Name: Foerageren Path-length Protocol Drosophila melanogaster Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer het foerageren path-length protocol voor Drosophila melanogaster larven om locomotiegedrag te kwantificeren. Deze methode meet genetische en omgevingsinvloeden op voedingsgerelateerde beweging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de voortgezette financiering door de Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) aan MBS.

1. Bereid Grape Platen en Holding Flessen voor verzamelen van Larven <ol><li> Om die flessen te maken, knippen gaten in de ene kant van 6 oz fly cultuur flessen, groot genoeg om een vlieg flacon stekker voor luchttoevoer passen (Fig. 1D). </li><li> Om druif platen te maken, voor te bereiden 250 ml van druivensap medium (1,8% agar, 45% druivensap, 2,5% azijnzuur, 2,5% ethanol) door het koken van de agar, druivensap en het grootste deel van het water, afkoelen tot 70 ºC ( roer tijdens het afkoelen), voeg dan azijnzuur en ethanol en aan tot de streep met water. </li><li> Gebruik een spuit (zonder naald) tot 35 x 10 mm petrischaal deksels te vullen tot het oppervlak van het druivensap medium maakt een koepel boven de lip van het deksel (afb. 1A). </li><li> WINKEL druif platen in een vochtige en luchtdichte houder bij 4 ° C tot gebruik (tot maximaal 2 weken). </li></ol> 2. bereiding van voedsel Plates <ol><li> Bereid standaard vlieg voedsel recept. Opmerking: Om test opfokvoeder kwaliteit effecten op de weglengte gebruikten we lage voedingsstof vlieg voedsel: 10% sucrose, 1,3% agar, 0,8% kaliumnatriumtartraat, 0,1% monokaliumfosfaat, 0,05% natriumchloride, 0,05% calciumchloride, 0,05% magnesiumchloride, 0,05% ijzersulfaat, 5% gist en 0,5% propionzuur in water; en hoge nutriënten vlieg voedsel: 1,5% sucrose, 1,4% agar, 3% glucose, 1,5% maïsmeel, 1% tarwekiemen, 1% sojameel, 3% melasse, 3,5% gist, 0,5% propionzuur, 0,2% Tegosept en 1 % ethanol in water. Voor zowel voedingsmiddelen Autoclaveer de oplossing en laat afkoelen tot 50 o C voor het toevoegen van het propionzuur, Tegosept en ethanol. </li><li> Giet 40 ml vlieg voedsel in 100 x 15mm Petri gerechten. </li><li> Bewaar voedsel platen in een vochtige en luchtdichte container bij 4 ° C tot gebruik (tot een maximum van 2 weken). </li></ol> 3. Bereid Test Plates <ol><li> Bereid 58 x 25 cm, 6 mm dikke zwarte plexiglas platen met 10, 1 mm diepe ronde putjes, 10 cm in diameter en aangebracht in een 2 x 5 design (Fig. 1C) larven testen. Nb: Tot 30 larven kunnen worden getest om tegelijkertijd 3 of meer van bovenstaande plexiglas platen zijn. Als alternatief kunnen larven worden getest in petrischalen, 10 cm in diameter. Deze optie is veel omslachtiger en maakt lagere aantallen larven te testen. </li><li> Het verkrijgen van een zwarte 39 x 8 cm, 6 mm dik plexiglas verspreider voor het verspreiden van de gist pasta op het plexiglas testplaten. </li><li> Bereid 100 x 15 mm petrischaal deksels voor het opnemen van larvale pad-lengtes door het scheiden van deksels van de bodems van tevoren. </li></ol> 4. Het opzetten van Parental Populaties <ol><li> Houd het grootbrengen voorwaarden constant gedurende de gehele test (bijvoorbeeld 25 ° C, 60% vochtigheid en een 12:12 licht: donker cyclus op standaard vlieg voedsel). </li><li> Raise ouderlijke bevolking in dezelfde kweekomstandigheden. </li><li> Verzamel 100-150 vrouwen en 50 - 75 mannen en ze rijpen 5 ± 1 dagen voor een optimale vruchtbaarheid. </li><li> laat females en mannetjes paren &#39;s nachts in een 6 oz fly cultuur fles met standaard vlieg voedsel. </li><li> Transfer vliegt in een bedrijf fles en zet een druif plaat (een kleine hoeveelheid verse gist pasta op de druif plaat zal bevorderen eierleggende; fig. 1B) over de top met plakband (afb. 1E). </li><li> Laat flessen stond op zijn kop (Fig. 1F), met de druif plaat aan de onderkant te laten volwassenen om eieren te leggen op de druif plaat. </li><li> Gooi de eerste druif plaat na 24 uur en plaats een nieuwe druif plaat op het bedrijf fles. Dit zal de druif plaat waaruit larven de volgende dag worden verzameld zijn. Opmerking: Grape platen zullen moeten worden vrijgesproken van larven 22 uur na opgezet, opgezet borden zodat ze begin volgende dag kan worden gewist (bijv., Het opzetten van plaat bij 12:00 en duidelijk om 10 uur de volgende dag). Het is raadzaam om de eerste druif plaat Negeren om niet-eieren die vrouwen kunnen zijn roerende en tha voorkoment kan worden voortbewogen in ontwikkeling. </li></ol> 5. Verzamel L1 (Eerste Instar) Larven van Grape Plates <ol><li> Verwijder druif platen uit flessen 22 uur nadat ze werden opgericht en plaats in een 60 x 15 mm petrischaal. </li><li> Plaats een nieuwe druif plaat met verse gist plakken op het bedrijf fles. </li><li> Duidelijke en gooi alle larven van de geënte druif plaat met behulp van een dissectie sonde. </li><li> Incubate ontruimd druif platen voor 4 uur in normale omstandigheden. </li><li> Na 4 uur, pick-100 L1 larven per soort uit de druif borden en leg op voedsel borden. <ol><li> Plaats larven op het voedsel voorzichtig (zonder perforeren het eten en het begraven van de larven) en verdringing te voorkomen door het verspreiden van de larven in de voedselverwerkende industrie plaat. </li></ol></li><li> Incubate voedsel platen tot proefdieren zijn ongeveer 10 uur voor de start van zwerven. Opmerking: Bij 25 ºC, 10 uur voor het algemeen zwerven komt overeen met 72-96 uur na het uitkomen. de exact hoeveelheid incubatietijd dient te worden vastgesteld vóór het begin van het experiment door het verzamelen van een eerste reeks van larven voor elke stam en het registreren van het aantal uren tot de start van het zwerven (dwalen larven zal verhuizen van het voedsel op de zijkanten en het deksel van het voedsel platen). Opmerking: Indien nodig, kan dezelfde ouders worden gebruikt om larven 3 verzamelen - 4 dagen van het testen door het herhalen van stappen 4,7-5,5. De volgorde waarin stammen worden opgezet en getest in dagen een testorde effect op weglengte voorkomen. Test dezelfde &quot;control&quot; stam / stammen elke dag van het testen om te controleren voor de dag effecten. </li><li> Als veel stammen worden getest, spreiden de opzet en ophaaltijden van de larven mogelijk maken het testen van elke stam op het juiste tijdstip later. </li></ol> 6. Larvale Path-length Test <ol><li> Ontbinden droge-actieve bakkersgist in water bij een 1: 2 verhouding (gewicht naar volume). De afgewerkte gistpasta moet dunner zijn dan pancake beslag, zodanig dat bij het optillen van een lepel uit de pasta, het druppelt en achterlaat linten op het oppervlak van de pasta die snel wegsmelten. Opmerking: De consistentie van de gistpasta is belangrijk en moet constant gedurende het experiment. De exacte gist: water verhouding zou moeten worden aangepast afhankelijk van het merk en batch gist. </li><li> Voorzichtig plukken larven van de eerste stam te testen uit het voedsel plaat met behulp van een kwast. </li><li> Verzamel larven in een petrischaal en voorzichtig te wassen met water om al het voedsel te verwijderen. <ol><li> Snel wassen larven met 1-2 ml water en voorzichtig deppen larven droog met een laboratorium af te vegen om te vermijden dat er geen water bij het plaatsen van de larven op de test plaat. Om stress te vermijden, houden larven vochtig maar niet ondergedompeld in water. </li></ol></li><li> Schik drie testplaten naast elkaar en ligt op 5 minuten timer voor elke test plaat. </li><li> Toepassen gistpasta naar de top van de testplaten en met de spreider, een dunne layer gist pasta op elke testplaat zodat alle putjes een gelijkmatige laag van gist. </li><li> Plaats voorzichtig een larve in het midden van elk putje starten van de timer 5 min na het plaatsen van de eerste larven op elke plaat. Opmerking: Drie platen kan tegelijk, waardoor een steekproefomvang van 30 / stam / testdag, tot een totaal van 500 larven. </li><li> Plaats een petrischaal deksel bovenop elk putje. </li><li> Wanneer de timer afloopt, zonder het verwijderen van de larven van de plaat, start het opsporen van de pad-lengtes achtergelaten in de gist met behulp van een permanent marker. Trace pad-lengte in dezelfde volgorde als larven werden op de testplaten. <ol><li> Voer traceren op dezelfde snelheid als larven op de platen werden geplaatst. Voor de consistentie in latere data-analyse, maken gebruik van dezelfde marker voor alle pad-lengtes. Permanent marker is aan te bevelen. </li></ol></li><li> Herhaal de stappen 6.2 tot 6.8.1 voor elke stam te testen. Pick elke stam uit het voedsel dat onmiddellijk voor het testen om de honger effecten op pa voorkomenth-length. </li></ol> 7. Levensmiddelen beroving <ol><li> Als larven zijn voedsel verstoken van de proef, verzamelen larven zoals beschreven in stap 6,2-6,3, maar de gewenste hoeveelheid voedselontbering tijd eerder (bijv., Wanneer larven worden waaraan voedsel is onthouden gedurende 4 uur, verzamel larven 4 uur voor testtijd). </li><li> Verdeel gewassen larven in twee groepen en plaats het voedsel verstoken groep in een 60 x 15 mm petrischaal met 5 ml 1% agar en de controlegroep in een petrischaal met 5 ml standaard eten. </li><li> Plaats een gewicht boven op het omgekeerde deksel van de petrischalen (anders larven kunnen kruipen bij het zoeken naar voedsel). </li><li> Incubeer de eerder vastgestelde voedsel ontbering periode en ga verder met het testen zoals beschreven in de stappen 6,2-6,9. </li><li> Als veel stammen worden getest, wankelen de voedselontbering starttijden om voor het testen van elke stam op het juiste tijdstip. </li></ol> 8. Data Analysis Opmerking: Deze sectie beschrijft een werkwijze voor analyse met behulp ImageJ 7 of 8 Fiji verwerking van pad-lengte, hoewel andere software kan worden gebruikt. <ol><li> Gebruik een lichte tafel om alle getraceerd pad-lengtes van de petrischaal deksels over te dragen aan white paper (deksels kan worden gewassen met ethanol en hergebruikt voor verdere weglengte opname). </li><li> Trace een 50 mm rechte referentielijn op een van de vellen papier. </li><li> Scan de pad-lengtes met een resolutie van 300 dpi en opslaan als bitmap of tiff beeldbestanden. </li><li> Open het image-bestand, selecteert u de &quot;Process&quot; tab&gt; &quot;Binary&quot;&gt; &quot;Maak binary&quot;. Vervolgens onder het tabblad &quot;Process&quot;, selecteer &quot;Binary&quot;&gt; &quot;schets maken&quot;. Dit levert een één pixel breedte lijn, ongeacht de dikte van het spoor. </li><li> Zorg ervoor dat elke weglengte verschijnt als een continue enkele regel zonder crossovers. </li><li> Scheid elke kruispunten met behulp van de &quot;Straight line functie &quot;en het inkleuren van de lijn wit (de continuïteit van het pad kan worden gecontroleerd met de&quot; Wand &quot;(tracing) tool, moet het hele pad geel gemarkeerd (afb. 2). </li><li> Selecteer de &quot;Analyse&quot; tabblad&gt; Set metingen en selecteer &quot;Perimeter&quot; en &quot;display label&quot;. </li><li> Selecteer de &quot;Analyse&quot;&gt; tabblad &quot;Stel schaal&quot; en selecteer &quot;schaal verwijderen&quot;. </li><li> Op de afbeelding, selecteert u de verwijzing regel alleen, selecteert u het tabblad &quot;Analyse&quot;&gt; &quot;Analyse deeltjes&quot; en selecteer &quot;Show: Outlines&quot;, &quot;Toon resultaten&quot; en &quot;Clear resultaten table&quot;. Let op: De uitgang zal het aantal pixels dat overeenkomt met de 50 mm schaal lijn laten zien. </li><li> Selecteer &quot;Analyse&quot;&gt; tabblad &quot;Stel schaal&quot; en in het aantal pixels in &quot;Distance in pixels&quot; en de bijbehorende afstand (50 mm) in de &quot;bekende afstand&quot; in te vullen. </li><li> Tot slot, selecteert u alle weglengte tekeningen van een genotype eenta tijd, selecteer de &quot;Analyse&quot;&gt; tabblad &quot;Analyse deeltjes&quot; en selecteer &quot;Show: contouren&quot;, &quot;Toon resultaten&quot; en &quot;Clear resultaten table&quot;. <ol><li> Verwijder eventuele schriftelijke labels of voor de hand liggende vreemde markeringen (ze zullen worden erkend als path-lengtes) binnen het geselecteerde gebied door het gebied te selecteren en vullen wit. </li></ol></li><li> Inspecteer de &quot;Outlines&quot; output file te zorgen voor de perimeters correct werden vastgesteld. De uitgang een weglengte in mm per weglengte tekening de selectie tonen. Dit kan gemakkelijk worden geëxporteerd naar een spreadsheet en geanalyseerd met statistische software. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Behavioral+Genetics+of+the+Fly+%28Drosophila+melanogaster%29%22">Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster)</a>. Dubnau, J. , Cambridge University Press. New York. 173(2014).</li>
<li>Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foraging+strategies+of+Drosophila+melanogaster%3A+a+chromosomal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Genet%22%5BJournal%5D)">Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis.</a> Behav Genet. 10, 291-302 (1980).</li>
<li>de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+localization+of+foraging+%28for%29%3A+A+major+gene+for+larval+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 123, 157-164 (1989).</li>
<li>Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+behavior+polymorphism+due+to+a+cGMP-dependent+protein+kinase+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila.</a> Science. 277, 834-836 (1997).</li>
<li>Kalderon, D., Rubin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+protein+kinase+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila.</a> J Biol Chem. 264 (18), 10739-10748 (1989).</li>
<li>Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+protein+kinase+as+a+modifier+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior.</a> Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaser+%28Csr%29%2C+a+new+gene+affecting+larval+foraging+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 140, 263-270 (1995).</li>
<li>Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+larval+behavioral+mutants+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster.</a> J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).</li>
<li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rover%2Fsitter+Drosophila+foraging+polymorphism+as+a+function+of+larval+development%2C+food+patch+quality+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation.</a> J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).</li>
<li>Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+competition+in+Drosophila+melanogaster%3A+effects+on+development+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time.</a> Genetics. 82, 33-44 (1990).</li>
<li>Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+social+behavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamics of social behavior in fruit fly larvae.</a> PLoS One. 9 (4), e95495(2014).</li>
<li>Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+transformation+from+light+reception+to+phototactic+behavior+in+Drosophila+larvae+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae).</a> J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).</li>
<li>de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heredity+of+rover%2Fsitter%3A+alternative+foraging+strategies+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster.</a> Heredity. 59, 73-83 (1987).</li>
<li>de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+foraging+microregion+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster.</a> Genome. 36, 94-101 (1993).</li>
<li>Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+foraging+behavior+in+Drosophila+by+density+dependent+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection.</a> PNAS. 94, 7373-7377 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De weglengte assay hier geschetste biedt een robuuste en eenvoudige maatregel van het foerageergedrag van Drosophila larven. Het protocol volgt de algemene methodiek Sokolowski 2 beschreven, maar is sindsdien verbeterd met betrekking tot efficiëntie en experimentele controles. Voor zover wij weten is deze methode de enige beschikbare werkwijze voor het meten larvale weglengte. De oorspronkelijke versie van de weglengte protocol 2, 3, 15, 16 geteste larven op petrischalen met een dun laagje...

Sinds de ontdekking van het witte gen in het laboratorium Thomas Hunt Morgan in 1910, heeft de fruitvlieg Drosophila melanogaster (D. melanogaster), gebruikt als model voor de studie van de moleculaire en fysiologische onderbouwing van verschillende biologische processen. De populariteit van D. melanogaster grotendeels voort uit de aanzienlijke hoeveelheid en de verscheidenheid van genetische instrumenten. Drosophila kleine formaat, relatieve gemak van de behandeling en korte generatie tijd maken het een ideaal model voor genetische studies. Even belangrijk is Drosophila vermogen om veel van de fenotypes met meer complexe organismen zoals zoogdieren tot expressie te tonen. Dit omvat complexe fenotypen zoals gedrag die staan ​​op het grensvlak tussen het organisme en zijn omgeving. Als zodanig, behavioral studies over de fruitvlieg aanzienlijk hebben bijgedragen aan ons begrip van hoe genen en het milieu te bemiddelen gedrag1. Een van de eerste studies D. melanogaster larven gedrag onderzocht individuele verschillen in larvale foerageerstrategieën door het meten van het pad-lengtes van de larven 2 tijdens het voeden. Padlengte is gedefinieerd als de totale afstand die een larve op gist, binnen vijf minuten. Zowel laboratoriumstammen en vliegen van een natuurlijke populatie Toronto gevarieerd in hun gedrag voederen en er een genetische component aan individuele verschillen in weglengte. Twee larvale foerageren morphs werden beschreven vanuit de kwantitatieve weglengte distributies en ze waren rover en sitter genoemd. Rovers vertonen langere weg-lengtes, terwijl het doorkruisen van een groter gebied, terwijl op een voedingsmiddel substraat dan sitters. Met behulp van deze weglengte assay, de Belle et al. 3 in kaart gebracht het foerageren (voor) gen verantwoordelijk voor deze individuele gedragsverschillen een discrete locatie op chromosoom- 2 (24A3-24C5). De D. melanogaster voor gen werd later gekloneerd 4 en openbaarde een cGMP afhankelijke eiwitkinase 5, een modulator fysiologie en gedrag in Drosophila en andere organismen 6 zijn. Hier schetsen we de huidige protocol voor de larvale weglengte assay oorspronkelijk ontwikkeld in Sokolowski 2. Hoewel bepaalde aspecten van de test loop der jaren veranderd, het concept achter het ontwerp niet. We bieden ook gegevens aan het potentieel van de test om genetische en omgevingsfactoren bijdragen aan individuele verschillen in het foerageergedrag van Drosophila larven te beoordelen te illustreren. Het larvale weglengte test is eenvoudig, efficiënt en toch robuust. Een enkele persoon kan testen tot 500 larven met gemak vier uur en de resultaten kunnen worden verkregen met een hoge reproduceerbaarheid. Oorspronkelijk ontwikkeld om te lokaliseren, kan worden gebruikt in genetische, quantitative trait locus in kaart brengen en in studiesvan gen-by-omgeving (GxE) interacties. Bovendien zijn de eenvoud en de reproduceerbaarheid maken het tot een geweldige bron voor undergraduate onderwijs.

<table><tbody><tr><td>6 oz&nbsp;fly cultuur flessen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AS355&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fly flespluggen</td><td>Droso-Plugs</td><td>59-201</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Petri schotels&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri schotels&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri schotels</td><td>VWR</td><td>25384-168&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie-sondes</td><td>Almedic</td><td>2325-58-5300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gist</td><td>Lab Scientific</td><td>FLY-8040-20F</td><td></td></tr></tbody></table>

foerageren path-length protocol<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; larven

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

De Drosophila melanogaster larvale weglengte fenotype is een gevestigde methode om de genetische en omgevingsfactoren bijdragen aan gedragsvariatie bestuderen. De larvale weglengte test werd ontwikkeld om individuele verschillen in foerageergedrag die later werden gekoppeld aan het foerageren gen te meten. Larvale weglengte is een makkelijk scoorde eigenschap dat het verzamelen van grote steekproefomvang faciliteert, tegen minimale kosten, voor genetische screens. Hier hebben wij een gedetailleerde beschrijving van de huidige protocol voor larvale weglengte assay eerst door Sokolowski. Het protocol beschrijft hoe reproduceerbaar te behandelen proefdieren, voeren de gedrags-test en de gegevens te analyseren. Een voorbeeld van hoe de test kan worden gebruikt om gedrags plasticiteit in respons op omgevingsveranderingen te meten, door het toevoeren omgeving manipuleren voor het uitvoeren van de test, wordt ook voorzien. Tot slot, geschikte test design en milieu-factoren die kunnen wijzigenlarvale weglengte zoals de kwaliteit van het eten, ontwikkelingsleeftijd en dag effecten worden besproken.

<html> Verschillen in weglengte van de rover en sitter voor stammen en het effect van voedsel op deprivatie weglengte zijn geïllustreerd in Fig. . 3 verzamelde gegevens gedurende drie opeenvolgende dagen testen toonde een significante stam effect (F (1,421) = 351,89, p &lt;2,20 x 10 -16; fig. 3A), met rovers verder dan sitters reizen. Naast het effect stam, was er een significant behandelingseffect voedselef...

We bieden een gedetailleerd protocol voor een Drosophila melanogaster foerageerpadlengte-assay. We bespreken de voorbereiding en het omgaan met testdieren, hoe de assay uit te voeren en de gegevens te analyseren.

Foerageren Path-length Protocol<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larven

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Het hoofddoel van deze assay is het kwantificeren van het locomotoire component van het gedrag van Drosophila-larven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de gedragsgenetica over genetische en omgevingsfactoren die bijdragen aan individuele verschillen in het larvale gedrag. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze snel en reproduceerbaar is en het mogelijk maakt om grote steekproefgroottes te verzamelen.Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het succes van de assay afhankelijk is van de timing van de ontwikkeling en de consistente, zorgvuldige behandeling van de proefdieren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ina Anreiter en Oscar Vasquez, promovendi in mijn laboratorium. Bereid de opbewaarfles voor door gaten te maken in één zijde van een plastic vliegenkweekfles van zes ounce.Gebruik vervolgens een spuit om de deksels van de Petrischalen te vullen met het eerder bereide druivensapmedium, totdat het oppervlak van het druivensapmedium een koepel vormt boven de rand van het deksel. Bewaar de druivenschalen in een vochtige en luchtdichte container bij vier graden Celsius gedurende maximaal twee weken. Giet 40 milliliters van het eerder bereide vliegenvoedsel in Petrischalen van 100 bij 15 millimeter.Gebruik drie zwarte Plexiglas platen met tien cirkelvormige putjes van tien centimeter diameter, gerangschikt in een ontwerp van twee bij vijf, om de larven te testen, en een zwarte Plexiglas spreider om de gistpasta op de Plexiglas platen te verspreiden. Scheid vervolgens de deksels van de bodems van de Petri-schalen. Verzamel 100 tot 150 vrouwtjes en 50 tot 75 mannetjes.Laat vrouwtjes en mannetjes een nacht paren in een fly culture bottle van zes ounce met standaard vliegvoedsel. Verplaats de vliegen naar een bewaarfles en gebruik plakband om een druivenplaatje met een kleine hoeveelheid verse gistpasta bovenop de fles te bevestigen. Laat de fles ondersteboven staan met het druivenplaatje aan de bodem, zodat de volwassenen eitjes op het druivenplaatje kunnen leggen.Gooi de eerste druifplaat na 24 uur weg en plaats een nieuwe druifplaat in de bewaarflacon. Verwijder na 22 uur de druifplaten uit de flacons en plaats deze in een Petri-schaal van 60 bij 15 millimeter. Plaats vervolgens een nieuwe druifplaat met verse gistpasta op de bewaarflacon.Verwijder alle larven van de gezaaide druivenplaat met een dissectiepen en gooi deze weg. Incubeer de schoongemaakte druivenplaten gedurende vier uur onder standaardcondities. Selecteer na vier uur 100 L1-larven (eerste instar) per stam van de druivenplaten en plaats deze op de voedingsplaten.Plaats de larven voorzichtig op het voedsel, zonder het voedsel te doorboren en zonder de larven in te graven. Groepen van tien larven kunnen telkens worden opgepikt en geplaatst. Vermijd verdringing door de larven over de voedingsplaat te verspreiden.Incubeer de voedingsplaten tot de proefdieren tien uur voor het begin van het dwalen zijn, het moment waarop larven het voedsel verlaten op zoek naar een plek om te verpoppen. Als de larven al zijn begonnen met dwalen en zich op het deksel van de Petri-schaal bewegen, zoals hier te zien is, zijn de dieren te oud om te testen en moet hun ontwikkeltijd opnieuw worden beoordeeld. Los gist op in water in een verhouding van één op twee.Zorg ervoor dat de voltooide pasta druppelt en linten achterlaat op het oppervlak van de pasta die snel wegsmelten. Het evalueren van de juiste consistentie van de gistpasta is belangrijker dan het gebruiken van de exacte verhouding vanwege de variabiliteit tussen merken, gistbatches en de omgeving. Haal met een penseel voorzichtig de larven uit de voedingsplaat van de eerste stam.Verzamel de larven in een Petrischaal en was de larven voorzichtig met water om alle voedselresten te verwijderen. Spoel de larven snel af met twee milliliter water en dep ze voorzichtig droog met een laboratoriumdoekje. Houd de larven in een vochtige omgeving, maar niet ondergedompeld in water, om stress te voorkomen.Plaats drie testplaten naast elkaar en stel voor elke testplaat een timer van vijf minuten in. Breng gistpasta aan op de bovenkant van de testplaten en gebruik de spreider om een dunne laag gistpasta over elke testplaat te verdelen, zodat alle putjes een gelijkmatige laag gist hebben. Plaats voorzichtig één larve in het midden van elk putje.Start de timer van vijf minuten onmiddellijk nadat de eerste larven op elke plaat zijn geplaatst. Plaats vervolgens de rest van de larven in de overige putjes. Plaats een Petri-schaaldeksel bovenop elk putje.Zodra de timer is afgelopen, start u met het natekenen van de achtergebleven padlengtes in de gist met een permanente marker, zonder de larven van de plaat te verwijderen. Teken de padlengtes in dezelfde volgorde en snelheid als waarin de larven op de platen zijn geplaatst. Herhaal tenslotte de stappen van de test voor de padlengte van de larven voor elke stam.Gegevens die gedurende drie opeenvolgende testdagen zijn verzameld, onthulden een significant stam-effect, waarbij de rovers verder reisden dan de sitters. Naast het stam-effect hadden larven die vier uur vóór de test waren vastgehouden, significant kortere padlengtes dan gevoede larven. Over het algemeen waren de padlengtes langer wanneer beide stammen werden gekweekt op voedsel met een hoog gehalte aan voedingsstoffen vergeleken met voedsel met een laag gehalte aan voedingsstoffen.Indien correct uitgevoerd, stelt deze assay één persoon in staat om met gemak tot 500 larven in vier uur te testen, wat het waardevol maakt voor fenotypering op grote schaal. Door de procedure te volgen die we zojuist hebben gedemonstreerd, kunnen andere variabelen zoals geslacht, voedseldeprivatie of voedselkwaliteit worden getest om het effect van deze variabelen op voedselgerelateerde bewegingspatronen aan te tonen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe de voedselgerelateerde locomotie van Drosophila-larven kan worden gemeten voor de beoordeling van de genetische en omgevingsfactoren die bijdragen aan individuele verschillen in gedrag.

foraging-path-length-protocol-for-drosophila-melanogaster-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Drosophila larven zijn in staat om geur stimuli associëren met smaak beloning. Hier beschrijven we een eenvoudige gedragsmatige paradigma dat de analyse van appetitieve associatief olfactorische leren mogelijk maakt.

Appetitieve Associatieve Olfactorische Learning in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Wetenschappers gebruiken het Drosophila-levensduurprotocol om te meten hoe verschillende experimentele omstandigheden de levensduur van vliegen beïnvloeden en daarbij overlevingscurven te genereren om de experimentele resultaten te kwantificeren. Het monsterprotocol bevat de test die wordt toegepast om de effecten op de levensduur van blootstelling aan verschillende concentraties hormoonontregelende chemicaliën of EDC's, zoals 17-α-ethinylestradiol (EE2) te bestuderen.

Levensduurprotocol voor Drosophila melanogaster:overlevingscurven genereren om verschillen in vlieglevensduur te identificeren

Deze video beschrijft hoe je vrij lopende vliegen kunt volgen om hun algemene bewegingsvermogen te beoordelen. Het aanbevolen protocol demonstreert de installatie en gegevensanalyse van de test met behulp van videotrackingsoftware.

Vrij lopende vliegen volgen: een methode om voortbeweging in Drosophila te beoordelen

In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster.

A Single-fly test voor foerageergedrag in Drosophila

De voeding circuit in Drosophila melanogaster larven serveert een eenvoudige maar krachtige model waarmee veranderingen in de voeding koers die moet worden gecorreleerd met veranderingen in de stomatogastric neurale circuits. Dit circuit bestaat uit centrale serotonerge neuronen die uitsteeksels aan de mond haken en de voordarm sturen.

Functionele analyse van de larvenvraat Circuit in Drosophila</i

Drosophila melanogaster zijn nuttig bij het ​​bestuderen van genetische of ecologische manipulaties die gedrag zoals spontane motorische activiteit beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol dat monitoren met infrarood stralen en data analyse software om spontane bewegingsactiviteit kwantificeren gebruikt.

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De Drosophila larven is een krachtig modelsysteem om neuronale controle van gedrag te bestuderen. Deze publicatie beschrijft het gebruik van lineaire agarose kanalen om aanhoudende aanvallen van lineaire kruipen en methoden te lokken om de dynamiek van larvale structuren te kwantificeren tijdens repetitieve kruipen gedrag.

Met behulp van Linear Agarose kanalen om te studeren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Crawling Behavior

Dit protocol is ontworpen om de levensvatbaarheid van Drosophila in elke ontwikkelingsfase, van embryo tot volwassene, te beoordelen. De methode kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van verschillende genotypen of groeiomstandigheden te bepalen en te vergelijken.

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

Dit protocol beschrijft een gedragstest voor het registreren van door suiker uitgelokt zoekgedrag met behulp van Drosophila melanogaster. De test kan worden gebruikt om voedings- en foerageergerelateerd gedrag te bestuderen, evenals de onderliggende neuronale mechanismen.

Volgen van door suiker uitgelokt lokaal zoekgedrag in Drosophila

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.

Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium

Leer het foerageren path-length protocol voor Drosophila melanogaster larven om locomotiegedrag te kwantificeren. Deze methode meet genetische en omgevingsinvloeden op voedingsgerelateerde beweging.

Foerageren Path-length Protocol

Meer video's verkennen