Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

Het algemene doel van dit protocol is om de cardiomyocyte-omzet te kwantificeren met behulp van langetermijnnucleosidelabeling en flowcytometrie om de nieuwe cardiomyocyte-kernen te kwantificeren, terwijl rekening wordt gehouden met de polyploidisatie van de kernen. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen op het gebied van cardiomyocyteregeneratie te beantwoorden en kan worden gebruikt als een screeningstool om veranderingen in de dynamica van cardiomyocytegeneratie te kwantificeren. Het grote voordeel van dit protocol is dat het een gevoelige en nauwkeurige kwantificering van de generatie van nieuwe cardiomyocyten mogelijk maakt, ongeacht de cellulaire bron en het controleren van polyploidisatie.

24 uur na de zesde EdU-injectie, plaats het behandelde dier in de rugligging en gebruik chirurgische schaar om een huidschilfer van de middelste buik tot aan het diafragma te maken. Vervolgens het borstbeen bilateraal van de lichaamsholte houden en het diafragma doorknippen om het hart bloot te leggen. Til vervolgens het hart lichtjes op en snijd de grote bloedvaten van de uitstroombaan door om het hart uit de borstholte te verwijderen.

Onmiddellijk na het oogsten, plaats de harten in individuele 15 mL centrifugebuizen die 10 mL PBS bevatten dat tot vier graden Celsius is gekoeld. Breng vervolgens de monsters over naar afzonderlijke 10 cm petrischalen en gebruik een scalpel om elk hart in een sagittale oriëntatie in twee stukken te snijden. Knijp vervolgens voorzichtig de hartstukken met een tang.

Verwijder beide hartstukken en plaats ze in een petrischaal met 20 mL vers PBS. Herhaal dit nogmaals met een nieuwe petrischaal en 20 mL vers PBS. Plaats beide delen van de harten in dezelfde 1,5 mL microcentrifugebuis en maak met een 25 gauge naald een klein gaatje in de dop van elke buis om te voorkomen dat de dop opengaat wanneer het hart is verwerkt.

Label vervolgens elke buis en bevries de hartweefsels in een vat met vloeibare stikstof. Voor elk hart dat moet worden geanalyseerd, incubeer 36 mL van een procent BSA en PBS in een ultracentrifugebuis. Gooi de oplossing weg na 30 minuten.

Wanneer de buizen zijn opgedroogd, voeg 10 mL sucrosegradiëntoplossing toe aan elke buis. Na het afzonderlijk hakken van de in vloeibare stikstof bevroren hartmonsters met de scalpel, breng de weefselfragmenten van elk hart over in afzonderlijke 50 mL kegelbuizen die 15 mL cellysebuffer bevatten. Homogeniseer de monsters gedurende 15 seconden bij 25.000 rpm met een sonde-homogenisator bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 15 mL meer lysebuffer toe aan elke buis en breng de monsters één voor één over naar een 40 mL dounce met een groot opruimvat. Voer 10 slagen uit met de stamper en filter de celslurries door een 100 micron zeef gevolgd door een 40 micron celzeef in afzonderlijke 50 mL centrifugebuizen. Verzamel vervolgens de nucleaire hartpellets door centrifugatie en suspendeer de cellen in 25 mL sucrosegradiëntoplossing elk.

Leg de cellen op de nucleairvrije sucrosegradiënt in de voorbereide ultracentrifugebuizen en centrifugeer de lagen met behulp van een swing out buisrotor. Na de centrifugatie resuspendeer de nucleairdeeltjes in 1.300 microliters nuclei opslagoplossing en breng de nucleairdeeltjes over naar een 1,5 mL microcentrifugebuis gelabeld PCM1. Breng 300 microliters van elke suspensie van de PCM1 buizen over naar een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 700 microliters verse nucleair opslagoplossing toe en label ISO controle.

Label vervolgens de PCM1 nucleairdeeltjes met anti-PCM1 antilichaam en de ISO controle nucleairdeeltjes met snel IGG isotype controle antilichaam gedurende de nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag centrifugeer de monsters en suspendeer de pellets in één mL verse nucleair opslagoplossing voor een tweede centrifugatie onder dezelfde omstandigheden. Na de tweede centrifugatie suspendeer de pellets in één mL verse nucleair opslagoplossing en incubeer de nucleairdeeltjes met één microliter van een fitzy geconjugeerd F(ab'2 fragment van een geit anti-rabiës IGG antilichaam gedurende één uur bij vier graden Celsius in het donker.

Om de mate van EdU-incorporatie te evalueren, centrifugeer de PCM1 en ISO controle gelabelde nucleairdeeltjes suspensies en suspendeer de pellets in één mL van 1%BSA PBS twee keer gedurende twee opeenvolgende wasbeurten. Na de tweede wassing, vervang het supernatant met 100 microliters van EdU fixatief en incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de fixatie was de nucleairdeeltjes nogmaals twee keer in één mL van PBS BSA en incubeer de monsters met 100 microliters van saponine gebaseerde permeabilisatie oplossing bij kamertemperatuur.

Na 15 minuten, voeg 500 microliters vers bereide EdU labelcocktail toe aan elke buis voor een 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de monsters drie keer en was de nucleairdeeltjes in één mL van PBS BSA gedurende de tweede twee centrifugaties. Label tenslotte de monsters met 400 microliters DNA-kleuringsoplossing.

Immunohistochemische analyse van de gepulseerde harten toont de aanwezigheid van PCM1-uitdrukkende cardiomyocyten die EdU hebben opgenomen. Echter, de gegevens verkregen met behulp van immunohistochemische methoden kunnen verkeerd worden geïnterpreteerd omdat andere celtypen die EdU hebben opgenomen, kunnen worden verkeerd geïdentificeerd als cardiomyocyten. In een studie van mdx en controle muizen, maakt de flowcytometrie-analyse die in dit protocol is beschreven, een snelle kwantificering mogelijk van de nucleaire generatie van nieuwe cardiomyocyten, terwijl ook de cellen worden uitgesloten die EdU hebben opgenomen tot depolyploidisatie.

Net als eerder gepubliceerde gegevens, werd in dit representatieve experiment een toename in de snelheid van generatie van nucleaire nieuwe cardiomyocyten in de harten van mdx muizen waargenomen in vergelijking met leeftijdsgematchte controles. Eenmaal beheerst kan deze techniek in vier uur over de loop van twee dagen worden voltooid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zowel de EdU als de PCM1 negatieve controles te onthouden, zodat de poorten nauwkeur