Name: Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer intra-iliaca injectie voor efficiënte modellering van botmetastase bij muizen. Deze techniek minimaliseert weefselschade en helpt onderzoekers bij het bestuderen van borstkankercelinteracties in het botmicroklimaat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in het Zhang-lab werd ondersteund door X. H.-F. Z.'s NCI CA151293, CA183878, Breast Cancer Research Foundation, U.S. Department of Defense DAMD W81XWH-13-1-0195, een Pilot Award van CA149196-04, McNair Medical Institute en door H.W.'s U.S. Department of Defense DAMD W81XWH-13-1-0296.

Alle dierlijke werk werd gedaan in overeenstemming met de richtlijnen van het Baylor College of Medicine Animal Care. 1. Celbereiding Op: verschillende kankercellijnen kunnen worden gebruikt voor injectie IIA afhankelijk onderzoeksdoeleinden. Wij hebben borstkankercellijnen MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 en prostaatkanker cellijn C4-2 in het onderzoek. We gebruiken meestal zowel GFP en vuurvlieg-luciferase gelabeld kankercellen voor onze studie en hier laten zien sommige gegevens van de GFP-Luciferase-label MCF7 cellijn. <ol><li> Handhaven cellen in DMEM met 10% FBS en 0,1 mg / ml penicilline-streptomycine bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Voordat IIA injectie trypsinize cellen bij 80-90% samenvloeiing met 0,25% trypsine / EDTA-oplossing. Gebruik koude PBS om cellen tweemaal wassen en resuspendeer cellen in 10 ml PBS celtelling. PBS Centrifugeer cellen te verwijderen bij 800 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellenbij een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml in ijskoude PBS. </li><li> Gebruik 100 ul GFP- en vuurvlieg-luciferase gelabeld kankercellen voor IIA injectie van één muis. Opmerking:. Daarom is het aantal cellen door elk dier ontvangen, is 5 x 10 5 Dit aantal moet worden gewijzigd gebaseerd op de agressiviteit van cellijnen. </li><li> Houd celsuspensies op ijs. Noot: Trillingen kunnen nodig zijn om celaggregatie elke paar minuten te voorkomen totdat het klaar is voor injectie. Voor sommige cellijnen (zoals MDA-MB-231), kunnen strengere procedures (bijvoorbeeld, via 45 urn cel zeef) nodig om aggregatie te voorkomen. Houdt u er rekening mee dat de klomp van de schepen weefselnecrose kan veroorzaken, en daardoor verwarrende de experimenten. </li></ol> 2. Dier Voorbereiding <ol><li> Voor dier pijn, geef 5 mg / kg / dag carprofen (of ander analgeticum) met voedingssupplement aan de muizen niet minder dan 24 uur voor de operatie. Behereneen dosis van 0,1 mg / ml subcutaan buprenorfine 60 min voorafgaand aan de operatie. Let op: een optionele procedure is om estradiol pallet te implanteren in de achterkant van de dieren om extra estradiol bieden. Hierdoor wordt de groei van ER + kankercellen (bijvoorbeeld MCF-7 cellen) 9 versnellen. </li><li> Verdoven een 4-6 weken oude muizen (ongeveer 20 g) met ketamine (80 - 100 mg / kg) en xylazine (10 -12,5 mg / ml) door intraperitoneale injectie. </li><li> Bevestig het juiste niveau van sedatie van een 20 g muis door teen knijpen en de waarneming van een vermindering van 50% van de ademhalingsfrequentie en roze slijmvliezen (bv, muis oor huid en poot huid). Houd toezicht op deze vitale functies om de 15 minuten tijdens de operatie. Opmerking: geen beweging van het dier blijkt dat het dier voldoende verdoofd en klaar voor chirurgie. </li><li> Gebruik dierenarts zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. </li><li> Scheer de muis in de onderbuik, in het bijzonder de rechter lies gebied waar de operatie en injectie zalplaatsvinden. Opmerking: Dit is niet nodig als athymische naakt muizen worden gebruikt. </li><li> Zet de muis op zijn rug, spreidde de benen in hun natuurlijke positie en plak de tenen naar mobiele dissectie karton met tape. </li><li> Veeg de rechter liesstreek met 70% isopropyl ethanol gedrenkt steriele wattenstaafjes, volgde met betadine chirurgische scrub meerdere malen. </li></ol> 3. Het gemeenschappelijk Iliac Vein en Artery Locatie en Scheiding <ol><li> Maak een incisie in de huid van 1,0-1,2 cm lang tussen de 4 e en 5 e tepels in de rechter onderbuik met steriele, # 10 koolstofstaal scalpelmesjes gehouden in een nummer 3 handvat. Maak dan gebruik van een steriele chirurgische laken om het dier lichaam te bedekken met uitzondering van de incisie. </li><li> Verplaats het dier standaard bench top dissectie microscoop. Gebruik een vergroting 4x voor injectie. </li><li> Onder 4X vergroting van de dissectie microscoop, steek stompe tang scheiding tussen het vetweefsel en de peritoneum, en druk op de weefsels naar buiten aan beide zijden van de iliacale vaten en zenuwen (zie figuur 1) bloot te leggen. Opmerking: De slagader tussen aorta van de middellijn en het onderste deel van slagader takken wordt bekkenslagader genoemd. Dit is waar de injectie plaatsvindt. </li><li> Gebruik een paar rechte fijne tang te breken door het bindweefsel (zoals een membraan) tussen schepen en de zenuw, dichter bij de schepen. </li><li> Schakel de rechte fijne tang aan de linkerhand. Pak een paar schuine fijne tang met de rechterhand. Steek de rechterhand tang in dezelfde positie waar het bindweefsel zijn gebroken. En dan vasthouden aan de rechterhand tang door en onder de schepen. </li><li> Op hetzelfde moment, plaatst de linkerhand een tang in het bindweefsel aan de linkerkant van de schepen aan de rechterhand tang gaan door te leiden. </li><li> Zodra de rechter tang krijgt onder de schepen, proberen om de schepen te scheiden van de omliggende tissue een beetje meer, en dan blijven ze op de top van de rechterhand tang. </li><li> Gebruik linkerhand tang om het uiteinde van een 4-0 zijden hechtdraad te leveren aan de rechterhand een tang, en trek de hechtdraad voorzichtig en langzaam door middel van onder de schepen. Opmerking: Nu zowel de gemeenschappelijke ader en slagader schepen worden opgesteld door de hechtdraad opgeheven (zie figuur 2). </li></ol> 4. Injectie en Post-injectie Care <ol><li> Maak de cellen voor injectie in een 31 G insulinespuit. Gebruik 100 gl celsuspensie in PBS per injectie. Zorg ervoor dat u pipet op en neer meerdere malen om de cellen te scheiden en aggregatie te vermijden, zodat de geïnjecteerde cellen niet zal verstoppen en blokkeren de bloedstroom. </li><li> Met de schuine pincet in de linkerhand, zet de tang onder de schepen langs de leiding van de hechtdraad, en open vervolgens de twee takken van de tang, met de vaten voorzichtig gehouden op de tang. Opmerking: De tijd tussen de twee takken van de tang zal de i wordennjection website. </li><li> Houd de 31 G naald met 100 gl celsuspensies in de rechterhand, met de schuine kant van de naald naar boven, klaar voor injectie. </li><li> Steek de naald in de slagader lumen (bloed zal de naald in te voeren). Duw vervolgens celsuspensie langzaam in om de cellen te injecteren. De celsuspensie zal wegduwen van de rode bloedcellen in het vat. Probeer niet om de schepen breken of lekken, de celsuspensie uit. </li><li> Wanneer de injectie is voltooid, voorzichtig terug te trekken van de naald en houd houden van de schepen tot aan de linkerkant een tang om het bloeden te stoppen. Trek vervolgens weg van de hechtdraad. </li><li> Weg te trekken de linkerhand een tang, en snel gebruik maken van een wattenstaafje om de slagader incisie gebied drukken om het bloeden te stoppen. Opmerking: Meestal 5-10 min voortdurende druk is voldoende om het bloeden te stoppen. </li><li> Als het bloeden stopt, gebruik dan de huid lijm om de huid randen van de operatie gebied te sluiten. Maak een oormerk, en controleer op bioluminescentie signalering naar de verdeling van de geïnjecteerde cellen te onderzoeken. &lt;br /&gt; Opmerking: Een succesvolle injectie resulteert in een afbeelding soortgelijk aan figuur 3. <ol><li> Raadpleeg bioluminescentie signalering door injectie van 100 pi 15 mg / ml luciferine in PBS bij 75 mg / kg muis concentratie via het intra-orbitale sinus. <ol><li> Voor intra-orbitale injectie, zet vingers aan beide zijden van de muis oog, gebruik druk om maken oogbol iets pop uit het oog kader, neem 28 G insulinespuit naalden tussen de oogbol en neus, en duw dan langzaam spuit luciferine injecteren . Opmerking: Bij de juiste positie, moet de naald in staat tot een diepte van 2 bereikt - 3 mm alvorens hard weefsel (bot). </li><li> Plaats de muis in afbeeldingsstelsel voor in vivo beeldvorming van gehele dieren 10-60 sec in 5 minuten (zie figuur 3). Opmerking: Een optionele procedure is om estradiol pellet implanteren in de achterkant van de dieren om extra estradiol bieden. Hierdoor zal de groei van ER + kankercellen (bijvoorbeeld MCF-7 versnellencellen) 15. </li></ol></li></ol></li><li> Laat de muis op een warme verwarming pad totdat hij wakker wordt. Bewaken van de bloeden, zwelling, tekenen van dehiscence en pijn tijdens de post-operatieve periode. Leg de muizen terug naar de kooi met pijnstillende dekking (carprofin voedingssupplement voorgesteld) gegeven voor pijnbestrijding totdat er geen tekenen van pijn. Besteed veel aandacht en zorg aan de dieren gedurende 7 dagen na de operatie. </li></ol> 5. Toezicht gemetastaseerde Growth <ol><li> histomorfometrie: <ol><li> Harvest tumordragende botweefsel, bevestig de botten in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, vervolgens ontkalken ze in pH 7,0 14% EDTA oplossing voor 3-5 dagen, en deze te onderwerpen aan inbedden in paraffine zoals eerder beschreven 14. </li><li> Gedeelte paraffine inbedding botweefsel met een dikte van 3 urn en uitvoeren standaard histologische Werkwijze hematoxyline / eosine kleuring zoals eerder beschreven 14. </li></ol></li><li> Immunohistochemisproberen: <ol><li> Onderwerp paraffine ingebedde tumor dragende bot glijdt naar immunohistochemie kleuring voor diverse doeleinden zoals eerder beschreven 14. In het kort immunostain MCF7 kankercellen door anti-GFP antilichamen en immunostain osteogene cellen (pre-osteoblasten en Osteoblasten) door anti-Osterix antilichamen en anti-alkalische fosfatase (ALP) antilichamen, respectievelijk. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+alpha4beta1-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer cell. 20 (6), 701-714 (2011).</li>
<li>Ell, B., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Bone Metastasis.</a> Cell. 151 (3), 690-690 (2012).</li>
<li>Kretschmann, K. L., Welm, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Metastasis Rev. 31 (3-4), 579-583 (2012).</li>
<li>Lelekakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orthotopic+model+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone.</a> Clin Exp Metastasis. 17 (2), 163-170 (1999).</li>
<li>Rose, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol Cancer Res. 5 (10), 1001-1014 (2007).</li>
<li>Welm, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-stimulating+protein+pathway+promotes+metastasis+in+a+mouse+model+for+breast+cancer+and+predicts+poor+prognosis+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7570-7575 (2007).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TGF-beta+Responsiveness+in+Prostate+Stromal+Cells+Alters+Chemokine+Levels+and+Facilitates+the+Development+of+Mixed+Osteoblastic%2FOsteolytic+Bone+Lessions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lessions.</a> Mol. Cancer. Res. 10 (4), 494-503 (2012).</li>
<li>Gregory, L. S., Choi, W., Burke, L., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Cells+Induce+Osteolytic+Bone+Lesions+In+vivo+through+a+Reduction+in+Osteoblast+Activity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ON%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Cells Induce Osteolytic Bone Lesions In vivo through a Reduction in Osteoblast Activity in Mice.</a> PLoS ON. 8 (9), e68103(2013).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-%CE%B2+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nat Med. 21 (11), 1262-1271 (2015).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Vet Pathol. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Werbeck, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+regulates+metastasis+and+metastasis+genes+of+mouse+MMTV-PymT+mammary+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo.</a> Vet Pathol. 51 (4), 868-881 (2014).</li>
<li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+Protein+Epitope+Mimetic+Antagonist%2C+POL5551%2C+Disrupts+Metastasis+and+Enhances+Chemotherapy+Effect+in+Triple+Negative+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">CXCR4 Protein Epitope Mimetic Antagonist, POL5551, Disrupts Metastasis and Enhances Chemotherapy Effect in Triple Negative Breast Cancer.</a> Mol Cancer Ther. 14 (11), 2473-2485 (2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteogenic+niche+promotes+early-stage+bone+colonization+of+disseminated+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells.</a> Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+estrogen+receptor+destabilizing+compounds%3A+effects+on+estrogen-sensitive+and+tamoxifen-resistant+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Characterization of new estrogen receptor destabilizing compounds: effects on estrogen-sensitive and tamoxifen-resistant breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 96 (3), 210-218 (2004).</li>
<li>Tannehill-Gregg, S. H., Levine, A. L., Nadella, M. V., Iguchi, H., Rosol, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+zoledronic+acid+and+osteoprotegerin+on+growth+of+human+lung+cancer+in+the+tibias+of+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The effect of zoledronic acid and osteoprotegerin on growth of human lung cancer in the tibias of nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 23 (1), 19-31 (2006).</li>
<li>Slyfield, C. R., Tkachenko, E. V., Wilson, D. L., Hernandez, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Dynamic+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Dynamic Bone Histomorphometry.</a> J Bone Miner Res. 27 (2), 486-495 (2012).</li>
<li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FSPECT%2FCT+imaging+of+small+animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> Am J Pathol. 182 (2), 319-324 (2013).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+prostate+cancer+cell+line+%28Probasco%29+produces+osteoblastic+metastases+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo.</a> Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel slechts de iliacale slagader is het doelwit van injectie voor kankercellen, adviseren wij de scheiding van zowel ader iliacale slagader en uit de omliggende weefsels, en om ze samen te heffen als een bundel. Dit komt omdat de ader en slagader intensief contact met elkaar, en de veneuze vaatwand is dun en gemakkelijk te breken. Daarom is voor een succesvolle injectie, bespaart tijd en moeite bij elkaar houden van de twee vaten, hoewel kankercellen worden geïnjecteerd alleen de slagader. Een 4-0 zijden hechtdraad w...

Metastasen goed voor meer dan 90% van de sterfgevallen als gevolg van solide tumoren. Bot is de meest voorkomende orgaan beïnvloed door metastasen van verscheidene soorten kanker, in het bijzonder borstkanker en prostaatkanker. Wanneer de diagnose in de kliniek, meestal botmetastasen al hebt ingevoerd gevorderde stadia met ofwel osteolytische of osteoblastische veranderingen in bot, vaak gepaard met neurologische symptomen. Eerdere studies voornamelijk gericht op de openlijke osteolytische botmetastasen 1-3, maar we momenteel beperkte begrip van micrometastasen in botten voor het begin van het proces osteolytische. Dit is althans gedeeltelijk te wijten aan gebrek aan geschikte experimentele modellen en benaderingen. Genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker metastaseren vaak longen, maar veel minder efficiënt botten 4. Ook de orthotopically getransplanteerde tumoren ontwikkelen zelden spontaan botmetastasen, met een aantal bot-tropische 4T1 borstklier carcinoomeen sub-klonen en MSP overexpressie PyMT transgene muismodel als uitzonderingen 5-7. Intra-scheenbeen boren kan kankercellen te leveren aan het bot 8-10, maar zij maakt ook schade en ontstekingen aan de lokale weefsels. Momenteel intracardiale injectie van borstkanker cellijnen belangrijke benadering bot kolonisatie 11-13 onderzoeken geweest. Echter, na kankercellen worden ingebracht in linker ventrikel slechts een beperkt deel zal uiteindelijk bij bot en beenmerg, waardoor het moeilijk microscopische uitzaaiingen volgen op een meetbare manier. In deze studie hebben we vastgesteld techniek, namelijk intra-iliacale arterie (IA) injectie 14, om kankercellen selectief leveren aan achterpoot weefsels, waardoor kankercellen in bot en beenmerg verrijken zonder schade aan lokale weefsels. Door het bot specificiteit, deze benadering ook voldoende voor indolent kankercellen uiteindelijk koloniseren alvorens het eenĳ dieren bezwijken voor primaire tumoren en uitzaaiingen in andere vitale organen. In combinatie met verschillende andere technieken, zoals bioluminescentie, immunofluorescentie kleuring en bothistomorfometrie, IIA injectie is potentieel nuttig voor een breed scala aan onderzoeksdoeleinden verband met botmetastasen, vooral voor de overgang van één kankercellen meerdere cellen volgen micrometastasen. In het bijzonder hebben we aangetoond dat IIA injectie kunnen we de interacties tussen kankercellen en diverse omringende cellen in het bot micro visualiseren.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep Amphatericin B</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-745E</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA solution</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>45 &mu;M cell strainer</td><td>VWR International Laboratory</td><td>195-2545</td><td></td></tr><tr><td>MediGel CPF with carprofen&nbsp;</td><td>Controlled item from veterinary care in BCM</td><td></td><td>Voor pijnbeheersing</td></tr><tr><td>Buprenorphine&nbsp;</td><td>Controlled item from veterinary care in BCM</td><td></td><td>Voor pijnbeheersing</td></tr><tr><td>Estradiol pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>SE-121</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine and xylazine</td><td>Controlled item from veterinary care in BCM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet ointment</td><td>Controlled item from veterinary care in BCM</td><td></td><td>Voorkom droge ogen</td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Oster</td><td>78005-050</td><td>Voor muizen met vacht</td></tr><tr><td>Isopropyl ethanol</td><td>ACROS</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Betadine surgical scrub</td><td>Controlled item from veterinary care in BCM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10 scalpel blades</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>549-3CS-10</td><td>Meerdere</td></tr><tr><td>No. 3 handle</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>541-31</td><td>Moet worden geautoclaveerd</td></tr><tr><td>Sterile surgical drape</td><td>Sai Infusion Technology</td><td>PSS-SD1</td><td></td></tr><tr><td>Straight forceps&nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5132</td><td>Moet worden geautoclaveerd</td></tr><tr><td>Straight fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td>Moet worden geautoclaveerd</td></tr><tr><td>Edged fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td>Moet worden geautoclaveerd</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl silk suture</td><td>Johnson &amp; Johnson Health Care</td><td>J214H</td><td></td></tr><tr><td>31 G insuline syringes</td><td>BD</td><td>328418</td><td>Meerdere</td></tr><tr><td>Q-tips cotton swabs (Sterile)</td><td>VWR International Laboratory</td><td>89031-272</td><td></td></tr><tr><td>Skin glue</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>31477</td><td>Voor het sluiten van de huid op de operatieplek</td></tr><tr><td>Ear Tag Applicator</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-00</td><td></td></tr><tr><td>Ear tags</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-50</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK</td><td>Vermijd licht en zet op ijs</td></tr><tr><td>28 G insulin syringes</td><td>BD</td><td>329410</td><td>Voor intra-orbitale injectie</td></tr><tr><td>Paraformadehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Voor weefselfixatie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>OmniPur</td><td>4050</td><td>Voor decalcificatie van botweefsel</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica</td><td>Leica S6E stereo</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II imaging system</td><td>Advanced Molecular Vision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibodies (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALP antibodies</td><td>Abcam</td><td>ab108337</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Osterix antibodies</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-iliaca injectie voor efficiënte en selectieve modellering van microscopisch botmetastase

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Injectie in de intra-iliacale slagader (IIA) is een efficiënte methode om metastaserende laesies van verschillende kankercellen bij dieren te introduceren. In vergelijking met de veel gebruikte intra-cardiale en intra-tibiale injecties, biedt IIA-injectie verschillende voordelen. Ten eerste kan het een grote hoeveelheid kankercellen specifiek naar de achterpootbeenderen brengen, waardoor tijd- en ruimtelijk gesynchroniseerde vroege kolonisatie-evenementen worden geboden en een robuuste kwantificering en snelle detectie van gedisseminateerde tumorcellen mogelijk worden. Ten tweede injecteert het kankercellen in de bloedcirculatie zonder de lokale weefsels te beschadigen, waardoor ontstekings- en wondgenezingsprocessen worden vermeden die het botkolonisatieproces beïnvloeden. Ten derde veroorzaakt IIA-injectie zeer weinig metastatische groei in niet-botorganen, waardoor voorkomen wordt dat dieren bezwijken aan andere vitale metastasen en continue monitoring van indolente botlaesies mogelijk wordt. Deze voordelen zijn vooral nuttig voor het inspecteren van de progressie van enkele kankercellen naar micrometastasen met meerdere cellen, wat in het verleden grotendeels ongrijpbaar is geweest. In combinatie met geavanceerde benaderingen van biologische beeldvorming en bothistologie, kan IIA-injectie worden toegepast op verschillende onderzoeksdoeleinden met betrekking tot botmetastasen.

Figuur 1 toont de anatomische locatie en de relatie van bekkenslagader (rood) en ader (blauw). Figuur 2 toont relatieve positie van iliacale bloedvaten en zenuwen onder dissectie microscoop. Zoals weergegeven in figuur 2A, de vaten en zenuwen direct onder de peritoneale wand en kan worden onthuld na de incisie wordt gemaakt en het peritoneum wordt weggeduwd. De vena iliaca com...

Dit manuscript beschrijft de gedetailleerde procedure van intra-iliacale arteriële (IIA) injectie, een techniek om kankercellen specifiek af te leveren aan weefsels van de achterpoten, inclusief botten, om experimentele botmetastasen te creëren. Hoewel het oorspronkelijk werd vastgesteld met borsttumormodellen, kan dit protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar andere soorten kanker.

Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Het algemene doel van deze procedure is om experimentele botmetastasen te induceren door kankercellen direct in de weefsels van de achterpoten, inclusief de botten, te brengen via een intra-iliacale arterie-injectie. Deze methode kan ons helpen kernvragen te beantwoorden over de kolonisatie van botten door borstkanker, in het bijzonder in de vroege fase van dit proces: hoe borstkankercellen interageren met micro-omgevingscellen in het bot. We hebben vandaag de injectie in de arteria iliaca uitgevoerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het efficiënt en selectief een experimenteel microscopisch model van botmetastasen voor diverse kankertypen tot stand brengt zonder lokaal weefselletsel te veroorzaken. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien het vinden van een nauwkeurige injectieplaats in de arteria iliaca onder de microscoop oefening vereist om een injectiesuccespercentage van meer dan negentig procent te bereiken. Begin met het bevestigen van het juiste sedatieniveau door een knijpprik in de teen van een vijf tot zes weken oude muis van 20 g.Na het aanbrengen van de oogzalf wordt het geschoren rechterliegebied meerdere keren afgeveegd met opeenvolgende, steriele, in 70% isopropyl ethanol gedrenkte wattenstaafjes, gevolgd door een betadine chirurgische scrub. Bedek vervolgens de gehele muis met een steriel afdekdoek. Gebruik daarna een steriel koolstofstalen scalpellamesje nummer tien met een houder nummer drie om een huidincisie van 1 tot 1,2 centimeter te maken tussen de vierde en vijfde tepels in de rechteronderbuik.Verplaats het dier vervolgens naar een standaard dissectiemicroscoop op het aanrecht. Voer met het 4X objectief stompe separatiepincetten in de incisie tussen het vetweefsel en het peritoneum in en duw de weefsels aan beide zijden naar buiten om de iliacaalvaten en -zenuwen bloot te leggen. Gebruik daarna rechte, fijne pincetten om het bindweefsel tussen de vaten en de zenuw die het dichtst bij de vaten ligt door te breken.Schuif vervolgens een gebogen pincet door het bindweefsel en onder de iliaca-vaten, terwijl u een recht pincet in het bindweefsel aan de andere zijde van de vaten plaatst om het gebogen pincet door het weefsel te leiden. We raden aan om de iliale rand en slagader in deze stap als één bundel te scheiden en op te tillen. Hoewel de tumorcellen alleen in de slagader worden geïnjecteerd, bespaart het isoleren van beide vaten samen tijd en moeite.Zodra de gebogen pincetten op hun plaats zitten, worden de v. iliaca en a. iliaca verder gescheiden van het omringende weefsel, waarbij de vaten tijdens de dissectie bovenop de gebogen pincetten worden gehouden. Wanneer de vaten vrijliggen, wordt met de rechte pincetten de punt van een 4-0 zijden hechtdraad naar de gebogen pincetten gebracht en wordt de hechtdraad langzaam en voorzichtig onder de vaten doorgetrokken. Zowel de v. iliaca communis als de a. iliaca communis moeten vervolgens door de hechtdraad worden omhooggehouden.Wanneer de vaten gereed zijn, pipetteer je de tumorcellen meerdere keren op en neer om ze opnieuw te suspenderen tot een enkelcellige oplossing en eventuele klonters te breken. Aspireer vervolgens 100 µL cellen per muis in een insulinespuit met een 31 gauge naald. Schuif nu de gebogen pincet opnieuw onder de vaten met de hechtdraad als gids, en open de pincet zodat de vaten voorzichtig op de punten rusten.Steek met de andere hand de naaldpunt met de opening naar boven in het lumen van het gedeelte van de slagader tussen de pincetpunten. Druk de zuiger langzaam in om de cellen te injecteren. De celsuspensie zal het bloed door het vat spoelen.Wanneer alle cellen zijn toegediend, verwijdert u voorzichtig de naald, terwijl u de vaten met de pincet omhoog houdt om bloedingen te voorkomen. Trek vervolgens de hechtdraad weg. Verwijder tot slot snel de pincet en druk een wattenstaafje gedurende vijf tot 10 minuten op de incisie om het bloeden te stoppen.Hier wordt een representatief bioluminescent beeld van het hele dier getoond na intra-iliacale arterie-injectie van 5 × 10⁵ GFP-luciferine-gelabelde MCF-7 borstkankercellen, gevolgd door toediening van d-luciferine via een retro-orbitaal sinusinjectie. Op dag 14 na injectie werd een sterk bioluminescent signaal verkregen uit het via de arteria iliaca geïnjecteerde achterste bot, maar niet uit het contralaterale controlebot, wat de specifieke lokalisatie van de geïnjecteerde cellen bevestigt. Een H&E-kleuring van coupes van de tumorhoudende botten toonde eveneens een compacte, kasseivormige celpopulatie met grote kernen aan, wat wijst op microscopische MCF-7 metastatische laesies in het botweefsel 14 dagen na de intra-iliacale arterie-injectie.Verder onthulde immunofluorescentiekleuring van de botsecties ook een vermenging van de MCF-7-cellen met osteoblasten en preosteoblasten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in tien tot vijftien minuten worden voltooid. Na deze procedures kunt u andere methoden gebruiken om aanvullende vragen te beantwoorden.We kunnen bijvoorbeeld RNA-Seq gebruiken om de cellen van de micro-omgeving in de metastaseniche te profileren en deze te vergelijken met normale cellen. Deze techniek biedt een manier voor onderzoekers van borstkanker en prostaatkanker om botmicrometastasen in dieren te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een borstkanker-botmetastase-model kunt opzetten via injectie in de arteria iliaca interna.Neem passende voorzorgsmaatregelen, omdat het werken met ketamine en xylazine uiterst gevaarlijk kan zijn.

intra-iliac-artery-injection-for-efficient-selective-modeling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In de pathogenese van bot metastase, angiogenese is een cruciaal proces en vormt derhalve een doel voor beeldvorming en therapie. Hier presenteren we een rat model van site-specifieke borstkanker botmetastase en beschrijven strategieën om niet-invasieve beeld...

Multi-modale beeldvorming van angiogenese in een Naakt ratmodel van borstkanker botmetastase Met behulp van Magnetic Resonance Imaging, Volumetrische computertomografie en Echografie

Diermodellen worden vaak gebruikt om uitzaaiing studeren bot. In dit protocol beschrijven we twee gebruikelijke methoden van tumorinoculatie voor bot metastase studies en beschrijf kort enkele van de analyses gebruikt om toezicht te houden en te kwantificeren deze modellen.

Modellen van bot metastase

Source: Lim, M., et al. Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (2022)In this video, an anesthetized mouse undergoes a surgical procedure in which cancer cells are injected into the common carotid artery (CCA) to facilitate targeted delivery to the brain. The procedure involves precise suturing and manipulation of the carotid arteries to direct the injected cells toward the internal carotid artery (ICA), promoting tumor formation in the brain...

Modeling Brain Tumor Metastasis via Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Implantatie van autologe en allogene bottransplantaten, vormen aanvaarde benaderingen tot grote craniofaciale botverlies te behandelen. Toch is het effect van transplantaat samenstelling op de interactie tussen neovascularisatie, celdifferentiatie en botvorming is onduidelijk. We presenteren een multimodale beeldvorming protocol gericht op de angiogenese-osteogenese afhankelijkheid van het transplantaat nabijheid helderen.

Computed Tomography en optische beeldvorming van Osteogenesis-angiogenese Koppeling te beoordelen Integratie van schedelbot Autografts en Allografts

Er werd een chirurgische procedure ontwikkeld om mamma-tumorcellen via injectie in de poortader in de muizenlever af te leveren. Dit model maakt onderzoek naar late stadia van levermetastase mogelijk bij een volledig immuuncompetente gastheer, inclusief extravasatie van tumorcellen, zaaien, overleven en metastatische uitgroei in de lever.

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Intracraniale hersenen metastase modellering wordt gecompliceerd door een onvermogen om tumorgrootte en reactie op de behandeling met nauwkeurige en tijdige methoden te controleren. De gepresenteerde methodologie paren intracraniale tumor injectie met magnetische resonantie imaging analyse, die wanneer gecombineerd, cultiveert nauwkeurige en consistente injecties, verbeterde dier monitoring, en nauwkeurige tumor volume metingen.

Modellering van hersenmetastasen door middel van intracraniale injectie en magnetische resonantie beeldvorming

Botmetastasemodellen ontwikkelen metastase niet uniform of met een 100% incidentie. Directe intra-osseuze tumorcelinjectie kan leiden tot embolisatie van de long. We presenteren onze techniek voor het modelleren van primaire bottumoren en botmetastase met behulp van solide tumortransplantaatimplantatie in bot, wat leidt tot reproduceerbare transplantatie en groei.

Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

We beschrijven een xenograft muismodel van borstkanker hersenmetastase gegenereerd via staart-ader injectie van een endogene HER2-versterkte inflammatoire borstkankercellijn.

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Hier presenteren we een protocol voor de intra-cardiale injectie van menselijke prostaatkankercellen om een muismodel met botmetastaselaesies te genereren.

Intra-cardiale injectie van menselijke prostaatkankercellen om een botmetastase xenograft muismodel te creëren

De stereotactische intracraniële injectietechniek maakt precieze en gelokaliseerde implantatie van tumorcellen in de muiscortex mogelijk, waardoor het een krachtig model is voor het bestuderen van metastatische kolonisatie van de hersenen.

Modellering van hersenmetastase: gestandaardiseerde analyse van metastatische kolonisatie en histologische groeipatronen door stereotactische intracorticale injectie

Leer intra-iliaca injectie voor efficiënte modellering van botmetastase bij muizen. Deze techniek minimaliseert weefselschade en helpt onderzoekers bij het bestuderen van borstkankercelinteracties in het botmicroklimaat.

Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Meer video's verkennen