A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopie op hoge snelheid met meerdere kleuren
30 mei 2016
Dit artikel geeft een diepgaand overzicht van de assemblage en werking van een gestructureerde verlichtingsmicroscoop die werkt met totale interne reflectie fluorescentie verlichting (TIRF-SIM) om dynamische biologische processen met optische superresolutie in meerdere kleuren te beeldvormen.
Het algemene doel van dit protocol is om een gestructureerde verlichtingsmicroscoop te construeren en uit te lijnen die geschikt is voor superresolutie-beeldvorming van levende cellen met hoge snelheid, en die in TIRF- en optische sectiemodi kan werken met meerdere kleuren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celbiologie die momenteel niet kunnen worden beantwoord met behulp van standaard diffractie-beperkte TIRF-microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de snelle tijdsresolutie in vergelijking met andere superresolutiemicroscopietechnieken, waardoor het goed geschikt is voor het afbeelden van dynamische processen in levende cellen.
Hoewel dit protocol de stappen beschrijft voor de constructie van een TIRF-SIM-microscoop, is de setup flexibel en kan eenvoudig worden aangepast om beeldvormingsmodaliteiten zoals 3D-SIM, multifocale SIM en niet-lineaire SIM te implementeren. Om de excitatiepad voor een gestructureerde verlichtingsmicroscoop te rangschikken en uit te lijnen, markeer eerst de posities van de componenten op de optische tafel zoals hier aangegeven. Nadat de eerste dichroïsche spiegel, DM4, in de filtercube-toren van het microscoopkler is geplaatst, plaatst u de tweede dichroïsche spiegel, DM3, in een kinematische spiegelmontage van een inch en plaatst u deze op een brandpuntsafstand van de condensatorslens, L5.Vervolgens, om de optische toegang voor het systeem nauwkeurig te definiëren, verwijdert u het objectief, OB, uit de toren en schroeft u in plaats daarvan een uitlijngereedschap.
Gebruik vervolgens de dichroïsche spiegel DM3 en een tijdelijk uitlijnspiegel op de geschatte uiteindelijke locatie van de SLM om een gecollimeerde referentiebundel van laser een door het centrum van de gaten in de twee uitlijningsschijven te sturen. Gebruik drie spiegels en dichroïsche spiegel DM2 zoals hier afgebeeld, om de bundel van laser een naar de tijdelijke spiegel te leiden. Zodra de grove optische as is bepaald, verwijdert u het uitlijngereedschap.
Voeg vervolgens een iris toe aan de straal voordat deze de microscoop ingaat en centreer deze op de straal. Bevestig een stuk wit karton met een klein gat gecentreerd op de iris, en plaats vervolgens het objectief terug. Maak vervolgens iteratieve hoekaanpassingen aan de spiegels DM3 en op de SLM-positie om de terugkaatsing op het karton met de binnenkomende bundel te centreren.
Verwijder vervolgens tijdelijk het objectief en markeer de laserstip op het plafond om een referentiepositie te creëren. Plaats de buislens, L5, ongeveer op een brandpuntsafstand van het objectief, en monteer deze op een lineaire translatiebaan die is ingesteld om langs de richting van de referentiebundel te vertalen. Pas de positie en hoek van de buislens aan zodat de bundel die het objectief verlaat gecollimeerd is en de referentiestip op het plafond raakt.
Controleer of de lens loodrecht op de bundel staat door opnieuw de terugkaatsing te controleren met de iris en het witte karton. Verwijder vervolgens het objectief en plaats de tweede lens van de beeldafstandstelkijker, L4.Gebruik de lineaire translatiebaan om de positie en hoek van deze lens aan te passen om collimatie te behouden en om ervoor te zorgen dat de referentiebundel nog steeds de gemarkeerde plek op het plafond raakt. Plaats het objectief weer terug en plaats de eerste lens van de telescoop, L3.Pas de positie en hoek van deze lens aan om collimatie en niet-deflectie te garanderen zoals eerder beschreven.
Nadat de SLM-chip is gemonteerd volgens het tekstprotocol, met de lenzen uitgelijnd, plaatst u de SLM in plaats van de spiegel. Pas de positie van de SLM aan zodat de referentiebundel zich in het midden van de SLM-chip bevindt en pas de hoek aan zodat de bundel door de twee relaislenzen gaat. Controleer vervolgens of de referentiebundel nog steeds is gecentreerd op de gemarkeerde plek.
Monteer de vloeibare kristalvariabele vertrager, of LCVR, met de snelle as op 45 graden ten opzichte van de invallende polarisatie. Nadat u de uitlijning van de polarisatierotator hebt voltooid volgens het tekstprotocol, focust u met behulp van getransmitteerd licht door de oculairen op een reticle en fixeert u het objectief op deze positie. Bereid vervolgens een monolaag van fluorescerende kralen voor door een druppel van 100 nanometer meerkleurige kralen op een nummer 1,5 dekglas te verspreiden.
Laat de kralen drogen om de kralen aan het glas te adsorberen voordat u ze opnieuw onderdompelt in water. Plaats met behulp van immersieolie het kralenvoorbeeld op het objectief. Pas de positie van de camera fijn aan zodat de laag met fluorescerende kralen scherp staat.
Nadat u SIM-binaire rasterpatronen hebt gegenereerd als bitmapbestanden en ze hebt geüpload naar de SLM volgens het tekstprotocol, laadt u de SLM-besturingssoftware en klikt u op Verbinden. Klik in het Repertoire"tab op Laden"om het repertoirebestand te openen en controleer het aantal uitvoeringsorders in het bestand. Klik op Naar Board verzenden"om het repertoirebestand naar de SLM te uploaden.
Selecteer vervolgens het Status"tab en voer het nummer van de uitvoeringsorder in. Klik op Selecteren"om de uitvoeringsorder te wijzigen in de uitlijningsraster. Plaats een ruimtelijk masker, of SM, gemonteerd op een XY-trap in het straalpad op de brandpuntspositie van L3 en vertaal de positie ervan ten opzichte van de optische as zodat alleen de gewenste eerste orden worden doorgelaten.
Direct na de ruimtelijke filter zijn er slechts twee cirkelvormige bundels zichtbaar. Controleer het beeld van de laag met fluorescerende kralen op de camera. Als de twee cirkelvormige bundels niet overlappen zoals hier afgebeeld, dan positioneert u het steekproefvlak opnieuw, door de objectief en de camerapositie iteratief aan te passen.
Nadat u de focus hebt fijnafgesteld en het steekproefvlak hebt ingesteld volgens het tekstprotocol, bevestigt u TIRF-verlichting door bijvoorbeeld een oplossing van 10 micromolair rodamine 6G-kleurstof te focussen. Als de twee bundels onder de juiste TIRF-hoek vallen,
Overzicht
Dit artikel biedt een uitgebreide handleiding voor het bouwen en uitlijnen van een gestructureerde illuminatiemicroscoop voor snelle superresolutie-imaging van levende cellen met behulp van TIRF-SIM. Deze methode is voordelig voor het in beeld brengen van dynamische biologische processen in meerdere kleuren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
- Superresolutie-beeldvorming
Achtergrond
- Standaard TIRF-microscopie kent beperkingen bij het oplossen van dynamische processen.
- Superresolutietechnieken verbeteren de beelmogelijkheden.
- Gestructureerde illuminatiemicroscopie (SIM) biedt een snellere tijdsresolutie.
- Dit protocol maakt flexibele aanpassingen aan de microscoopopstelling mogelijk.
Doel van de studie
- Het construeren van een TIRF-SIM-microscoop voor geavanceerde beeldvorming.
- Het mogelijk maken van de studie naar biologische processen die een hoge temporele resolutie vereisen.
- Het bieden van een gedetailleerd protocol zodat onderzoekers de opstelling kunnen repliceren.
Gebruikte methoden
- Uitlijning van optische componenten, waaronder dichroïsche spiegels en lenzen.
- Gebruik van een vloeibare kristal variabele vertrager voor polarisatiecontrole.
- Preparatie van fluorescerende bead-monsters voor kalibratie.
- Implementatie van SLM-besturingssoftware voor patroongeneratie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle uitlijning van de TIRF-SIM-microscoop.
- Demonstratie van de beeldvormingsmogelijkheden met fluorescerende beads.
- Verificatie van de TIRF-verlichtingscondities.
- Vaststelling van een protocol voor toekomstige beeldvormingsstudies.
Conclusies
- De TIRF-SIM-opstelling maakt snelle beeldvorming van dynamische processen mogelijk.
- Met deze methode kunnen vragen in de celbiologie worden beantwoord die voorheen onbeantwoordbaar waren.
- De flexibiliteit van de opstelling maakt verschillende beeldvormingsmodaliteiten mogelijk.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Snelwaardige, multicolor superresolutie-beeldvorming voldoet aan de behoefte aan visualisatie van dynamische processen in live-cell assays, waardoor mechanistische risicoreductie van therapeutische targets mogelijk wordt door directe observatie van subcellulaire dynamiek. TIRF-SIM biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door eiwitinteracties op nanoschaal en trafficking-gebeurtenissen met temporele getrouwheid op te lossen, wat go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Deze mogelijkheid verbetert de assayontwikkeling voor fenotypische screening door kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste readouts te leveren die de betrouwbaarheid van targets vergroten en het aantal fout-positieven bij de identificatie van leads verminderen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de lokalisatie en dynamiek van eiwitten in levende cellen te visualiseren met een resolutie van 90-120 nm.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele validatie van targets door directe observatie van microtubuli-polymerisatie en depolymerisatie nabij de basale cortex.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in studies naar target engagement door subpopulaties van microtubuli en amyloïde fibrillen op te lossen met een verdubbelde laterale resolutie ten opzichte van de diffractielimieten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door kalibratie met fluorescerende bead-monolagen om referentiewaarden voor de resolutie vast te stellen.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid via gesynchroniseerde SLM-patroongeneratie, golflengtecontrole en camera-triggering voor consistente frame-acquisitie.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over verschillende excitatiegolflengten (488 nm, 640 nm) en imaging-modaliteiten, waaronder TIRF en optische sectiemodi.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt observationele ontdekkingen van subcellulaire structuren (bijv. emGFP-microtubuli, LifeAct-GFP) met preklinische validatie via contrastrijke superresolutie-beeldvorming.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door dynamische processen in levende cellen te visualiseren die onzichtbaar zijn voor standaard TIRF, wat de selectie van targets ondersteunt.
- Ziekte-relevant systeem: Demonstreert de toepasbaarheid op live-cell modellen, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt voor processen zoals microtubuli-dynamiek bij neurodegeneratie of kanker.
Integratie van Pipeline & Workflow
Plaatst de methode binnen de fase van vroege ontdekking tot aan de identificatie van leadverbindingen, waarbij nanoschaalresolutie van dynamische processen bijdraagt aan doelwitvalidatie en de gereedheid van assays voor compoundscreening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en de verduidelijking van signaalpaden door het oplossen van eiwitdistributies en dynamiek op nanoschaal in levende celmodellen.
- Screening: Maakt assays gereed voor gebruik via kwantitatieve imaging met een hoge beeldsnelheid (tot 10 Hz) en meerkleurencapaciteit voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert statistische output via gereconstrueerde superresolutiebeelden en validatie van de optische overdrachtsfunctie op basis van Fourier-transformatie voor de vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via ziekterelateerde imaging van subcellulaire structuren met hoog contrast en hoge resolutie.
- Enterprise Reuse: Positioneert het systeem als een herbruikbare capaciteit voor meerdere imagingmodaliteiten (TIRF-SIM, 3D-SIM, multifocale SIM) over diverse projecten heen.
Operationele impact en impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij live-cell imaging.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via geautomatiseerde controle van polarisatie, ruimtelijke structuur en golflengtesynchronisatie.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroege visualisatie van targetdynamiek.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over voortzetting op basis van directe observatie van het gedrag van therapeutische targets in fysiologisch relevante contexten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in optische uitlijning, laserveiligheid (Klasse 3B) en SLM-gebaseerde patroongeneratie voor gestructureerde verlichting.
- Vereist instrumentatie voor polarisatiecontrole (vloeibaar-kristal variabele vertrager), triggering van hogesnelheidscamera's en integratie van lasers met meerdere golflengten.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de opstelling van de optische tafel, positionering van componenten en kalibratieprotocollen met gebruik van monolagen van fluorescerende bolletjes.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende monstertypen, aangezien monsters met een laag contrast geen hoge-resolutie-informatie bevatten, behalve bij de membraanranden.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van een hoog modulatiecontrast voor succesvolle SIM-beeldvorming en precieze bundeluitlijning bij de diafragma's van de objectieflenzen.
