Foerageren Path-length Protocol Drosophila melanogaster Larven

Het algemene doel van deze assay is om de locomotieve component van het gedrag van Drosophila-larven te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van gedragsgenetica over genetische en omgevingsbijdragen aan individuele verschillen in het gedrag van larven. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het snel, reproduceerbaar is en toelaat om grote steekproeven te verzamelen.

Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het succes van de assay afhankelijk is van de ontwikkelingstiming en de consistente, zorgvuldige omgang met de proefdieren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ina Anreiter en Oscar Vasquez, afgestudeerde studenten in mijn lab. Bereid de houdfles voor door gaten te snijden in een kant van een plastic vliegcultuurfles van zes ounce.

Gebruik vervolgens een spuit om petrischaaldeksels te vullen met eerder bereid druivensapmedium tot het oppervlak van het druivensapmedium een koepel boven de rand van het deksel vormt. Bewaar de druivenplaten in een vochtige en luchtdichte container op vier graden Celsius gedurende maximaal twee weken. Giet 40 milliliter eerder bereid vliegvoer in 100 bij 15 millimeter petrischalen.

Verkrijg drie zwarte Plexiglas platen met tien ronde putjes van tien centimeter in diameter, gerangschikt in een twee bij vijf ontwerp om de larven te testen, en een zwarte Plexiglas verspreider om de gistpasta op de Plexiglas platen te verspreiden. Scheid vervolgens de deksels van de onderkanten van de petrischalen. Verzamel 100 tot 150 vrouwtjes en 50 tot 75 mannetjes.

Laat vrouwtjes en mannetjes een nacht lang paren in een vliegcultuurfles van zes ounce met standaard vliegvoer. Breng de vliegen over naar een houdfles en gebruik plakband om een druivenplaat met een kleine hoeveelheid verse gistpasta over de bovenkant van de fles te bevestigen. Laat de fles ondersteboven staan met de druivenplaat op de bodem om volwassenen toe te laten eieren te leggen op de druivenplaat.

Gooi de eerste druivenplaat weg na 24 uur en plaats een nieuwe druivenplaat in de houdfles. Verwijder na 22 uur de druivenplaten uit de flessen en plaats ze in een 60 bij 15 millimeter petrischaal. Plaats vervolgens een nieuwe druivenplaat met verse gistpasta op de houdfles.

Verwijder en gooi alle larven van de geïncubeerde druivenplaat weg met behulp van een dissectieprobleem. Incubeer de vrijgemaakte druivenplaten gedurende vier uur onder standaard omstandigheden. Kies na vier uur 100 L1, of eerste stadium larven, per stam van de druivenplaten en plaats ze op de voedselplaten.

Plaats de larven voorzichtig op het voedsel, zonder het voedsel te doorboren en zonder de larven te begraven. Groepen van tien larven kunnen tegelijkertijd worden opgepikt en geplaatst. Voorkom overbevolking door de larven over de voedselplaat te verdelen.

Incubeer de voedselplaten totdat de proefdieren tien uur voor het begin van het zwerven zijn, wanneer larven het voedsel verlaten op zoek naar een popplaats. Als de larven zijn begonnen te zwerven en zich op de rand van de petrischaal bewegen, zoals u hier kunt zien, zijn de dieren te oud om te testen en moet hun ontwikkelingstijd opnieuw worden beoordeeld. Los gist op in water in een verhouding van één op twee.

Zorg ervoor dat de afgewerkte pasta druppelt en linten op het oppervlak van de pasta achterlaat die snel smelten. Het evalueren van de juiste consistentie van de gistpasta is belangrijker dan het gebruik van de exacte verhouding vanwege de variabiliteit tussen merken, batches gist en de omgeving. Gebruik een penseel om de larven voorzichtig uit de voedselplaat van de eerste stam te plukken.

Verzamel larven in een petrischaal en was de larven voorzichtig met water om al het voedsel te verwijderen. Was de larven snel met twee milliliter water en demp de larven voorzichtig droog met een laboratoriumdoekje. Houd de larven in een vochtige omgeving maar niet ondergedompeld in water om stress te voorkomen.

Plaats drie testplaten naast elkaar en stel een vijf minuten timer in voor elke testplaat. Breng gistpasta aan op de bovenkant van de testplaten en gebruik de verspreider om een dunne laag gistpasta op elke testplaat te verspreiden, zodat alle putjes een gelijkmatige laag gist hebben. Plaats voorzichtig één larve in het midden van elke put.

Start de vijf minuten timer onmiddellijk nadat de eerste larven op elke plaat zijn geplaatst. Plaats vervolgens de rest van de larven in de overgebleven putjes. Plaats een petrischaaldeksel op elke put.

Wanneer de timer is afgelopen, begin met het traceren van de padlengtes die in de gist zijn achtergelaten met een permanente markering zonder de larven van de plaat te verwijderen. Traceer padlengtes in dezelfde volgorde en snelheid als de larven op de platen werden geplaatst. Herhaal ten slotte de larvale padlengtestappen voor elke stam.

Gegevens verzameld over drie opeenvolgende dagen van testen toonden een significant stameffect, waarbij rovers verder reisden dan zitters. Naast het stameffect hadden larven die vier uur voorafgaand aan de test voedselloos waren aanzienlijk lagere padlengtes dan gevoerde larven. Over het algemeen waren padlengtes langer wanneer beide stammen werden grootgebracht op voedsel met een hoog voedingsgehalte in vergelijking met voedsel met een laag voedingsgehalte.

Indien correct uitgevoerd, staat deze assay een enkele persoon toe om gemakkelijk tot 500 larven in vier uur te testen, wat het waardevol maakt voor grootschalige fenotypering. Volgend op de procedure die we zojuist hebben getoond, kunnen andere variabelen zoals geslacht, voedselgebrek of voedselkwaliteit worden getest om het effect van die variabelen op voedselgerelateerde bewegingspatronen te tonen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Drosophila-larven voedselgerelateerde locomotie meet voor de beoordeling van de genetische en omgevingsbijdragen aan individuele verschillen in gedrag.