Name: Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer hoe je uitgelijnde en willekeurige 3D-collageenmatrices bereidt voor het bestuderen van celmigratie en celgedrag in een driedimensionale omgeving. Deze methode maakt kosteneffectief onderzoek naar cel-ECM-interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag subsidie ​​nummers UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 en T32-GM008692-18 erkennen voor de financiering van dit werk. We hebben ook erkennen Jeremy Bredfelt en Yuming Liu loci voor de ontwikkeling van en bijstand bij de CT-FIRE analyse.

1. neutralisering, verdunning en polymerisatie van Collageen Oplossingen voor 3D-onderzoek en Cellular Contractie Testen <ol><li> Op ijs in steriele weefselkweek kap, neutraliseren collageen (1: 1) met steriele, ijskoude 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in een 15 ml conische buis. Meng goed met plastic pipet totdat oplossing homogeen is en het mengen van de wervelingen zijn niet meer zichtbaar. Wees voorzichtig luchtbellen te introduceren tijdens het mengproces. Bewaar kort op ijs. </li><li> Verdun geneutraliseerd collageen om de geschikte concentratie met celmedium (zoals RPMI, DMEM, etc.). <ol><li> Om de hoeveelheid geneutraliseerde collageen nodig is om make-up de gewenste collageen concentratie te berekenen, gebruikt u de vergelijking N = (D * V) / (S / 2), waarbij N hoeveelheid geneutraliseerde collageen nodig is, D de gewenste collageen concentratie, V het eindvolume van de gewenste collageenconcentratie en S tHij beginvoorraad collageen concentratie. </li><li> Breng de hoeveelheid geneutraliseerde collageen volume door toevoegen van een cel en cel mediaoplossing. Meng goed en op te slaan op het ijs pas klaar om te werpen. <ol><li> Voorbeeld: Voor een 2 mg / ml gel in een 1 ml gel volume (typisch volume voor een gel gegoten in 6 putjes of 50 mm glazen onderste schaal), eerst vermenigvuldig de gewenste concentratie (2 mg / ml) van het gewenste eindvolume (1 ml). Neem dit nummer (2 mg) en verdeel het met de helft van de voorraad concentratie worden vermeld op de fles (9,49 mg / ml). In dit geval, 0,42 ml van de geneutraliseerde collageen verdund met 0,58 ml medium / celmengsel. </li></ol></li></ol></li><li> Pipet de ijskoude collageen / cel / Media mengsel in hetzij een niet-weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes of 50 mm glazen onderste schaal. Gebruik pipet tip om gelijkmatig verspreid de oplossing. Opmerking: Het is belangrijk om een ​​niet-weefselkweek behandelde plaat gebruikt om de aanhechting of groei van de cellen buiten de collag minimaliserenen gel. </li><li> Laten polymeriseren bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10-15 min. De gels moet ondoorzichtige draaien bij polymerisatie. </li><li> Nadat het ondoorzichtig is geworden, zet bord of schaal tot 37 ° C voor een extra 45 - 60 min om de polymerisatie te voltooien. </li><li> Na 45 - 60 minuten, voeg 2-3 ml van de media en gels los van zijden van de put door het uitvoeren van een p200 pipet tip rond perimeter van goed of gerecht. Swirl schotel voorzichtig aan de gel vrij te geven. De collageengel worden zwevend in media. </li></ol> 2. Western Blotting, Cell Morphogenesis en Gel Gontractility Assay <ol><li> Om eiwitniveaus, morfologie of cellulaire contractiliteit toetsen aan stijfheid ECM, eerst gieten collageen gels volgens 1,1-1,6 geënt met cellen voor 7-10 dagen assay. Bepaal elke cellijn seeding rate empirisch afhankelijk van de groeisnelheid en confluentie. Voor een 10 daagse test kan de zaaidichtheid variëren van 20.000 - 100.000 cellen / gel. </li><li> Metencel contractiliteit, meet de diameter gel met behulp van een liniaal of een camera elke 24 uur of op het geschikte tijdsinterval. Noot: Bovendien kunnen overeenkomstige afbeeldingen vanuit een microscoop worden onderzocht op morfologische karakteristieke eigenschappen van de cellijn geënt in de gel, zoals acini structuren, epitheliale buisjes, cellulaire uitsteeksels en lameliapodia. </li><li> Om eiwitten te beoordelen, lyseren de gels in RIPA buffer en werkwijze voor Western blot analyse van eiwitten van belang zoals is beschreven in Wozniak et al. 17 en Gallagher et al. 18. <ol><li> Belangrijk: In vergelijkingen van contractiliteit tussen cellijnen normaliseren contractiliteit totale DNA, die kan worden afgeleid uit de gels zoals beschreven door Lui et al 19, of een onveranderlijke, schoonmaak eiwit (histonen, GAPDH, etc.) door Western. blotanalyse, zoals beschreven in Wozniak et al. 17 en Gallagher et al. 18. Als het tellen van cellen in de gel met behulp van een hemocytometer, zorg ervoor om het aantal cellen te normaliseren tot de totale gel gebied als de aanbestedende gel zal zich concentreren cellen. </li></ol></li><li> Feed gels elke 3-4 dagen door het verwijderen van 1 ml medium en te vervangen door 1 ml vers medium. Zorg ervoor gels voeren na de meting de toevoeging van vers medium / serum genomen zal een piek in contractiliteit veroorzaken. </li></ol> 3. Productie van PDMS Microkanalen voor collageenvezels Alignment Opmerking: Om uitgelijnd collageen matrices te genereren, een mal voor PDMS microkanalen (Figuur 2A) vereist een SU-8 silicium meester gemaakt via soft-lithografie 15. <ol><li> Om PDMS kanalen te maken, meng PDMS grondig in een beschikbare kop met een ambachtelijke stok. Voor een 6 inch siliconen meester, meng 20 g elastomeer basis met 2 g verharder. </li><li> De gas de PDMS mengsel door het plaatsen van de wegwerpbare beker in een vacuümkamer onder een vacuümdruk van550 mm Hg. De gas-1 - 1,5 uur. </li><li> Terwijl de-gasvorming het PDMS, de voorbereiding van de siliconen meester voor het gieten. Bereid door het plaatsen van een schone lei aan transparantie film op een kookplaat, gevolgd door de siliconen meester. Zorg ervoor dat het microkanaal mal naar boven gericht. LET OP: Tijdens het PDMS gieten en uitharden, zal de siliconen meester worden ingeklemd tussen twee vellen transparanten. </li><li> Na 1-1,5 uur, verwijder de-de vergaste PDMS van de vacuümkamer, en langzaam giet over de siliconen meester. BELANGRIJK: Vermijd luchtbellen. Ga verder te gieten in het centrum van de kapitein, en laat de zwaartekracht om het gelijkmatig verspreid. LET OP: De PDMS daling hoeft niet helemaal uit te breiden tot de rand van de meester. </li><li> Na PDMS heeft op de master gegoten, breng dan een tweede vel transparanten bovenop de siliconen meester en PDMS. Voorzichtig rollen de tweede transparant vel naar beneden op de top van de PDMS / siliconen meester om luchtbellen te voorkomen. Haast je niet. PDMS moet nu gelijkmatig verdeeld over meester. </li><li> Plaats voorzichtig een rubber op de top van de transparantie, gevolgd door een 1/8 &quot;acryl plaat. </li><li> Voeg drie 10 lb gewichten op de bovenkant van de acryl plaat. Aanvankelijk zal de gewichten &quot;zweven&quot;. Hen in staat stellen om zich te vestigen en te stabiliseren alvorens verder te gaan. </li><li> Stel verwarmingsplaat temperatuur 70 ° C en genezing PDMS 4 uur. Laat afkoelen minimaal nog 1 uur voor storen. </li><li> Verwijder voorzichtig top van elk transparant uit de wafer, en de kanalen te verwijderen met een pincet. </li><li> Winkel in stofvrije gerecht pas klaar voor gebruik. </li></ol> 4. Prepping PDMS Microkanalen voor gebruik <ol><li> Plaats kanalen ondersteboven op nieuwe, schone transparanten. Reinig alle poorten (Figuur 2b) met cirkelvormige beweging met een scherpe tang. Verwijder alle fragmenten van PDMS. </li><li> Clean kanalen door gebruik te maken van een stuk van de verpakking tape als een tack doek. Toepassen tape aan de oppervlakte van de bank (kleverige kant naar boven), en stel kanaal on top. Druk naar beneden op kanalen met ronde uiteinde van een tang om goed contact te waarborgen. Verwijder en herhaal aan beide kanten tot zichtbare puin is verwijderd. </li><li> Transfer schoongemaakt, klaargestoomd PDMS kanalen in een 50 ml conische met 70% EtOH. Vortex op maximale snelheid gedurende 30 sec. Gooi EtOH en te vervangen door vers 70% EtOH. Store in 70% EtOH totdat klaar voor gebruik. </li><li> In weefselkweek kap en met behulp van aseptische technieken, de overdracht van de PDMS kanalen om een ​​schone en steriele dekking van glas of glazen bodem gerechten. Zet het kanaal naar boven en UV behandelen totdat EtOH is verdampt. </li><li> Eenmaal droog is, draait u de PDMS, zodat de kanalen naar beneden wijzen in de richting van dekglaasje. Druk op de PDMS kanaal naar beneden op het glas om een ​​goede afdichting te maken. Voeg een patch van steriel PDMS te dekken / sluiten het centrum (poort B, Figuur 2b). Goed laten drogen alvorens verder te gaan. </li><li> Voorbekleding de binnenzijde van het kanaal met 10 ug / ml collageen in steriel water. Bekleden, plaats een 100 ul druppel op de top van een channel, en trekken door met vacuüm. Na 1 uur bij 37 ° C, overdrachtskanalen gevuld met collageen bekledingsoplossing een koelkast. Chill gedurende ongeveer 15-30 min. </li><li> Verwijderen collageen bekledingsoplossing met zuigpomp of pipet, en beginnen collageenpreparaat. </li></ol> 5. Collageen Voorbereidingen voor gebruik in Microkanalen <ol><li> Op ijs, te neutraliseren collageen (1: 1) met ijskoude 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4. Meng grondig tot homogeen (Voor meer details, zie paragraaf 1.1). </li><li> Verdun geneutraliseerde collageen naar de juiste concentraties met mobiele media (Voor meer details, zie paragraaf 1.2). Incubeer gedurende 15 min op ijs. </li><li> Tegelijkertijd, chill gemonteerd kanalen op ijs. Opmerking: Het doel is om alle componenten voor het kanaal proces bij 4 ° C of lager. Collageen kiemvormingstemperatuur en tijd zijn belangrijke parameters om de polymerisatiewerkwijze en kan het uitgangspunt voor verdere optimalisatie, indien nodig. </li><li> CounT-cellen met een hemacytometer en resuspendeer de juiste zaaidichtheid op dit moment. Gemakshalve berekeningen mengen met 1-3.000.000 cellen / ml. (Voor meer details, zie ook paragraaf 2.1). </li><li> Zodra cellen zijn geteld en 15 minuten zijn verstreken, gaat u verder met collageen gieten. </li></ol> 6. Gieten uitgelijnd en Random Collageen Microkanalen <ol><li> Alvorens collageen via kanalen, aan te passen en stel onderdruk met een inline vacuüm regulator. Onderdruk levert de kracht voor inductie en regelen de snelheid van collageen stroom, die de mate van overeenkomst bepaalt. <ol><li> Voor willekeurige of niet-gebonden matrices, gebruik van een breed kanaal (3 mm breed x 200 micrometer lang) met een vacuüm druk van 10 mm Hg of minder. </li><li> Voor uitgelijnd matrices Gebruik smal kanaal (1 mm breed x 200 micrometer lang) met een vacuüm druk van 60 mm Hg of hoger. </li></ol></li><li> Verwijder gemonteerd kanaal uit ijs en te plaatsen op schoon, ontsmet oppervlak van laminaire stroming hood. </li><li> Werk snel en laad 120-150 ul van geneutraliseerd collageen in de haven A (Figuur 2b). </li><li> Trek collageen door het kanaal door het plaatsen van een 25 ml pipet verbonden aan de vacuümleiding via poort c (Figuur 2b). Trek collageen door middel van in één uniforme beweging. BELANGRIJK: Voor willekeurige of niet-gebonden matrices, trek collageen langzaam over kanaal (ongeveer 0,5-1 mm per seconde), en stoppen zodra het einde bereikt. Voor uitgelijnd matrices, trek het collageen in meer sneller, maar zorg om luchtbellen te voorkomen. </li><li> Haal overtollige collageen uit de havenregio met P200 Pipetman of afzuiger. </li><li> Plaats steriel PDMS vlekken op beide poorten A en C. Alle poorten moet nu worden gedekt. </li><li> Na 2-3 minuten, verwijder centrum PDMS patch (poort B) en voeg 2-3 pi van de cellen (5-10.000 cellen) in het centrum van de haven. Laat gedeeltelijk polymeriseren (ondoorzichtig) bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 10 - 15 min. </li><li> na 10- 15 min, transfer naar 37 ° C nog 15 - 30 minuten om polymerisatie te voltooien. Verwijder PDMS covers en media toe te voegen aan volledig te bedekken het kanaal en kweekcellen als dat nodig is. Cellen kunnen worden gevoed door het verwijderen van een oude ml media en vervangen door een nieuwe ml media. </li></ol>

<ol><li>Conklin, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+collagen+is+a+prognostic+signature+for+survival+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma.</a> Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, 38(2006).</li>
<li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+collagen+alignment+limits+protrusions+to+enhance+breast+cancer+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence.</a> Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).</li>
<li>Even-Ram, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+3D+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in 3D matrix.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
<li>Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK-generated+contractility+regulates+breast+epithelial+cell+differentiation+in+response+to+the+physical+properties+of+a+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix.</a> J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype%2C+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li>
<li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).</li>
<li>Guo, C., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+and+magnetic+field+induced+collagen+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Flow and magnetic field induced collagen alignment.</a> Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3-dimensional+collagen+matrix+polymerization+for+reproducible+human+mammary+fibroblast+cell+culture+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices.</a> Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).</li>
<li>Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+alignment+of+collagen+fibers+for+in+vitro+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture.</a> Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).</li>
<li>Wozniak, M. A., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+three-dimensional+collagen+gels+to+study+mechanotransduction+in+T47D+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells.</a> Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGallagher%2C+S+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).</li>
<li>Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+X+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).</li>
<li>Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+mechanical+properties+of+three-dimensional+type+I+collagen+extracellular+matrices+with+varied+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure.</a> J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).</li>
<li>Bredfeldt, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+segmentation+of+collagen+fibers+from+second-harmonic+generation+images+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer.</a> J Biomed Opt. 19, 16007(2014).</li>
<li>Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+model+of+ductal+carcinoma+in+situ+with+3D%2C+organotypic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure.</a> BMC Cancer. 15, 12(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

3D collageen gels zijn een waardevolle aanvulling op onze gereedschapskist om te begrijpen hoe cellen interpreteren en te reageren op de lokale micro-omgeving. Dit manuscript een basisprotocol bedoeld inbedden van cellen in een 3D collageenmatrix en reproduceerbaar produceren matrices met willekeurige of uitgelijnd collageenvezels. Beide protocollen werken als flexibele platforms waarbij verschillende isovormen collageen, verknopingsmiddelen of andere matrixeiwitten mogelijk bij de polymerisatie worden toegevoegd. Het i...

Veel cellulaire processen zijn uitvoerig bestudeerd in 2 dimensies, waardoor een collectieve kennis van basismechanismen van celsignalering is ontstaan. Deze studies negeren echter belangrijke cellulaire signalen die worden ontvangen van de structurele en mechanische eigenschappen van de lokale cellulaire micro-omgeving en extracellulaire matrix (ECM). Om beter te begrijpen hoe cellen interageren binnen een fysiologisch context, is het belangrijk om ze te bestuderen in 3-dimensionale (3D) assays. De ECM voor deze 3D-assays kan ofwel cel-afkomstig zijn of worden gereconstrueerd uit gezuiverde eiwitten. Ongeacht de bron van de ECM, zijn 3D-matrix assays onmisbaar gebleken voor het begrijpen hoe cellen navigeren en interageren binnen de fysiologische wereld. Bijvoorbeeld, cellen gekweekt in 3D-matrices vertonen verschillende bewegingsmodi die afhankelijk zijn van de mechanische aard van hun omringende ECM, wat niet wordt waargenomen in 2D-experimenten4-6. Bovendien hebben cellen gekweekt in 3D minder en minder uitgesproken stressvezels en focale adhesies dan hun tegenhangers die op harde oppervlakken zoals glas of plastic worden gekweekt7. 
De belangrijkheid van contextuele 3D-assays is echter niet beperkt tot celmigratie. Sommige andere celsignaleringsgebeurtenissen kunnen alleen worden onderzocht door het gebruik van 3D-assays. Gedurende weefsel- en celdifferentiatie, geeft de stijfheid van de extracellulaire omgeving en ECM signalen die morfologische gebeurtenissen kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, tubulogênes van borstpiteel vindt alleen plaats in 3D-matrices met lage stijfheid, maar niet in stijve matrices of op 2D-substraten8,9. Wanneer gekweekt binnen stijve 3D-matrices, nemen dezezelfde epitheelcellen een abnormaal fenotype aan met verhoogde proliferatie en celmembraanuiteinden, gedreven door veranderde FAK en ERK-signalering10. Veel andere signaalroutes en cellulaire processen zijn bekend om op een vergelijkbare manier te worden beïnvloed door de stijfheid van de lokale cellulaire omgeving, en deze signaalcascades benadrukken het belang van het onderzoeken van signaalgebeurtenissen en cellulair fenotype in de context van geschikte lokale mechanische eigenschappen van een 3D-ECM. 
Collagene I is een bijzonder relevant eiwit om te gebruiken voor in vitro studies, aangezien het de meest voorkomende component van de ECM is en verantwoordelijk is voor veel van de mechanische eigenschappen van de cellulaire micro-omgeving. Hoewel het oorspronkelijk werd beschouwd als slechts een structureel eiwit, is zijn rol nu bekend als veel complexer. Collagevezelsamenstelling, architectuur, oriëntatie, dichtheid en stijfheid bieden allemaal een geconcentreerd milieu van signaalinformatie5. Tijdens de progressie van bepaalde ziekten, zoals chronische ontsteking en tumorigenesis, wordt het collagevetweewerking dramatisch geremodelleerd2,11. Meer specifiek in borstkanker, begeleiden verhoogde collageenafzetting en weefselstijfheid en dragen waarschijnlijk bij aan tumorprogressie. In deze vroege tumoren lijkt het verstijfd collagevetweewerking gespannen en meer gealigneerd te zijn, zodat de meeste vezels het groeiende tumor omsluiten2. Terwijl de tumor progressieert, blijft het collageen reorganiseren, en gebieden van het fibrillaire netwerk worden loodrecht op de tumorgrens georiënteerd2,12. Loodrechte uitlijning dient als een prognostische biomarker waarbij deze patiënten een slechtere ziektevrije progressie en algemene overleving hebben1. Een verklaring voor deze correlatie is dat de slechte resultaten een gevolg zijn van verhoogde verspreiding van tumorcellen via aanhoudende celmigratie in uitgelijnde collageennetwerken3. 
Om te begrijpen hoe cellen specifiek reageren op de uitlijning en organisatie die wordt waargenomen in tumorprogressie, is het noodzakelijk om zowel willekeurige als uitgelijnde 3D-collagene matrices voor experimenten te genereren. Er zijn drie basismethodologieën om uitlijning binnen fibrillaire netwerken te induceren. De eerste techniek maakt gebruik van een spannings-inducerend apparaat waarbij het collageen tussen twee punten wordt samengetrokken of uitgerekt om uitlijning te genereren. Vezels parallel aan de krachtas worden strak getrokken terwijl vezels loodrecht op de as worden samengedrukt en gebogen. Hoewel spannings-geïnduceerde technieken typisch een uitstekende uitlijning bieden, vereist deze aanpak omvangrijke apparatuur die niet gemakkelijk kan worden aangepast aan veel platforms3,13. Als alternatief kan cel-geïnduceerde spanning worden gecreëerd door gelocaliseerde pluggen van cellen te plaatsen die vervolgens samentrekken en het collageen uitlijnen13. Deze methode heeft het probleem dat deze variabel is, aangezien veel parameters kunnen veranderen. De tweede methode maakt gebruik van magnetische kralen en een magnetisch veld tijdens polymerisatie om collageenuitlijning te induceren13,14. Goede resultaten kunnen worden verkregen met deze methode met ongesofisticeerd apparatuur, maar het vereist wel het gebruik van antilichamen of een andere methode om het polymeer te magnetiseren. Daarom kan het enigszins duur zijn om te gebruiken, en de stijfheid van het collageengel is mogelijk gewijzigd door de verhoogde verbindingen in het netwerk. Bovendien zijn de magnetische kralen die in dit proces worden gebruikt vaak autofluorescent, wat problematisch is voor beeldvormingsexperimenten. Ten slotte kan uitlijning worden gegenereerd door PDMS-microfluidische kanalen3,15,16. In deze methode wordt collageenuitlijning bereikt door polymeriserend collageen door kleine microfluïdische kanalen te laten stromen. Deze microfluïdische kanalen kunnen in een groot aantal ontwerpen worden gemaakt en zijn gemakkelijk aanpasbaar aan veel platforms. Bovendien zijn ze zeer economisch omdat zeer kleine hoeveelheden collageen en andere reagentia worden gebruikt vanwege hun kleine afmetingen.
Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het inbedden van cellen binnen een 3-dimensionale, fibrillaire collageenhydrogel. Bovendien wordt een meer geavanceerde techniek

<table><tbody><tr><td>High Concentration Rat Tail Collagen</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>SylGard184 elastomer kit</td><td>Corning</td><td>NC9285739</td><td>Elastomeer voor PDMS-kanalen</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310</td><td>Voor HEPES-neutralisatiebuffer</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Voor HEPES-neutralisatiebuffer</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td>Voor HEPES-neutralisatiebuffer</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374</td><td>Voor HEPES-neutralisatiebuffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Voor HEPES-neutralisatiebuffer</td></tr><tr><td>Levy Improved Neubauer Hemacytometer</td><td>Fisher</td><td>15170-208</td><td>celtelling</td></tr><tr><td>6-well non-tissue culture plate&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>50 mm glass bottom dish</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>Ontgassingskamer voor PDMS</td></tr><tr><td>transparency film&nbsp;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>Kunststof film voor het gieten van pdms-kanalen</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>HP141925</td><td>Hotplate voor het uitharden van PDMS-microkanalen</td></tr><tr><td>Vacuum regulator</td><td>Precision Medical</td><td>PM3100</td><td>Vacuümregelaar voor collageen-microkanalen</td></tr><tr><td>8" x 8" rubber sheet</td><td>Amazon - Rubber-Cal</td><td>Silicone - 60A</td><td>rubberen laag voor het gieten van PDMS-microkanaal</td></tr><tr><td>8" x 8" x 0.125" acrylic sheet</td><td>Amazon</td><td>Plexiglass sheets</td><td>voor het gieten van PDMS-microkanalen</td></tr><tr><td>10 lb weights</td><td>Amazon</td><td>CAP Barbell</td><td>voor het gieten van PDMS-microkanalen</td></tr><tr><td>15 ml Conical tubes</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical tubes</td><td>Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipets</td><td>Dot Scientific</td><td>229202B, 229206B, and 667225B</td><td>2&nbsp;ml, 5&nbsp;ml, en 25&nbsp;ml</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Fisher</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de 3d collageen gels en microkanalen voor de studie van 3d-interacties<em&gt; in vivo</em

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Histologisch gezien zijn de meeste cellulaire processen alleen in 2 dimensies bestudeerd. Hoewel deze studies informatief zijn geweest over algemene celsignaleringsmechanismen, negeren ze belangrijke cellulaire signalen die worden ontvangen van de structurele en mechanische eigenschappen van de lokale micro-omgeving en extracellulaire matrix (ECM). Om te begrijpen hoe cellen interageren binnen een fysiologische ECM, is het belangrijk om ze te bestuderen in de context van 3-dimensionale assays. Celmigratie, celdifferentiatie en celproliferatie zijn slechts enkele processen waarvan is aangetoond dat ze worden beïnvloed door lokale veranderingen in de mechanische eigenschappen van een 3-dimensionale ECM. Collageen I, een kernfibrillaire component van de ECM, is meer dan een eenvoudig structureel element van een weefsel. Onder normale omstandigheden, richten mechanische signalen van het collageennetwerk de morfologie en onderhouden cellulaire structuren. In zieke micro-omgevingen, zoals de tumormicro-omgeving, is het collageennetwerk vaak dramatisch geremodelleerd, wat een veranderde samenstelling, verhoogde afzetting en veranderde vezelorganisatie aantoont. Bij borstkanker is de mate van vezelarij belangrijk, omdat een toename van uitgelijnde vezels loodrecht op de tumorrand is gecorreleerd met een slechtere prognose van de patiënt1. Uitgelijnde collageenmatrices resulteren in verhoogde verspreiding van tumorcellen via aanhoudende migratie2,3. Het volgende is een eenvoudig protocol voor het inbedden van cellen in een 3-dimensionale, fibrillaire collageenhydrogel. Dit protocol is gemakkelijk aanpasbaar aan veel platformen en kan reproduceerbaar zowel uitgelijnde als willekeurige collageenmatrices genereren voor onderzoek naar celmigratie, celdeling en andere cellulaire processen in een instelbare, 3-dimensionale, fysiologische micro-omgeving.

Terwijl 3D assays kunnen worden uitgevoerd in dezelfde stijfheid van collageengel, variëren de gel stijfheid kan worden gebruikt om te bepalen hoe cellen reageren op mechanische veranderingen in de cellulaire micro-omgeving. Een stijve collageen hydrogel wordt gedefinieerd als een gel waarin de ingebedde cellen niet in staat ter plaatse aan de omliggende collageen. De intrinsieke contractiliteit van verschillende celtypen uniek, en dus is het het beste om te beginnen met een eenvoudige c...

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van uitgelijnde en willekeurige 3D-collageenmatrices, met als doel celmigratie of andere cellulaire processen te observeren in de context van een 3D-omgeving. Deze methode is ontworpen om collageenkenmerken vast te leggen die we terugvinden in echte weefsels, wat kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen, zoals de mechanismen die cellen gebruiken om een uitgelijnde of willekeurige extracellulaire matrix te herkennen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u de organisatie van de 3D-omgeving kunt manipuleren, cellen daarbinnen kunt afbeelden en dit kosteneffectief kunt doen met gangbaar beschikbare apparatuur.Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn met deze methode moeite omdat ze de collageenoplossing en de neutralisatiebuffer onvoldoende mengen en het collageen inconsistent door de kanalen trekken. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Brian Burkel, een senior wetenschapper in mijn laboratorium. Meng eerst het collageen en de HEPES-buffer grondig voordat u cellen en medium toevoegt om een juiste neutralisatie van het collageen te waarborgen.Voeg vervolgens de cellen en het medium toe aan het g

preparation-3d-collagen-gels-microchannels-for-study-3d-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Oprichting van micro-weefsels met behulp van cilindrische collageen gels, genaamd modules, die ingesloten cellen en dat het oppervlak bevatten, is bekleed met endotheelcellen.

Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Celmigratie is een belangrijk onderdeel van de menselijke ontwikkeling en het leven. Om de mechanismen te begrijpen die celmigratie kunnen veranderen, presenteren we een planar gradient diffusiesysteem om chemotaxis in een 3D collageenmatrix te onderzoeken, waardoor men de moderne diffusiekamerbeperkingen van bestaande assays kan overwinnen.

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.

Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van IDG-SW3-cellen in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix.

IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix

Leer hoe je uitgelijnde en willekeurige 3D-collageenmatrices bereidt voor het bestuderen van celmigratie en celgedrag in een driedimensionale omgeving. Deze methode maakt kosteneffectief onderzoek naar cel-ECM-interacties mogelijk.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties

Meer video's verkennen