Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Het algemene doel van deze procedure is om een systeem te demonstreren voor het genereren van ongemarkeerde mutanten in de cyanobacteriële Synechocystis-soort PCC6803 en gemarkeerde mutanten in Synechococcus-soorten PCC7002. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cyanobacteriële genetica. Bijvoorbeeld hoe chromosomaal aanpassingen in een stam kunnen worden geïntroduceerd.

Door het inbrengen van een antibioticaresistentiegen, gevolgd door een daaropvolgende verwijdering van deze cassette, met behulp van een negatief selecteerbare marker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat stammen herhaaldelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd. Hierdoor kunnen er zoveel aanpassingen in een stam worden geïntroduceerd als gewenst.

Na het voorbereiden van media, cyanobacteriële stammen en plasmiden, volgens het tekstprotocol. Zet een verse cultuur op door een lus vol cyanobacteriële cellen in 30 tot 50 milliliter BG11-medium te inoculeren. Laat de cultuur twee tot drie dagen in het licht bij 30 graden Celsius groeien, tot een OD750, gelijk aan 0,2 tot 0,6.

Na de incubatie, centrifugeer één tot twee milliliter van de cultuur bij 2.300 g's gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens het supernatant weg en gebruik BG11-medium om de pellets eenmaal te wassen, voorzichtig pipetterend om de cellen te resuspenderen. Omdat vortexen kan leiden tot het verlies van pili, die essentieel zijn voor DNA-opname.

Nadat de cellen opnieuw zijn gepelleteerd en het supernatant is verwijderd, voeg BG11-medium toe tot een eindvolume van 100 microliter en breng de cellen over naar een 14 milliliter ronde bodembuis. Voeg vervolgens 1 microgram van het eerder bereide plasmide A toe aan de cellen. En tik voorzichtig om te mengen.

Leg vervolgens de buisjes horizontaal in de incubator bij 30 graden Celsius en incubeer gedurende vier tot zes uur. Na de incubatie, spreid aliquoten van de celcultuur plasmide DNA-mengsel op BG11-agar platen zonder antibiotica. En incubeer bij 30 graden Celsius.

Ongeveer 24 uur later, bereid een 0,6% agar oplossing voor, in water met kanamycine. En laat het afkoelen tot 42 graden Celsius. Voeg vervolgens 2,5 tot drie milliliter toe aan de randen van de cultuurplaten en kant de plaat, zodat de oplossing een gelijkmatige topagarlaag op het oppervlak vormt.

Incubeer de platen ongeveer zeven dagen totdat kolonies zichtbaar zijn. Verdeel vervolgens een verse BG11-agar plus kanamycine plaat in zes sectoren. En gebruik een stompe tandenstoker om individuele kolonies uit te strijken.

Voer PCR uit om de gemarkeerde knockout te bevestigen, breng een kleine hoeveelheid cellen over in een buis met 50 microliter water en ongeveer 20 425 tot 600 micrometer glazen kralen. Schud de cellen en kralen ongeveer 2.000 rpm gedurende vijf minuten, voordat u bij 15.700 g's gedurende vijf minuten centrifugeert. Gebruik vervolgens vijf microliter van het supernatant om 50 microliter PCR-reacties voor te bereiden met tack DNA-voorlopers.

Om de mutanten te valideren, ontwerp na het ontwerpen van primers volgens het tekstprotocol, versterkt product met behulp van het volgende programma en neem een wildtype controle op. Door middel van gelelektroforese, verifieer het genotype van knockout transformanten. Dit toont een band van ongeveer vier kilobaseparen en mist de wildtype band.

Raadpleeg het tekstprotocol voor verdere details. Als er nog steeds een wildtype band aanwezig is, herstreep de stam op een verse plaat en herhaal de PCR. Herhaal het validatieproces totdat de mutant is gesegregeerd en er geen wildtype band wordt waargenomen in de PCR-reactie.

Voor een stam die een gemarkeerd mutantprofiel vertoont, herstreep op een verse plaat voor gebruik bij het genereren van een ongemarkeerde knockout. Om ongemarkeerde Synechocystis-mutanten te genereren, zet een verse cultuur van de gemarkeerde knockout op door de lus vol cellen te inoculeren in 30 tot 50 milliliter BG11-medium. Laat de cultuur twee tot drie dagen groeien tot een OD750, gelijk aan 0,2 tot 0,6.

Centrifugeer 10 milliliter van de cultuur bij 2.300 g's gedurende vijf minuten en gooi het supernatant weg. Was vervolgens de cellen voorzichtig met BG11-medium. Na het toevoegen van BG11 tot een eindvolume van 200 microliter en het overbrengen van de cellen naar een 14 milliliter ronde bodembuis, voeg 1 microgram plasmide B DNA toe aan de cellen en tik voorzichtig om te mengen.

Leg vervolgens de buisjes horizontaal in de incubator en incubeer gedurende vier tot zes uur. Na de incubatie, voeg 1,8 milliliter BG11-medium toe en incubeer de monsters gedurende een totaal van vier dagen met schudden. Dit is voldoende tijd om recombinatie te laten plaatsvinden in de meerdere chromosomale kopieën.

Plaat 50, 10 en 1 microliter aliquoten van de getransformeerde cultuur op BG11 plus 5% sucrose-agar platen en incubeer gedurende ongeveer zeven dagen om enkele kolonies te genereren. Gebruik vervolgens een stompe tandenstoker om 30 tot 50 individuele kolonies op BG11 plus kanamycine platen te haten. Plak vervolgens op BG11 plus 5% sucrose.

Kolonies die groeien op BG11 plus sucrose, maar niet op platen met kanamycine zijn potentiële ongemarkeerde knockouts. Kolonies die op beide platen groeien zijn waarschijnlijk sucrose-resistent vanwege een mutatie in het sacB-gen. Volg de PCR-methode, die eerder in deze video is gedemonstreerd, om ongemarkeerde knockouts te verifiëren, die een gelband zullen produceren die overeenkomt met de wildtype-grootte minus het verwijderde gebied.

Als de stam een ongemarkeerd mutantprofiel vertoont, herstreep deze dan op verse BG11-agar zonder antibiotica. Om de stammen langdurig te bewaren, zet een verse cultuur van de stam op door een lus vol cellen te inoculeren in 30 tot 50 milliliter BG11-medium. Laat de cultuur drie tot vier dagen groeien tot een OD750 gelijk aan 0,4 tot 0,7