Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase
26 september 2016
Dit manuscript beschrijft de gedetailleerde procedure van intra-iliacale arteriële (IIA) injectie, een techniek om kankercellen specifiek af te leveren aan weefsels van de achterpoten, inclusief botten, om experimentele botmetastasen te creëren. Hoewel het oorspronkelijk werd vastgesteld met borsttumormodellen, kan dit protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar andere soorten kanker.
Het algemene doel van deze procedure is om experimentele botmetastasen te creëren door kankercellen rechtstreeks af te geven aan de achterpootweefsels, inclusief de botten, via injectie in de iliacale slagader. Deze methode kan ons helpen om de belangrijkste vragen te beantwoorden over de kolonisatie van borstkanker in de botten, vooral in de vroege fase van dit proces, hoe borstkankercellen interageren met micro-omgevingscellen in het bot. We hebben vandaag een iliacale arteriële injectie gedaan.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het op efficiënte en selectieve wijze een experimenteel microscopisch botmetastatismodel voor verschillende kankersoorten kan creëren zonder lokale weefselschade te veroorzaken. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het vinden van een nauwkeurige injectie, de iliacale arteriële injectiepositie onder de microscoop, oefening kan vergen om een injectiesuccespercentage van meer dan negentig procent te bereiken. Begin met het bevestigen van het juiste niveau van sedatie door de teen van een muis van vijf tot zes weken oud en twintig gram te knijpen.
Na het aanbrengen van oogzalf, veegt u het geschoren rechter liesgebied meerdere keren af met opeenvolgende, steriele, met 70% isopropylethanol doordrenkte wattenstaafjes, gevolgd door een chirurgische scrub met betadine. Bedek vervolgens de hele muis met een steriele drape. Gebruik vervolgens een steriele nummer tien koolstofstaal mesjes en een nummer drie handvat om een snede van één tot 1,2 centimeter in de huid te maken tussen de vierde en vijfde tepels in de onderbuik.
En breng het dier over onder een standaard tafeldissectiemicroscoop. Onder de 4X objectief, steekt u stompe scheidingstangjes in de snede tussen het vetweefsel en het peritoneum, en duwt u de weefsels aan beide kanten naar buiten om de iliacale bloedvaten en zenuwen te onthullen. Gebruik vervolgens rechte, fijne tangjes om het bindweefsel tussen de bloedvaten en de zenuw die het dichtst bij de bloedvaten ligt te doorbreken.
Schuif vervolgens hoekige tangjes door het bindweefsel en onder de iliacale bloedvaten, terwijl u de rechte tangjes in het bindweefsel aan de andere kant van de bloedvaten steekt om de hoekige tangjes door het weefsel te leiden. We raden aan om de iliacale rand en slagader als een bundel te scheiden en op te tillen voor deze stap. Hoewel de tumorcellen alleen in de slagader worden geïnjecteerd, bespaart het isoleren van beide bloedvaten samen tijd en moeite.
Zodra de hoekige tangjes op hun plaats zijn, scheidt u verder de iliacale ader en slagader van het omliggende weefsel, terwijl u de bloedvaten bovenop de hoekige tangjes houdt tijdens de dissectie. Wanneer de bloedvaten duidelijk zijn, gebruikt u de rechte tangjes om het uiteinde van een 4-0 zijden naalddraad naar de hoekige tangjes te brengen en trekt u de naalddraad langzaam en voorzichtig onder de bloedvaten door. Beide iliacale gewone ader en slagader moeten vervolgens door de naalddraad worden vastgehouden.
Wanneer de bloedvaten klaar zijn, pipet de tumorcellen een aantal keer op en neer om ze op te schorsen in een enkele celoplossing en om eventuele klonten te breken. Aspibeer vervolgens 100 microliter cellen per muis in een insulinesyringe van 31 gauge. Schuif nu de hoekige tangjes terug onder de bloedvaten met behulp van de naalddraad als gids en open de tangjes zodat de bloedvaten zachtjes op de punten rusten.
Met de andere hand steekt u de naaldpunt met de afgesneden zijde naar boven in het lumen van het deel van de slagader tussen de punten van de tangjes. Druk langzaam op de zuiger om de cellen te injecteren. De celsuspensie zal het bloed door het bloedvat spoelen.
Wanneer alle cellen zijn afgegeven, verwijdert u voorzichtig de naald en houdt u de bloedvaten op de tangjes om bloedingen te voorkomen. Trek vervolgens de naalddraad weg. Verwijder tenslotte snel de tangjes en druk een wattenstaafje op de snede gedurende vijf tot tien minuten om de bloeding te stoppen.
Hier wordt een representatief bioluminescentie beeld van het hele dier getoond na injectie in de iliacale slagader van vijf maal 10 tot de vijfde GFP luciferine-gelabelde MCF-7 borstkankercellen gevolgd door toediening van d-luciferine door retro-orbitale sinus injectie. Op dag 14 na injectie werd een sterk bioluminescentie signaal verkregen van de iliacale slagader geïnjecteerde achterste bot, maar niet van het contralaterale controlebot, wat de specifieke lokalisatie van de geïnjecteerde cellen bevestigt. Sectie van een H&E kleuring van de tumordragende botten toonde ook een compacte, kobbelstenen-achtige celpopulatie met grote kernen, indicatief voor microscopische MCF-7 metastatische laesies in het botweefsel 14 dagen na injectie in de iliacale slagader.
Immunoflurescente kleuring van de botsecties onthulde ook een vermenging van de MCF-7 cellen met osteoblasten en preosteoblasten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in tien tot vijftien minuten worden voltooid. Na het volgen van deze procedures kunt u andere methoden gebruiken om aanvullende vragen te beantwoorden.
We kunnen bijvoorbeeld RNA-Seq gebruiken om de micro-omgevingscellen in de metastase-nis te profileren en deze te vergelijken met normale cellen. Deze techniek biedt een manier voor borstkankeronderzoekers en prostaatkankeronderzoekers om botmicrometastasen bij dieren te bestuderen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een borstkankerbotmetastasemodel kunt opzetten door injectie in de iliacale slagader.
Neem alstublieft passende voorzorgsmaatregelen omdat werken met ketamine en xylazine uiterst gevaarlijk kan zijn.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de injectietechniek in de arteria iliaca interna (IIA) voor het toedienen van kankercellen naar weefsels in de achterste ledematen, waaronder botten, om experimentele botmetastasen te induceren. Deze methode is bijzonder nuttig voor het bestuderen van interacties tussen borstkankercellen en de botmicro-omgeving.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Experimentele Technieken
Achtergrond
- Botmetastasering is een veelvoorkomende complicatie bij kankerpatiënten.
- Inzicht in de mechanismen van kolonisatie van kankercellen in het bot is cruciaal voor de ontwikkeling van therapieën.
- De injectiemethode via de arteria iliaca interna maakt gerichte toediening van kankercellen mogelijk.
- Deze techniek minimaliseert lokale weefselschade in vergelijking met andere methoden.
Doel van de studie
- Om een model te vestigen voor het bestuderen van botmetastasen.
- Om de interacties tussen borstkankercellen en cellen van de botmicro-omgeving te onderzoeken.
- Om de nauwkeurigheid en het succespercentage van de injectietechniek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Intra-iliacale arterie-injectie van kankercellen.
- Gebruik van een muismodel van vijf tot zes weken oud.
- Controleren van de sedatiegraad via een teenknijptest.
- Oefenen van injectietechnieken om hoge succespercentages te bereiken.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt een efficiënte vestiging van botmetastase-modellen mogelijk.
- Met oefening kunnen hoge succespercentages worden behaald.
- Bij deze methode wordt minimale lokale weefselschade waargenomen.
- Er wordt inzicht verkregen in de vroege fasen van kolonisatie door borstkankercellen.
Conclusies
- De intra-iliacale arterie-injectie is een waardevolle tool voor kankeronderzoek.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse kankertypen naast borstkanker.
- Verdere studies kunnen het begrip van interacties tussen kanker en bot verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het tot stand brengen van betrouwbare modellen voor botmetastasen in een vroeg stadium blijft een kritische uitdaging in de oncologische geneesmiddelenontwikkeling, in het bijzonder voor de evaluatie van therapeutische interventies die gericht zijn op micrometastatische kolonisatie. De injectietechniek in de arteria iliaca interna maakt spatiotemporeel gesynchroniseerde verspreiding van kankercellen naar de botten van de achterpoten mogelijk, wat een robuuste kwantificering van gedissemineerde tumorcellen ondersteunt en verwarrende ontstekingsreacties door procedurele weefselschade vermindert. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische studies door continue monitoring van indolente botlaesies mogelijk te maken zonder systemische orgaanmetastasen, waardoor de translationele relevantie van botmetastasemodellen voor targetvalidatie en leadidentificatie wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door vroege interacties van kankercellen met componenten van de botmicro-omgeving, zoals osteoblasten en preosteoblasten, te modelleren.
- Operationele waarde: Biedt een selectieve en efficiënte route voor het afleveren van kankercellen in de achterpootbeenderen, wat zorgt voor een consistente generatie van modellen over experimentele cohorten heen.
- Strategische waarde: Ondersteunt de mechanistische risicoreductie van botmetastase-paden door visualisatie van micrometastatische progressie van enkelvoudige cellen naar multicellulaire laesies via bioluminescente en histologische read-outs.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare resultaten, zoals bioluminescentie-signaalintensiteit en histologische laesiedichtheid, waardoor een gestandaardiseerde beoordeling van de metastatische last mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Voorkomt lokale weefselschade en daarmee samenhangende storende factoren door wondgenezing, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert en de variabiliteit in downstream-analyses vermindert.
- Strategische waarde: Produceert ziekterelelevante systemen met minimale off-target orgaanmetastasen, wat langere observatievensters mogelijk maakt voor dosis-respons- en timingsstudies in screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door de progressie van gedissemineerde tumorcellen naar micrometastasen in het bot vast te leggen, wat een belangrijk klinisch knelpunt vormt.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale beeldvorming en eindpuntanalyses zoals H&E- en immunofluorescentiekleuringen te ondersteunen.
- Strategische waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door vroege efficiëntiesignalen te verschaffen voor verbindingen die de interactie tussen kanker en stroma of de nichevorming in de botmicro-omgeving verstoren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode voor intra-iliacale arterie-injectie past binnen het continuüm van ontdekking, van doelwitvalidatie via lead-identificatie tot preklinische effectiviteitstesten, in het bijzonder voor botgerichte therapieën waarbij vroege metastaseringmodellering bijdraagt aan het mechanistische inzicht en therapeutische vensters.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van interacties tussen kankercellen en de botmicro-omgeving door gecontroleerde aflevering van tumorcellen op skeletale locaties mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare biologische systemen met kwantitatieve bioluminescente en histopathologische read-outs die geschikt zijn voor high-content screeningplatformen.
- Analytics: Genereert meetbare afhankelijke variabelen, waaronder fotonenflux van bioluminescentie, laesieoppervlak in histologische coupes en co-lokalisatie-indices van tumor- en stromale cellen.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door de avasculaire micrometastatische fase te modelleren, die voorafgaat aan de osteolytische of osteoblastische progressie bij klinische botmetastasen.
- Enterprise Reuse: Representeert een gestandaardiseerde chirurgische techniek die aanpasbaar is voor verschillende kankertypen en laboratoria, wat de consistentie tussen projecten bij het genereren van botmetastasemodellen bevordert.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij target-validatie door ruis als gevolg van procedurele ontsteking te verminderen en een duidelijke toeschrijving van fenotypische veranderingen aan drugmechanismen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde anatomische referentiepunten en hechting-geleide vaatisolatie, waardoor operator-afhankelijke variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door vroege, orgaanspecifieke read-outs van metastasen te verschaffen, wat laatstadiumfalen door onvoorzien bot-tropisme vermindert.
- Impact op portfolio: Faciliteert risicogecorrigeerde prioritering van bot-getargette kandidaten door directe vergelijking van de metastatische last tussen behandelarmen in syngene modellen of xenograft-modellen mogelijk te maken.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist bekwaamheid in microsurgische technieken, waaronder vaatisolatie en hechting onder een dissectiemicroscoop.
- Afhankelijk van toegang tot steriele dissectiemicroscopen, fijne pincetten, insulinespuiten en apparatuur voor het bereiden van isotone celsuspensies.
- Vereist cross-team standaardisatie van anesthesieprotocollen (bijv. ketamine/xylazine) en postoperatieve monitoring om dierenwelzijn en modelconsistentie te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijsturen van het injectievolume en de celconcentratie op basis van de agressiviteit van de kankercellijn en de variabiliteit van de muizenstam.
- Praktische beperkingen omvatten een leercurve om een injectiesuccespercentage van >90% te bereiken en de noodzaak van aseptische technieken om peritoneale contaminatie tijdens de liesincisie te voorkomen.
