Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

Het algemene doel van deze video is om een geïntegreerde reeks methoden te bieden om genomische regulerende elementen, de zogenaamde enhancers, te identificeren en experimenteel te valideren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over transcriptie en regulatie van biologische gebeurtenissen, inclusief enhancer selectie en gebruik, gebruik makend van celdifferentiatie, of in reactie op externe stimuli. Het belangrijkste voordeel van de gepresenteerde workflow is dat een protocol gemakkelijk kan worden aangepast en gebruikt in elk cellulair modelsysteem.

Ik zal de stappen van de procedure demonstreren. Om te beginnen, kies een kandidaat-enhancer op basis van bestaande chip seq-analyse. Gebruik een genoombrowser om de resultaten van de gewenste chip seq-experiment te bekijken en bindingsplaatsen in de nabijheid van het gen van belang te identificeren.

Kies Definieer een gebied van belang om een sequentie van 200-400 basenparen van de geselecteerde genomische regio te verkrijgen, en gebruik de sequenties voor de daaropvolgende primerontwerp. Gebruik standaard moleculaire biologietechnieken om de geselecteerde genomische regio te versterken en klonen in een reporterplasmide-constructie. Om de enhanceractiviteit te testen, transfecteer de reporterconstructies in massale embryonale stamcellen door eerst 200 microliter 0,1% gelatine-oplossing per putje toe te voegen aan 48-well platen.

Incubeer de platen gedurende 30 minuten voor het plateren. De dag voor de transfectie, plateer feeder-vrije embryonale stamcellen of ES-cellen, in 250 microliter ES-medium met een dichtheid van drie keer 10 tot de vierde cellen per putje. Op de dag van de transfectie, bereid de plasmide-mixen voor, maak genoeg voor acht putjes van elke mix.

Voeg transfectiekwaliteit verminderd serummedium toe aan elke plasmidemix om het volume op te brengen tot 106 microliter. Voeg vervolgens 4,5 microliter ES-kwaliteit transfectiereagens toe en meng voorzichtig door 15 keer op en neer te pipetteren. Incubeer de transfectiemix gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Na de incubatie, voeg 13 microliter per putje van de transfectiemix toe aan de cellen en meng grondig door te pipetteren. Plaats vervolgens de cellen terug in de incubator voor behandeling met lichen. Transfectie-efficiëntie is een kritieke stap.

Als een ander celtype wordt gebruikt, vereist deze stap optimalisatie. Gebruik het meest relevante celtype om de enhanceractiviteit te testen om de contextafhankelijke effecten te minimaliseren. De volgende dag, verwijder voorzichtig het medium door aspiratie en voeg 250 microliter vers medium per putje toe dat één micromolar all-trans retinoïnezuur bevat, of DMSO als drager.

Incubeer de cellen gedurende 24-48 uur. Nadat de lysisbuffer volgens het tekstprotocol is bereid, zuig het medium voorzichtig van de cellen. Gebruik 1X PBS om de cellen eenmaal te spoelen, voeg vervolgens 200 microliter 1X lysisbuffer per putje toe.

Schud de cellen twee uur bij kamertemperatuur. Bevriest vervolgens de cellysaat in de plaat bij 80 graden Celsius voor volledige cellyse. Nadat de lysaat volledig is ontdooid, gebruik een elektronische multi-kanaals pipetter om 80 microliter van de cellysaat over te brengen naar een 96-well doorzichtige plaat voor de beta-galactosidase en 40 microliter van de lysate naar een witte plaat voor luciferase meting.

Om de beta-galactosidase uit te voeren, meng een milliliter van de beta-gal substraatbuffer met vier milligram OMPG. Voeg vervolgens 3,5 microliter beta-mercaptoethanol toe aan het mengsel en voeg onmiddellijk 100 microliter van de buffer toe aan de 80 microliter cellysaat. Incubeer de reacties bij 37 graden Celsius totdat de zwakke gele kleur zich ontwikkelt.

Lees de absorptie bij 420 nanometer op een platelezer en exporteer de gegevens. Om de luciferase-assay uit te voeren, na het bereiden van het substraatreagens volgens het tekstprotocol, verwarm het luciferase substraatreagens tot kamertemperatuur voordat u begint. Pipet vervolgens 100 microliter in elk putje van de witte plaat met de 40 microliter cellysaat.

Gebruik onmiddellijk een luminescente tellermachine om het signaal te meten. Verkrijg de activiteiten uit ten minste drie onafhankelijke transfecties en experimenten. Voer berekeningen uit voor beide assays volgens het tekstprotocol.

Om de primers te ontwerpen voor eRNA-detectie door RTCPR, selecteer een genomische regio die ten minste 1,5 tot twee kilobasen verwijderd is van enig geannoteerd gentranscript. Identificeer de relatieve richting van het gen en bepaal de positie van de sense en anti-sense transcripten. Om primers te ontwerpen voor de enhancer RNA kwantificering, kies regio's 200-1.000 basenparen vanaf het centrum van de transcriptiefactorbindingsplaats.

Als het gen zich op de minuusstreng bevindt, kopieer 200-300 basenparen van de positieve streng en converteer de sequentie om de reverse complement sequentie te verkrijgen. Gebruik vervolgens deze sequentie voor de daaropvolgende primerontwerp. Stel de productgroottebereik tussen 80-150 basenparen.

Om eRNA-transcriptie te meten, na het isoleren van totaal RNA van behandelde cellen volgens het tekstprotocol, detecteer omgekeerd getranskribeerd eRNA door RTCPR met behulp van een standaardprocedure. Meet een niet-behandelingsafhankelijk mRNA voor normalisatie. Zoals hier getoond, heeft bioinformatica-analyse van RXR chip seq-gegevens verkregen uit ES-cellen behandeld met retinoïnezuur de verrijking van de nucleaire receptor half-site onder de RXR bezette plaatsen onthuld.

Met behulp van een bioinformatica-algoritme werden de motiefzoekresultaten voor de half-site teruggeplaatst op de RXR chip seq-gegevens. Deze analyse identificeerde chip-pieken die overlapten met canonieke nucleaire receptorbindingsplaatsen. Visualisatie van de plaatsen in IGV gaf aan dat er verrijking was van de transcriptiefactoren dicht bij Hoxa1.

Een eerder gekarakteriseerd RAR RXR-doel. Een straffen enhancer voor een nieuwe RA-doelketen, PRMT8, werd ook geïdentificeerd. De geïdentificeerde enhancerregio's werden gekloond in TK luciferase reporter vector en ES-cellen werden getransfecteerd met deze constructen.

Luciferase-activiteit werd gemeten in afwezigheid en aan