Name: siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer siRNA-transfectie en EMSA-analyse op vers geïsoleerde humane villieuze cytotrofoblasten met microporatie. Deze methode maakt efficiënt onderzoek naar genregulatie en DNA-eiwitinteracties in placentabiologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Nationale Raad Sciences and Engineering Research van Canada (NSERC) (# 298527) (BB). CT werd ondersteund door een institutioneel FARE beurs. AV werd ondersteund door een NSERC Graham Bell Ph.D. beurs. BB hield een Canada Research Chair in Human Retrovirology (Tier 2). Met dank aan Beatrix Beisner voor hulp in de tekst te herzien.

De UQAM ethische commissie heeft deze protocollen, die in overeenstemming zijn met de richtlijnen van de ethische commissie van St-Luc ziekenhuis van het Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Canada) goedgekeurd. De deelnemers tekenden een informed consent formulier. 1. Medium Voorbereiding en isolatie van Primary Villous cytotrofoblasten <ol><li> Bereid kweekmedium voor humane primaire villous cytotrofoblasten aanvulling Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) met 25 mM HEPES, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Filter de voorbereide medium door steriel 0,22 pm filter en op te slaan in een -20 ° C vriezer in porties van 50 ml. </li><li> Isoleer primaire villous cytotrofoblasten van verse placenta volgende standaard protocollen 3. <ol><li> Met behulp van een tang, verwijder de vliezen uit het weefsel door voorzichtig te krabben het uit, terwijl ze voorzichtig villous weefsel niet te verwijderen. Snij deresterende placenta villi in blokjes van ongeveer 3 x 3 cm met behulp scalpel en schaar. Grondig wassen met water dat 0,9% NaCl maternale bloed te verwijderen. <ol><li> Het houden van elke kubus met een tang voorzichtig de villous weefsel te verwijderen van de resterende schepen en vezelig weefsel met een schaar. </li><li> 15 tot 30 mg villus weefsel verteren viermaal Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met trypsine (van 9,6 x 10 5-1,8 x 10 6 U; eindconcentratie 1,2 mg / ml) en deoxyribonuclease I (DNase I) ( eindconcentratie 200 gg / ml) gedurende 30 min bij 37 ° C in een waterbad onder voortdurend schudden. Opmerking: gebruik 150 ml totaal volume van de eerste digestie, 100 ml voor de tweede digestie en 75 ml voor de twee overige digesties. </li></ol></li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof die gedispergeerde cellen en centrifugeer bij 1250 xg gedurende 15 min zonder remmen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml voorverwarmde DMEM bevattende1% penicilline / streptomycine. </li><li> Laag het gedispergeerde cellen op een discontinue 5% - 70% polyvinylpyrrolidon-gecoate silica gradiënt (zie Tabel 1 voor de bereiding gradiënt) en centrifugeer gedurende 23 minuten bij 507 xg zonder rem. Verwijder de dichtheid laag tussen 1,017-1,033 door afzuigen en laat de lagen tussen 40% en 50% in het verloop met een nieuwe pipet. Was de cellen uitvoerig met 10 ml voorverwarmde DMEM bevattende 1% penicilline / streptomycine. Opmerking: De verzamelde fractie stemt overeen met dichtheden tussen 1,048 en 1,062, wat trophoblasts herbergt. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer. In het kort cellen meng en voeg 10 ul in een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 10 ul van trypan blauw en voorzichtig weer mengen. Het opstellen van de celsuspensie en vul de hemocytometer kamers. Tel de cellen onder 10X objectief. </li><li> Plaats 1 x 10 6 en 4,5 x 10 6 cellen in afzonderlijke buizen voor gebruik in secties 1.3 en 2, respectievelijkly. Zaad de overige cellen in een dichtheid van 1,5 x 10 6 cellen / well in DMEM aangevuld medium en kweek bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende maximaal 4 dagen voor de andere experimenten. </li></ol></li><li> Evaluatie van de zuiverheid van geïsoleerde primaire villous cytotrofoblasten <ol><li> Spin 1 x 10 6 van de vers geïsoleerde cytotrofoblasten in microcentrifugebuizen bij 300 x g. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml voorverwarmd fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer cellen op 300 xg en verwijder PBS door aspiratie. </li><li> Voeg 1 ml koude methanol om cellen en incuberen bij -20 ° C gedurende 20 min. Centrifugeer cellen op 300 xg gedurende 5 minuten en verwijder methanol door aspiratie. Let op: Gebruik bus masker, veiligheidsbril en rubberen handschoenen tijdens het hanteren methanol. </li><li> Voeg 1 ml PBS bij kamertemperatuur cellen gecentrifugeerd hydrateren bij 300 xg en verwijder PBS door afzuigen. </li><li> Incubeer cellen in PBS bevattende FBS (01:50 [v / v] verdunning) en een FcRblokkeringsreagens (01:10) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te elimineren. </li><li> Was tweemaal met 500 pl PBS kamertemperatuur Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten en verwijder PBS door afzuigen. Resuspendeer cellen in 100 ul PBS kamertemperatuur. </li><li> Incubeer cellen met een muis monoklonaal fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd anti-humaan cytokeratine 7-antilichaam kloon LP5K (1: 200) of een controle isotype-gematched non-specifiek antilichaam in PBS met 0,2% BSA gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen in PBS. </li><li> Analyseer de cellen door flowcytometrie 3. Gebruik celpreparaten die ten minste 96% CK-7-positieve cellen vertonen door flowcytometrie voor verdere experimenten. </li></ol></li></ol> 2. siRNA Transfectie van humane primaire Villous cytotrofoblasten <ol><li> Transfectie van primaire menselijke villi cytotrofoblasten met een microporatie-inrichting <ol><li> Bereid 6-well platen met2 ml DMEM aangevuld medium voor incubatie van microporated cellen. </li><li> Na isolatie van de primaire cytotrofoblasten (zie paragraaf 1.2), neemt een monster van cellen in suspensie en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Transfer 1,5 x 10 6 cellen om een microcentrifugebuis en pellet cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met 1 ml Dulbecco&#39;s PBS (DPBS) (Mg2 +, Ca2 + -vrij) en pellet van de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 100 pl resuspensiebuffer. Opmerking: vermijden om celsuspensie langer dan 15-30 min bij kamertemperatuur levensvatbaarheid van de cellen en transfectie-efficiëntie te maximaliseren. </li><li> Voeg 300 ng Syncytin-2 siRNA (of control scrambled siRNA) aan de 1,5 ml microcentrifugebuis en zuig de cel-siRNA mengsel met behulp van een pipet 100 ul transfectie. invoegende pipet in het station (zie lijst van materialen) en de onderwerpen van de cellen aan een 1300 V enkele puls van 30 ms. </li><li> Onmiddellijk over de cellen 6-well platen (bereid in stap 2.1.1) die 37 ° C voorverwarmd medium aangevuld tot celbeschadiging voorkomen. </li><li> Herhaal stap 2.1.5 en 2.1.6 voor de overige monsters. </li><li> Schud de plaat gedurende 30 seconden om een ​​gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde CO2 incubator gedurende 24 tot 48 uur. Vernieuwen kweekmedium 24 uur na transfectie. </li><li> Evalueer transfectie-efficiëntie door Western blot-analyse (zie stappen 3-6). </li></ol></li><li> Lipofectie van siRNA in de menselijke primaire cytotrofoblasten <ol><li> Na isolatie van de villi cytotrofoblasten, zaad de cellen bij een dichtheid van 1,5 x 10 6 cellen per putje in 6-wells platen in 2 ml kweekmedium en incubeer 18 uur. </li><li> Verdun 300 ng Syncytin-2-specifieke siRNA (of control-scrambledsiRNA) en 5 gl van lipide-gebaseerde transfectie reagens in afzonderlijke 1,5 ml buizen in een totaal volume van 10 pl en antibiotica-serumvrij medium. Incubeer gedurende 5 min. </li><li> Meng de verdunde reagentia en incubeer gedurende nog 20 minuten bij kamertemperatuur om de transfectie te vormen. Voeg 90 ul van antibiotica-en serumvrij medium aan het mengsel tot een eindvolume van 100 pl. </li><li> Verwijder kweekmedium uit de 6-well platen (stap 2.2.1). Voeg 2 ml vers medium en 100 pi transfectiemengsel aan elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 24 tot 48 uur. Vernieuwen kweekmedium 24 uur na transfectie. </li><li> Evalueer transfectie-efficiëntie door Western blot-analyse (zie stappen 3-6). </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding van lysaten van Whole Cell Culture <ol><li> Verwijder de media en spoel elk putje (van stap 2.1.8 en 2.2.4) met behulp van voorverwarmde DPBS (Mg 2+, Ca 2+ gratis). Zuig het DPBS en voeg 500 ul van 0,25% trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Incubeer gedurende 1-3 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator. Stop trypsine behandeling door toevoeging van 500 pl serum bevattende groeimedia. Opmerking: Gebruik de juiste media volume afhankelijk van de aard van de kolf / gerecht: 1 ml per 10 7 cellen / 100 mm schaal / 150 cm2 fles; 0,5 ml per 5 x 10 6 cellen / 60 mm schaal / 75 cm 2 kolf. </li><li> Overdracht cellen om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis, pellet cellen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met DPBS (Mg2 +, Ca2 + -vrij) en pellet cellen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. Plaats de buis op ijs. Resuspendeer de pellet in 50-200 ul ijskoude Radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer (zie tabel 2 voor buffer compositie) met daarin vers toe te voegened protease en fosfatase remmers bij een 1x uiteindelijke concentratie. In het kort vortex de kolf en laat op ijs gedurende 30 min. </li><li> Spin bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Plaats de buis voorzichtig op ijs. Met behulp van een pipet het supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis op ijs bewaard. Gooi de pellet. </li></ol> 4. Voorbereiding van de Nuclear Uittreksels uit gekweekte cellen <ol><li> Voor elk putje (stap 1.2.5), was gekweekt cytotrofoblasten tweemaal met 1 ml voorverwarmde DPBS (Mg2 +, Ca2 + vrij). Aspireren DPBS en voeg 500 ul van 0,25% trypsine / EDTA. Incubeer gedurende 1-3 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator en stop trypsine behandeld door toevoeging van 500 pl serum bevattende groeimedia. </li><li> Overdracht cellen om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis, pellet cellen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -vrij) en pellet cellen door centrifugerenbij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig alle bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de pellet en plaats de buis op ijs. </li><li> Extract nucleair eiwit volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal eiwitconcentratie van elk monster met behulp van eiwit kwantificatie assay (Bradford assay of bicinchoninezuur (BCA)). </li></ol> 5. Monstervoorbereiding en elektroforese <ol><li> Bepaal de eiwitconcentratie voor elk celextract met een kwantificering eiwit assay (bijvoorbeeld 8 Bradford of BCA 9). </li><li> Volgens de instructies van de fabrikant (indien antilichamen kunnen worden gebruikt bij reductie en denaturatie omstandigheden), voeg een gelijk volume van 2x Laemmli monsterbuffer (tabel 2) 20-30 ug totaal eiwit. </li><li> Kook cellysaten bij 100 ° C gedurende 5 minuten. Aliquot 50-100 pl lysaat aan herhaalde vries / ontdooi cycli te voorkomen en uit de resterende buizen bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li&gt; <li> Terwijl de monsters verwarmen, bereiden 1 liter 1 x loopbuffer (tabel 2). </li><li> Spin de monsters bij 16.000 xg gedurende enkele seconden en plaats ze op ijs. </li><li> Laad gelijke hoeveelheid eiwit in elke well van een 12% SDS-PAGE-gel (zie Tabel 2 voor gelsamenstelling), samen met een molecuulgewicht merker. Voer de elektroforese gedurende 1-2 uur bij 100 V. </li></ol> 6. overbrengen van het eiwit uit de gel naar het membraan <ol><li> Activeren polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met methanol gedurende 1 min en spoel met 1x overdracht buffer / 10% methanoloplossing. Volgens de instructies van de fabrikant, transfer voor 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de eiwitgrootte. Opmerking: Transfer efficiëntie kan worden beoordeeld met behulp van Ponceau rode vlekken voordat de blokkerende stap. </li></ol> 7. antilichaamkleuring <ol><li> Blokkeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C met 5% blokkeeroplossing. </li><li> Incubeer het membraan met anti-Syncytin-2 antilichamen (4 ug / ml; 1: 5000) 6 of anti-glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH, 0,4 gg / ml; 1: 500) in 5% blokkeeroplossing overnacht bij 4 ° C (anti-Syncytin-2) of gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was het membraan drie maal in Tris-gebufferde zoutoplossing Tween (TBST zie Tabel 2 voor buffersamenstelling) gedurende 5 min. </li><li> Incubeer het membraan met geschikte mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-konijn of anti-muis antilichaam (1: 10.000) in 5% blokkerende buffer in TBST bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was het membraan drie keer in TBST gedurende 5 minuten en spoel in TBS. Signalen detecteren met behulp van de chemiluminescentie gebaseerde blotting substraat. </li></ol> 8. Radioactief merken van enkelstrengs oligonucleotide <ol><li> fosforyleringsreactie <ol><li> In een microcentrifuge buis, voeg 50 ng een voorwaartse oligonucleotide met 1x T4 polynucleotide kinase buffer, 1 UT4 polynucleotidekinase en 20 uCi (γ- 32 P) ATP en deel uitmaken van de reactie volume tot 20 pi met nuclease-vrij water. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Stop de reactie door toevoeging van 5 pl 0,5 M EDTA. Maak het volume tot 50 pi met nuclease-vrij water. </li></ol></li><li> Verwijdering van niet opgenomen nucleotiden van oligonucleotiden <ol><li> Bereid een G-25 kolom geëquilibreerd met TE buffer (tabel 2) volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de kolom in een frisse DNase-vrij 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg langzaam 50 pl probe (uit stap 8.1.2) via hars voorzichtig het harsbed niet te verstoren. Spin gedurende 2 minuten bij 350 xg om het gezuiverde monster in 1,5 ml microcentrifugebuis verzamelen. Was de kolom G-25 met 36 ul nuclease-vrij water en draaien gedurende 2 minuten bij 350 xg om het te verzamelen in de microcentrifugebuis. </li></ol></li><li> Hybridisatie met de complementaire streng oligonucleotide <ol><li> Breng de radioactief gemerkte probe (86 pi) van een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 200 ng omgekeerde oligonucleotide en 1x annealen buffer (tabel 2). Verhit 5 min bij 95 ° C en laat een nacht bij kamertemperatuur koelen. </li><li> Bereid niet-radioactieve dubbelstrengs oligonucleotiden door toevoeging van 50 ng niet-gelabelde voorwaartse en achterwaartse oligonucleotiden en 1x annealen buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Maak het volume tot 100 ul met nuclease-vrij water. Warmte en laten kamertemperatuur zoals beschreven in stap 8.3.1. </li></ol></li></ol> 9. Bereiding van een niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese EMSA <ol><li> Bereid een 4% natieve gel (10 x 12 cm) met een 1,5 mm ruimte-kam (zie Tabel 2 voor gelsamenstelling). Reinig alle glazen platen met behulp van gedestilleerd water. Let op: Het is essentieel dat de platen zijn volledig vrij van ionische detergent, zoals SDS. </li><li> onmiddellijk pons de acrylamide oplossing tussen de platen en laat polymerisatie te gaan (ongeveer 30 min). </li><li> Monteer de elektroforese apparatuur en vul de tank met 0.5x TBE. Pre-run de gel gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 150 V voordat monster laden. </li></ol> 10. DNA bindingsreactie <ol><li> In een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 10 ug van nucleair extract (stap 4.3) in 1x Gel Shift Binding buffer (tabel 2) en vul het uiteindelijke volume tot 10 pi met nuclease-vrij water. Als controle werd een buis bereiden zonder nucleair extract. Voor de competitiereactie, voeg 1 pl koud aspecifieke of specifieke dubbelstrengs oligonucleotide (stap 8.3.2). </li><li> Voeg 1 pl radioactieve probe uit stap 8.3.1 aan elke reactie. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Voeg 1 ul van 10x gel laadbuffer per reactie en laadt elk monster op de gel bereid in hoofdstuk 9. </li><li> Voer de elektroforese gedurende 1 1/2 tot 2 uur bij 150 V. Na de migratie, wikkel de gel en het glas in een plastic wrap en positie in een blootstelling cassette onder een fosforscherm. Reactie cassette bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Verwijder het scherm van blootstelling cassette, plaats in de fosfor afbeeldingsinrichting gescand. </li></ol>

<ol><li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+origins+of+preeclampsia%3A+challenging+the+current+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis.</a> Hypertension. 51, 970-975 (2008).</li>
<li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+Award+in+Placentology+Lecture%3A+Biology+of+the+placental+syncytiotrophoblast--myths+and+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts.</a> Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).</li>
<li>Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+cytotrophoblast+cells+and+in+vitro+methods+for+studying+human+cytotrophoblast+cells%27+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake.</a> Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).</li>
<li>Morrish, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultured+human+term+cytotrophoblast%3A+a+model+for+normal+primary+epithelial+cells+demonstrating+a+spontaneous+differentiation+programme+that+requires+EGF+for+extensive+development+of+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium.</a> Placenta. 18, 577-585 (1997).</li>
<li>Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+siRNA-mediated+reduction+of+mRNA+and+protein+expression+in+human+placental+explants%2C+isolated+primary+cells+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines.</a> Placenta. 30, 124-129 (2009).</li>
<li>Vargas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syncytin-2+plays+an+important+role+in+the+fusion+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells.</a> J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).</li>
<li>Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRE%2FAP-1-Like+Motif+Is+Essential+for+Induced+Syncytin-2+Expression+and+Fusion+in+Human+Trophoblast-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model.</a> PLoS One. 10, e0121468(2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Desforges, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SNAT4+isoform+of+the+system+A+amino+acid+transporter+is+functional+in+human+placental+microvillous+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane.</a> J. Physiol. 587, 61-72 (2009).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Guilbert, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+functional+characterization+of+villous+cytotrophoblasts+free+of+syncytial+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments.</a> Placenta. 23, 175-183 (2002).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoplex+morphologies+and+their+influences+on+transfection+efficiency+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery.</a> J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).</li>
<li>Freeley, M., Long, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+siRNA+delivery+to+T-cells%3A+potential+clinical+applications+for+inflammatory+disease%2C+cancer+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection.</a> Biochem. J. 455, 133-147 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Studies over menselijke placenta functie en ontwikkeling zijn sterk verbeterd door protocollen die gericht zijn op het optimaliseren van de isolatie van de verschillende placenta cel populaties. Een van de beste bestudeerde placenta cel populatie blijft villous cytotrofoblasten, de studie die heeft sterk geprofiteerd van geoptimaliseerde protocollen waardoor efficiënt en betrouwbaar isolement. Dit heeft verder liet een aantal experimenten, zoals transfectie en promoter studies. Door een eerder beschreven protocol 3...

Disfunctie van de menselijke placenta is geassocieerd met de ontwikkeling van verschillende zwangerschapsgerelateerde ziekten zoals pre-eclampsie en intra-uteriene groeirestrictie 1. Een belangrijk celbestanddeel van de placenta zijn de trofoblasten, die kunnen worden geclassificeerd als extra-villous of villoze cytotrofoblasten. Na fusie differentiëren villoze cytotrofoblasten verder in de syncytiotrofoblastlaag, een multinucleaire celstructuur met een belangrijke rol in de foeto-maternale uitwisseling en hormoonproductie 2. Menselijke primaire villoze cytotrofoblasten en hun gedifferentieerde tegenhangers vertegenwoordigen belangrijke biologische monsters en stellen onderzoekers in staat om een aantal placenta-gerelateerde processen, zoals celfusie, in cultuur te bestuderen. Bovendien worden er aanzienlijke inspanningen geleverd om markers te identificeren die geschikt beheer mogelijk maken en preventieve therapieën specifiek voor zwangerschapsgerelateerde ziekten verbeteren. Laboratoria isoleren routinematig primaire menselijke villoze cytotrofoblasten uit verse placenta's, met behulp van een standaard isolatieprocedure op basis van trypsine-digestie van placenta-vlokken 3. Aangezien gekweekte cytotrofoblasten hun capaciteit om te prolifereren verliezen en zich snel differentiëren in een syncytiotrofoblast-achtige laag bij cultivatie 4, zijn zeer efficiënte transfectiemethoden en geoptimaliseerde analysebenaderingen noodzakelijk. Eerdere studies hebben optimale omstandigheden voor transfectie van deze primaire cytotrofoblasten bepaald 5. Hierin wordt een andere methode voor siRNA-transfectie gepresenteerd, die eerder is getest in dit celtype 6. In vergelijking met een lipofectine-gebaseerde aanpak verbetert deze microporatiemethode de transfectie, zoals beoordeeld aan de hand van de mate van silencing van specifieke genen.
Promoter en genexpressiestudies geven ook een beter begrip van de placentafunctie. Hoewel moeilijker te gebruiken vanwege de korte tijdsperiode waarvoor primaire villoze cytotrofoblasten kunnen worden gekweekt, kunnen promotoranalyses met behulp van standaardprotocollen toch worden aangepakt, zoals eerder gepubliceerd 7. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) is een van deze veelgebruikte in vitro methoden, die snel en gemakkelijk monitoring van DNA-eiwitinteracties mogelijk maakt. Nucleaire extracten van deze primaire trofoblasten werden gebruikt om een gebied van de Syncytine-2 promotor te testen op specifieke interacties. De resultaten toonden aan dat gebonden factoren op verschillende tijdstippen van de cultuur en op een specifieke en reproduceerbare manier konden worden gedetecteerd.
De in dit protocol gepresenteerde gegevens bevestigen dat onze transfectieaanpak en het EMSA-protocol kunnen worden gebruikt voor geïsoleerde primaire villoze cytotrofoblasten en zullen van groot nut zijn om de diverse functies van villoze cytotrofoblasten in normale of pathologische omstandigheden te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>HBSS without&nbsp; Ca2+, Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose without Hepes</td><td>Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x)</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>Voor dichtheidsgradient</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Ambion Life technologies</td><td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, type I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotransfectie&nbsp; reagentia&nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD)</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>Acrylmide</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#A9099</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC geconjugeerd</td><td>Millipore</td><td>CBL194F</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>FcR blokkeermiddel&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>Verdunning 1:10</td></tr><tr><td>Flow Cytometer BD Acuri systeem</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100 apparaat&nbsp;</td><td>Digital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resuspendatie buffer R (Neon Transfectie Systeem 100&nbsp;&micro;l Kit)</td><td>Life technologies</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membraan&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010&nbsp;</td><td>Activeren met methanol</td></tr><tr><td>Anti-human GAPDH antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-geconjugeerd geitenanti-konijn antilichaam of anti-muis antilichaam</td><td>Cell Signalling</td><td>#7074</td><td>1:10.000</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-geconjugeerd geitenanti-muis antilichaam</td><td>Cell Signalling</td><td>#7076&nbsp;</td><td>1:10.000</td></tr><tr><td>NE-PER Nucleaire en Cytoplasmatische Extractie Reagens</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 kolom&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescentie en fluorescentie beeldvormingsapparaat</td><td>Montr&eacute;al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% native gel</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Personal Molecular Imager (PMI) Systeem</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sirna transfectie en emsa analyses op vers geïsoleerde human villous cytotrofoblasten

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Menselijke primaire villoze cytotrofoblasten zijn een zeer nuttige bron van primaire cellen om placentafuncties en regulatiemechanismen te bestuderen, en om zwangerschapsgerelateerde ziekten te begrijpen. In dit protocol worden humane primaire villoze cytotrofoblasten, vers geïsoleerd uit placenta's via een standaard DNase/trypsine protocol, microporeerd met kleine interfererende RNA (siRNA). Deze aanpak biedt een grotere efficiëntie voor siRNA-transfectie in vergelijking met een lipofectie-gebaseerde methode. Getransfecteerde cellen kunnen vervolgens binnen een tijdsbestek van 3-4 dagen na transfectie worden geanalyseerd door middel van standaard Western blot. Bovendien werd de Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analyse geoptimaliseerd en uitgevoerd op extracten van dag 1 tot 4, met behulp van gekweekte primaire villoze cytotrofoblasten. Het gebruik van deze gekweekte primaire cellen en het beschreven protocol maakt een evaluatie mogelijk van de implicatie van specifieke genen en transcriptiefactoren in het proces van differentiatie van villoze cytotrofoblasten in een syncytiotrofoblast-achtige cellag. Echter, de beperkte tijdsduur die toelaatbaar is in cultuur sluit het gebruik van methoden uit die meer tijd vereisen, zoals het genereren van een stabiele cellijn. Daarom vereist het testen van deze cellijn hoog geoptimaliseerde genoverdrachtsprotocollen.

Verse placenta van zwangerschappen werden gebruikt om humane primaire villous cytotrofoblasten isoleren de reeks experimenten in de sectie Protocol voeren. Na hun scheiding, we eerst analyseerde de zuiverheid van cytotrofoblasten door het gebruik van de cytokeratine 7-marker (figuur 1). Celpreparaten werden dus gekleurd met een monoklonaal anti-cytokeratine-7 antilichaam. Figuur 1 geeft de resultaten van een typisch experiment na zuivering van primaire v...

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het efficiënt siRNA transfectie van vers geïsoleerde menselijke villous cytotrofoblasten behulp microporatie en het identificeren van DNA-eiwitcomplexen in deze cellen. Getransfecteerde cellen kunnen worden gecontroleerd door Western blot en EMSA analyses gedurende de 4 dagen cultuurtijd.

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Het algemene doel van dit protocol is om de optimale condities aan te tonen voor de transfectie van vers geïsoleerde primaire villous cytotrophoblasten en om een methode te presenteren voor de identificatie van DNA-eiwitinteracties bij promoterlocaties. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van placentaonderzoek, zoals die met betrekking tot genen die betrokken zijn bij de differentiatie van cytotrophoblasten en de regulatiemechanismen die een rol spelen bij hun expressie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ze eenvoudig uit te voeren en zeer efficiënt zijn.Bovendien is de tijd die nodig is om dit experiment uit te voeren kort en kunnen er veel verschillende monsters worden opgenomen. Deze procedures worden gedemonstreerd door Chirine Toufaily, een voormalig PhD-student uit mijn laboratorium, en Yong Xiao, een research associate. Hierbij worden primaire villosite cytotrophoblasten geïsoleerd uit verse placenta's volgens standaardprotocollen.De eerste stap van dit protocol is het analyseren van de zuiverheid van de preparatie via FACS-analyse. Centrifugeer eerst 10⁶ van de vers geïsoleerde cytotrophoblasten in microcentrifugebuisjes

sirna-transfection-emsa-analyses-on-freshly-isolated-human-villous

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

Trofoblastische reuzencellen (TGC's) spelen een sleutelrol in de placenta om een gezonde zwangerschap te garanderen. We presenteren een protocol voor het beoordelen van de transcriptionele status van genen in TGC's door middel van nascent fluorescente in situ hybridisatie op cryostaat secties van post-implantatie embryo's of kortdurende culturen van ectoplacentale kegels op embryonale dag 7.

Transcriptionele Analyse van ontluikende RNA FISH van<em&gt; In Vivo</em&gt; Trofoblast Giant Cells of<em&gt; In Vitro</em&gt; Korte termijn culturen van Ectoplacental Cone Explantaten

Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

Het huidige protocol maakt het herstel mogelijk van buisachtige structuren die zijn gevormd in de klassieke in vitro angiogenese-buisvormingstest waarbij cellen, zoals trofoblastcellen, zich organiseren in capillaire structuren over een laag extracellulaire basaalmembraanmatrix. De teruggevonden structuren worden gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie voor verschillende biochemische analyses.

Trofoblastcelherstel van angiogenese-buisvormingstest voor analyse van differentiatiemarkerexpressie

Dit protocol maakt zuivering, karakterisering en kweek mogelijk van primaire HLA-G+ extravilleuze trofoblasten (EVT) uit de decidua basalis en het chorionmembraan van menselijke termplacenta's. Primaire EVT-culturen behouden de levensvatbaarheid gedurende 96 uur, waardoor co-kweek met monster-gematchte moederlijke immuuncellen en daaropvolgende flowcytometrische en moleculaire analyse van hun interacties mogelijk is.

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Leer siRNA-transfectie en EMSA-analyse op vers geïsoleerde humane villieuze cytotrofoblasten met microporatie. Deze methode maakt efficiënt onderzoek naar genregulatie en DNA-eiwitinteracties in placentabiologie mogelijk.

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Meer video's verkennen