), 5 gl warmtegevoelige alkaline fosfatase (1 U / pl) en 25 gl 10x buffer. OPMERKING: AP behandeling van de vector vermindert sterk de zelf-ligatie van één-gedigereerde vector en zo de achtergrond. </li><li> Incubeer de reactiemengsels gedurende 4 uur bij 37 ° C, daarna zuiveren van de gedigereerde PCR-producten en de vector met een commerciële PCR zuivering kit. </li></ol></li><li> Ligation <ol><li> Stel de reactie voor ligatie in PCR buizen inclusief 2 gl 10 x T4 DNA ligase buffer, 10 ng TK-Luc vector, 50 ng insert (gedigesteerd PCR product), 1 pl T4 DNA ligase (400 U / pl) en nuclease-vrij water tot 20 pl. OPMERKING: Bereid een negatieve controle waar de reactie niet insert bevat. </li><li> Meng de reactie door en neer te pipetteren, het afsluiten kort de PCR buisjes u mini-centrifuge en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 10 min. </li><li> Warmte geïnactiveerd bij 65 ° C gedurende 10 min vervolgens koelen op ijs en gebruik 5 ul van het product voor omzetting in 50 pi competente cellen (bijvoorbeeld DH5a). </li><li> Gebruik standaard heat shock procedure om bacteriën te transformeren, pick-up koloniën en isoleren van plasmide-DNA met een commerciële kit. Valideer alle constructen door sequencing voor de volgende stappen. </li></ol></li><li> Transfectie van ES cellen <ol><li> Met 48-well platen. Voeg 200 ul 0,1% gelatine solution / putje 30 min voor cel plating. </li><li> Plaat embryonale stam (ES) cellen een dag voor transfectie. Gebruik voedingsvrije ES-cellen en plaat bij een dichtheid van 3 x 10 4 cellen per putje in 250 ul ES medium / putje. </li><li> Bereid het plasmide mixen (elke mix wordt berekend voor 8 putten, 4 onbehandelde en 4 retinoïnezuur-zuur behandelde) Meng 1:. 1250 ng TK-Luc Empty (negatieve controle), 950 ng β-galactosidase coderende vector (PGal), Mix 2 : 1250 ng TK-Luc Hoxa1 enhancer (positieve controle), 950 ng pGal, Mix 3: 1250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (region of interest), 950 ng pGal. LET OP: ES-cellen drukken de gewenste transcriptiefactoren (RAR / RXR). Laat putten ongetransfecteerde om basiswaarden later vast te stellen tijdens de luciferase en β-galactosidase metingen. </li><li> Voeg transfectie kwaliteit gereduceerd serum media om elk plasmide te mengen tot 106 ui totaal volume (genoeg voor 8 putten). </li><li> Voeg 4,5 ul ES kwaliteit transfecterenion reagens vervolgens zorgvuldig meng door pipetteren 15 keer op en neer. Incubeer de transfectie mix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 13 ul van de transfectie mix aan de cellen per well, meng door pipetteren. Plaats de cellen terug in de incubator (37 ° C) O / N ligand voor behandeling. </li><li> Verwijder media zorgvuldig door aspiratie uit cellen en voeg 250 ul vers medium / putje met 0,01-1 uM all-trans retinoïnezuur (RA) als uiteindelijke concentratie of DMSO als vehikel. Incubeer cellen voor 24 - 48 uur. OPMERKING: Retinoïnezuur is lichtgevoelig. </li></ol></li><li> Bereiding van cellysaten <ol><li> Verdun 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M dithiothreitol (DTT) (in H 2 O), 10 ml 0,1 M EDTA pH 8,0, 50 ml glycerol, 5 ml Triton X-100, steriel water tot 100 ml) tot 1x gebruik steriel water, voeg 20 pl 1 M DTT / 10 ml en equilibreren tot kamertemperatuur vóór gebruik. Bereid 10 ml van een 48-well plaat op de dag van de assay. </li&gt; <li> Verwijder media zorgvuldig door aspiratie uit cellen. Spoel cellen eenmaal met 1x PBS. Voeg 200 ul lysisbuffer 1x / putje direct aan de cellen. </li><li> Schud gedurende 2 uur bij KT (chemische lysis). Bevries de cellysaten op de plaat bij -80 ° C (mechanische lysis). Lysaten kunnen enkele dagen bewaard bij -80 ° C. </li><li> Ontdooi de lysaten. Na volledige ontdooiing overdracht cellysaten een 96-wells plaat met een elektronische multichannel pipet. Overdracht 80 ul van het cellysaat met 96 putjes duidelijke dienblad β-galactosidase assay en 40 pl van het cellysaat een witte plaat op luciferase meting. Vermijd de vorming van eventuele luchtbellen. </li></ol></li><li> β-galactosidase Assay OPMERKING: beta galactosidase of alternatieve tweede reporters worden gebruikt als een interne controle om rekening niet-specifieke experimentele variaties. <ol><li> Bereid β-galactosidase substraat buffer: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g KCI, 1,0 g MgSO4 • 7H 2 O, vul aan tot 1000 ml met steriel water. Pas de pH tot 7,4. Filter Sterilize (0,2 micron) en bewaar bij 4 ° C </li><li> Meng 1 ml β-galactosidase substraat buffer met 4 mg ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galactosidase). Voeg 3,5 gl 2-Mercaptoethanol (pME) per 1 ml buffer vlak voor gebruik. Voeg 100 ul β-galactosidase substraat buffer 80 pi cellysaat. </li><li> Incubeer de reacties bij 37 ° C totdat een lichtgele kleur ontwikkeld. Lees de absorptie bij OD 420 nm op een bord lezer en export van gegevens. Opmerking: Het is afhankelijk van de transfectie-efficiëntie, meestal niet langer dan 30 min. </li></ol></li><li> luciferase Assay <ol><li> Bereid 50 ml luciferine substraat reagens: 15,1 mg D-luciferine zout, 82,7 mg ATP zout, 185 mg MgSO4 • 7H 2 O, toe te voegen aan 50 ml polypropyleen buis,voeg vervolgens 1,5 ml 1 M HEPES buffer, 48,5 ml ATP gratis water, draaikolk, zorg ervoor dat alle verbindingen op te lossen volledig. Houd 5-10 ml porties bij -80 ° C. </li><li> Warm 5 ml luciferine substraat reagens RT alvorens te beginnen. Pipetteer 100 ul substraat-reagens aan elk putje van de witte plaat met 40 pi van het cellysaat en meet de signaal onmiddellijk met een luminescerende teller machine. </li><li> Verkrijgen activiteiten uit ten minste drie onafhankelijke experimenten in triplo transfecties. </li><li> Bereken eerst de basis genormaliseerde luciferaseactiviteit en base genormaliseerd β-galactosidase waarden voor elk putje door de gemiddelde gemeten waarden voor ongetransfecteerde cellen van elke gemeten waarde. Bereken vervolgens de verhouding van luciferase / β-galactosidase-activiteit. </li></ol></li></ol> 3. Karakterisering van Enhancer RNA LET OP: Een meer directe indicator van de versterker activiteit is ontstaan ​​uit de recente genoom-wide studies die veel korte niet-coderende RNA&#39;s geïdentificeerd, variërend in grootte van 50 tot 2000 nt, die worden getranscribeerd vanaf versterkers en zogenaamde enhancer RNAs (Ernas) 16,25,26 (figuur 4). Erna inductie sterk correleert met de inductie van aangrenzende exon coderende genen. Aldus kan signaalafhankelijke enhancer-activiteit in vivo worden gekwantificeerd door vergelijking Erna productie tussen verschillende omstandigheden door RT-qPCR. <ol><li> Richtlijnen voor Primer Design for Erna detectie door RT-qPCR <ol><li> Selecteer genomische regio&#39;s voor Erna metingen die op zijn minst 1,5-2 kb afstand van geannoteerde transcriptie start sites. OPMERKING: Belangrijk is, een hoog niveau van mRNA-transcriptie over intragene enhancers voorkomen accurate kwantificering van Erna in de sense oriëntatie, antisense Ernas op intragene enhancers zijn detecteerbaar en zijn vergelijkbaar niveau Ernas bij extragene enhancers. </li><li> Als algemene regel, gebruik regio 200 - 1000 bp weerm het midden van de transcriptiefactor bindingsplaats plaats voor primerontwerp hetzij de sense of anti-sense streng (figuur 4 en figuur 6). LET OP: Als GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 of H3K27ac ChIP-seq gegevens beschikbaar zijn van de gewenste soorten en voorwaarden cel kan worden gebruikt voor meer accurate primer design. Ernas getranscribeerd van vermoedelijke enhancer regio&#39;s worden gekenmerkt door een hoge mate van H3K4me1 en ME3. Expressie van Ernas positief correleert met de verrijking van actieve versterker histon mark H3K27ac. </li><li> Ontwerp PCR primers voor fluorescente kleurstof gebaseerde RT-qPCR meting van Ernas door Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Genereer anti-sense sequentie (reverse complement van de sense streng) voor primer design als per: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Steek 200-300 bp van sense of anti-sense sequentie voor primer design. </li></ol></li><li> Meting van Erna transcriptie </strong&gt; <ol><li> Isoleer totaal RNA uit behandelde cellen met commerciële zure fenol / chloroform-extractie gebaseerde Reagens volgens aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Gebruik DNaseI geïsoleerde RNA behandelen vóór gebruik ervan in reverse transcriptiereactie. DNase inactiveren volgens de aanbevelingen van de fabrikant voorafgaand aan omgekeerde transcriptie. </li><li> Meet RNA-concentratie na DNase I behandeling en gebruik 1000 ng per RT-reactie. Gebruik van hoge kwaliteit reverse transcriptase. OPMERKING: talrijke Ernas niet worden gepolyadenyleerde, reverse transcriptie vereist het gebruik van willekeurige primers. </li><li> Detecteren reverse getranscribeerd Erna door RT-qPCR met behulp van standaard procedure. Meet een niet-behandeling-afhankelijke mRNA voor normalisatie (bijv, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+enhancers%3A+new+insights+into+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distal enhancers: new insights into heart development and disease.</a> Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+welcome+to+the+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: welcome to the new frontier.</a> Nature methods. 4, 613-614 (2007).</li>
<li>Muller, F., Tora, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+DNA+sequences+in+defining+promoters+for+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation.</a> Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).</li>
<li>Ounzain, S., Pedrazzini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+enhancer-associated+long+noncoding+RNAs+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration.</a> Trends Cardiovasc Med. , (2015).</li>
<li>Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+and+regulated+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs.</a> Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-based+identification+of+mammalian+enhancers+using+site-specific+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration.</a> Nature methods. 11, 566-571 (2014).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
<li>Vermunt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+coregulated+enhancer+networks+in+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports+9%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain.</a> Cell reports 9. , 767-779 (2014).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Mahony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-dependent+dynamics+of+retinoic+acid+receptor+binding+during+early+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis.</a> Genome Biol. 12 (R2), (2011).</li>
<li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38, 576-589 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Daniel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+enhancer+network+operated+by+liganded+RXR+supports+angiogenic+activity+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages.</a> Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+enhancer+transcription+and+activity+from+chromatin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications.</a> Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 311-318 (2007).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470, 279-283 (2010).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+DNA-binding+and+transcriptional+activation+functions+in+the+human+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor.</a> Cell. 49, 39-46 (1987).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de afgelopen jaren hebben vorderingen in de sequencingtechnologie het mogelijk gemaakt om grootschalige voorspellingen van enhancers in vele celtypen en weefsels te doen 7-9. De hierboven beschreven workflow stelt iemand in staat om een primaire karakterisering uit te voeren van kandidaat-enhancers die zijn gekozen op basis van ChIP-seq-gegevens. De gedetailleerde stappen en opmerkingen zullen iedereen helpen om een routinematige enhancervalidatie in het laboratorium op te zetten.
<p class='jove_content...

De ontwikkeling van een meercellig organisme vereist een nauwkeurig gereguleerde expressie van duizenden genen in ontwikkelende weefsels. Regulatie van genexpressie wordt grotendeels bereikt door enhancers. Enhancers zijn korte niet-coderende DNA-elementen die kunnen worden gebonden met transcriptiefactoren (TF's) en op afstand kunnen werken om de transcriptie van een doelgen te activeren1. Enhancers zijn over het algemeen cis-werkend en worden het meest frequent gevonden net stroomopwaarts van de transcriptiestartplaats (TSS), maar recente studies beschreven ook voorbeelden waarbij enhancers veel verder stroomopwaarts werden gevonden, op de 3' van het gen of zelfs binnen de introns en exons2.
Er zijn honderdduizenden potentiële enhancers in de genomen van gewervelde dieren1. Recente methoden gebaseerd op chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) leveren high-throughput data van het hele genoom die kunnen worden gebruikt voor enhanceranalyse3-9. Hoewel gegevens verkregen door ChIP-seq-experimenten de kans om cel- en weefselspecifieke enhancers te identificeren aanzienlijk verhogen, is het belangrijk om in gedachten te houden dat gedetecteerde bindingsplaatsen niet noodzakelijk directe DNA-binding en/of functionele enhancers identificeren. Daarom is verdere functionele analyse van nieuw geïdentificeerde enhancers onmisbaar. In dit werk presenteren we een eenvoudig drie-stappen proces voor identificatie en validatie van putatieve actieve enhancers. Dit omvat: 1) selectie van putatieve transcriptiefactor-bindingsplaatsen door bioinformatica-analyse van ChIP-seq-gegevens, 2) klonen en validatie van deze regulatorische sequenties in reporter-constructen, en 3) meting van enhancer RNA (eRNA).
Blootstelling van embryonale stamcellen (ES) aan retinoïnezuur (RA) wordt vaak gebruikt om neurale differentiatie van de pluripotente cellen te bevorderen 10. RA oefent zijn effecten uit door te binden aan RA-receptoren (RARα, β, γ) en retinoïde X-receptoren (RXRα, β, γ). RAR's en RXR's in de vorm van een heterodimeer binden aan DNA-motieven die RA-responselementen worden genoemd, die doorgaans zijn gerangschikt als directe herhalingen van de AGGTCA-sequentie (genoemd als halfsite) en reguleren transcriptie. Ligand-behandelingsexperimenten maakten de identificatie mogelijk van verschillende door retinoïnezuur gereguleerde genen in ES-cellen 11,12. Echter, enhancer-elementen voor veel van deze genen zijn nog niet beschreven. Om te demonstreren hoe het hier beschreven workflow kan worden gebruikt voor enhancer-identificatie en -validatie, laten we stap-voor-stap de selectie en karakterisering zien van twee retinoïnezuur-afhankelijke enhancers in embryonale stamcellen.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA polymerase</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>voor PCR-amplificatie van enhancer uit gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>voor isolatie van genomisch DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>voor zuivering van PCR-product</td></tr><tr><td>Gel extraction kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>voor gelextractie als er meer PCR-producten zijn</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>restrictie-enzym</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>restrictie-enzym</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>vrijlating van 5'- en 3'-fosfaatgroepen van DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>voor ligatie</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>voor plasmide-isolatie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES-medium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES-medium</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acid</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES-medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES-medium</td></tr><tr><td>Beta Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES-medium</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>transfectie reagens</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>voor transfectie</td></tr><tr><td>All-trans retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>ligand, voor activering van RAR/RXR</td></tr><tr><td>96-well clear plate</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>voor Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>96-well white plate</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>voor Luciferase assay</td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>voor Luciferase assay</td></tr><tr><td>ATP salt</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>voor Luciferase assay</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226;7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>voor Luciferase assay</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>voor Luciferase assay</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226;7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>voor Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226;H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>voor Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226;7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>voor Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>voor Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&beta;-D-galactosidase)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>voor Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA-isolatie</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>omkering van eRNA</td></tr><tr><td>Rnase-free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase-behandeling</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; Real-Time PCR Detection System</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR-machine</td></tr><tr><td>BioTek Synergy 4 microplate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>luminescentieteller</td></tr></tbody></table>

voorspelling en validatie van gene regulatory elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur induced embryonale stamcellen differentiatie

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonale ontwikkeling is een meerstaps proces waarbij activering en onderdrukking van vele genen. Enhancer elementen in het genoom is gekend dat ze weefsel en celtype-specifieke regulatie van genexpressie tijdens de celdifferentiatie. Dus, de identificatie en verder onderzoek is belangrijk om te begrijpen hoe lot van de cel wordt bepaald. Integratie van genexpressie data (bijvoorbeeld microarray of RNA-volgende) en de resultaten van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) gebaseerde genoomwijde studies (ChIP-seq) maakt het mogelijk op grote schaal identificatie van deze regulerende gebieden. Functionele validatie van celtype enhancers vereist verdere in vitro en in vivo experimentele procedures. Hier beschrijven we hoe actief enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd. Dit protocol voorziet in een stap-voor-stap workflow die bestaat uit: 1) de identificatie van regulerende gebieden van Chip-seq data-analyse, 2) het klonen en experimental validatie van putatieve regulerende potentieel van de geïdentificeerde genomische sequenties in een reporter assay, en 3) bepaling van enhancer activiteit in vivo door het meten enhancer RNA transcript niveau. De gepresenteerde protocol is gedetailleerd genoeg om iedereen te helpen bij het opzetten van deze workflow in het lab. Belangrijk, kan het protocol eenvoudig aangepast worden aan en gebruikt in een cellulair modelsysteem.

We gebruikten een pan-specifieke RXR antilichaam om na te gaan genoombrede waarin RA-gereguleerde genen receptor verrijking in hun nabijheid. Bioinformatica analyse van RXR ChIP-seq gegevens van ES-cellen behandeld met retinoïnezuur onthulde verrijking van de nucleaire receptor halve plaats (AGGTCA) onder de RXR bezette plaatsen (Figuur 1). Met behulp van een bio algoritme brachten we weer het motief zoekresultaten helft site om de RXR ChIP-seq data (figuur 2).</...

In dit werk bieden we een experimentele workflow van hoe actieve enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd.

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Het algemene doel van deze video is om een geïntegreerde set methoden te bieden om genomische regulatoire elementen, zogenaamde enhancers, te identificeren en experimenteel te valideren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de transcriptie en regulatie van biologische gebeurtenissen, waaronder de selectie en het gebruik van enhancers tijdens celdifferentiatie of als reactie op externe stimuli. Het belangrijkste voordeel van de gepresenteerde workflow is dat het protocol eenvoudig kan worden aangepast en gebruikt in elk cellulair modelsysteem.Ik zal de stappen van de procedure demonstreren. Kies om te beginnen een kandidaat-enhancer op basis van voorafgaande ChIP-seq-analyse. Gebruik een genoombrowser om de resultaten van het gewenste ChIP-seq-experiment te bekijken en identificeer bindingsplaatsen in de nabijheid van het gen van belang.Kies Define a Region of Interest om een sequentie van 200-400 baseparen van de geselecteerde genomische regio te verkrijgen, en gebruik de sequenties voor het daaropvolgende primerontwerp. Amplificeer en kloon de geselecteerde genomische regio met standaard moleculaire biologische technieken in een reporterplasmidconstruct

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

The video demonstrates the method to induce stem cell differentiation into neural progenitors using retinoic acid and the hanging drop culture method.

Differentiating Embryoid Body Cells into Neural Progenitors Using Retinoic Acid

This video demonstrates a technique for assessing retinoic acid activity in mouse embryos. Upon isolating cells from the mouse embryos, the cells are co-cultured with retinoic acid (RA) reporter cells. Embryonic cells produce RA, which induces beta-galactosidase expression in reporter cells, indicating RA activity in the embryonic cells.

Employing Reporter Cells in a Co-Culture to Study Retinoic Acid Production by Mouse Embryonic Cells

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Het manipuleren van temporele genexpressie in differentiërende embryonale stamcellen (ESCs) kan worden bereikt met behulp van induceerbare gensystemen. De generatie van deze cellijnen is echter kostbaar en tijdrovend. Dit protocol bereikt snelle expressie van een transgen in differentiërende ES-afgeleide cellen en daaropvolgende analyse van downstream hematopoëtische differentiatie.

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

Methoden om retinoïnezuur (RA) niveaus nauwkeurig te meten in kleine hoeveelheden weefsel bestaan niet. Dit protocol beschrijft de eenvoudige, kwantitatieve meting van relatieve RA-niveaus in E8.5 embryo's en neurosferen met behulp van een RA reporter cel lijn.

Kwantitatieve meting van relatieve retinoïnezuur Levels in E8.5 embryo&#39;s en neurosfeerculturen Met behulp van de F9 RARE-lacZ-Cell gebaseerde Reporter Assay

We beschrijven een werkwijze voor het gebruiken van muriene embryonale stamcellen voor het genereren van twee- of driedimensionaal embryoïde lichamen. Vervolgens hebben we uitgelegd hoe neurale differentiatie van de embryoid lichaamscellen door retinolzuur, en hoe ertoe te bewegen hun staat van differentiatie te analyseren door voorlopercellen cel marker immunofluorescentie en immunoblotting.

Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

De geweekte kraaltest omvat gerichte toediening van testreagens op elk ontwikkelingstijdpunt om de regulatie van celdifferentiatie en morfogenese te bestuderen. Een gedetailleerd protocol, toepasbaar op elk proefdiermodel, voor het bereiden van drie verschillende soorten geweekte kralen en het implanteren hiervan in de interdigit van een kippenembryo wordt gepresenteerd.

Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay

Leer een geïntegreerde workflow voor identificatie en validatie van genomische enhancers in embryonale stamcellen. Deze methode gebruikt ChIP-seq-analyse en reporter-assays om transcriptieregulatie te bestuderen.

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie (Video) | JoVE Journal

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

Meer video's verkennen