Name: Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Leer een methode voor het genereren van gemarkeerde en ongemarkeerde mutanten in cyanobacteriën Synechocystis PCC6803 en Synechococcus PCC7002. Deze techniek maakt herhaalde genetische manipulatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de Environmental Services Association Education Trust, de synthetische biologie in Cambridge Synbio fonds en het ministerie van Sociale Rechtvaardigheid en Empowerment, de regering van India, voor financiële steun.

<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
<li>Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The origin of plastids.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De meest kritische stappen in het genereren van ongemarkeerde mutanten zijn: 1) voorzichtig plasmide ontwerp om ervoor te zorgen alleen de beoogde regio is veranderd; 2) ervoor te zorgen dat de monsters blijven axenic, vooral wanneer gekweekt op sucrose; 3) plateren getransformeerde cellen gemerkt mutant generatie aanvankelijk op BG11 agarplaten ontbreekt antibiotica, gevolgd door toevoeging van agar plus antibiotica 24 uur later; 4) het kweken gemarkeerd mutanten voor 4 volle dagen voorafgaand aan de beplating op BG11 ...

Cyanobacteriën zijn een evolutionair oud en divers stam van bacteriën gevonden in bijna elke natuurlijke omgeving op aarde. In de mariene ecosystemen zijn ze bijzonder overvloedig en spelen een belangrijke rol in vele nutriëntenkringlopen, goed voor ongeveer de helft van koolstof fixatie 1, de meerderheid van stikstofbinding 2 en honderden miljoenen tonnen koolwaterstof productie 3 in de oceanen jaarlijks. Chloroplasten het organel verantwoordelijk is voor de fotosynthese in eukaryote algen en planten, zijn waarschijnlijk zijn geëvolueerd van een cyanobacterie die werd opgeslokt door een gastheer organisme 4. Cyanobacteria nuttig modelorganismen gebleken voor de studie van de fotosynthese, elektronentransport 5 en biochemische wegen, waarvan vele zijn geconserveerd in planten. Bovendien cyanobacteriën worden steeds meer gebruikt voor de productie van levensmiddelen, biobrandstoffen 6, 7 elektriciteit en industriële verbindingen 8, door hun highly efficiënte omzetting van water en CO 2 op biomassa met behulp van zonne-energie 9. Veel soorten kunnen worden gekweekt op niet-landbouwgrond met een minimum aan voedingsstoffen en zeewater, wat suggereert dat cyanobacteriën zou kunnen worden geteeld op grote schaal zonder dat de landbouwproductie. Bepaalde soorten zijn ook bronnen van natuurlijke producten, waaronder antischimmel, antibacteriële en anti-kanker verbindingen 10,11. Het vermogen om mutanten te genereren is essentieel voor het begrijpen van cyanobacteriën fotosynthese, biochemie en fysiologie en essentieel voor de ontwikkeling van stammen voor industriële doeleinden. De meeste gepubliceerde studies genereren genetisch gemodificeerde stammen door insertie van een antibioticum resistentie cassette in de plaats van belang. Dit beperkt het aantal mutaties die in een rek kan worden ingevoerd, aangezien slechts enkele antibioticaresistentie cassettes zijn beschikbaar voor gebruik in cyanobacteriën. Stammen die genen die antibioticum resistance kan niet worden gebruikt voor industriële productie ter openbare vijvers, die waarschijnlijk de enige kosten-effectieve manier tot biobrandstoffen en andere laagwaardige producten 12 produceren. Het genereren van ongemarkeerde mutanten overwint deze beperkingen. Ongemarkeerde mutanten bevatten geen vreemd DNA, tenzij opzettelijk inbegrepen en kan meerdere malen worden gemanipuleerd. Daarom is het mogelijk om zoveel veranderingen in een stam genereren gewenst. Bovendien kunnen polaire effecten van genen stroomafwaarts van de modificatieplaats worden geminimaliseerd, waardoor nauwkeuriger modificatie van het organisme 13. Mutante stammen, zelfmoord plasmiden met twee DNA-fragmenten identiek aan gebieden in de cyanobacteriën chromosoom flankeren het gen verwijderd genereren (aangeduid als de 5 &#39;en 3&#39; flankerende gebieden) eerst geconstrueerd. Twee genen worden vervolgens tussen de flankerende gebieden. Eén daarvan codeert voor een antibioticumresistentie-eiwit; de tweede codeert SacB, die produces levansucrase, een verbinding verleent gevoeligheid voor sucrose. In de eerste stap van de werkwijze, gekenmerkt mutanten waarbij sommige stammen bevattende vreemd DNA, gegenereerd. Het plasmide construct gemengd met de cyanobacteriën cellen en het DNA is natuurlijk opgenomen door het organisme. Transformanten worden geselecteerd door groei op agarplaten die het geschikte antibioticum en het mutante genotype geverifieerd door PCR. Zelfmoord plasmiden kan niet repliceren binnen de stam van belang. Daarom zal antibiotica resistente kolonies ontstaan ​​door een recombinatiegebeurtenis waarbij het gen van interesse in het chromosoom ingevoegd. Om ongemarkeerde mutanten te genereren, wordt de gemerkte mutant vervolgens gemengd met een tweede zelfmoord plasmide dat alleen de 5 &#39;en 3&#39; flankerende gebieden. Indien insertie van vreemd DNA is vereist, een plasmide dat bestaat uit de 5 &#39;en 3&#39; flankerende gebieden met een cassette die de genen van belang ingevoegd tussen deze DNA-fragmenten, kan worden gebruikt. Selectie is via groei op agar platen met sucrose. Aangezien sucrose is dodelijk voor cellen wanneer het sacB gen product tot expressie wordt gebracht, de enige cellen die overleven zijn die waarbij een tweede recombinatiegebeurtenis heeft plaatsgevonden, waarbij de sucrose gevoeligheid gen naast het antibioticum resistentiegen, werd uit de gerecombineerde chromosoom en op het plasmide. Als gevolg van de recombinatie uitwisseling worden de flankerende gebieden en alle DNA daartussen ingevoegd in het chromosoom. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methoden om meerdere chromosomale mutaties in dezelfde stam van Synechocystis sp genereren. PCC6803 (hierna Synechocystis) 13,14, enkelvoudige puntmutaties te introduceren in een gen van interesse 13 en expressie van gencassettes. Terwijl de generatie van ongemarkeerde knockouts heeft voorafgaand aangetoond dat ons werk in Synechocystis 15,16, een gedetailleerde methode, geholpen dooreen visuele presentatie van de kritische stappen, is niet voor iedereen beschikbaar. We hebben ook gebruikt dezelfde methode voor het genereren van duidelijke knockouts in een ander model cyanobacterie, Synechococcus sp. PCC7002 (hierna Synechococcus). Dit protocol voorziet in een duidelijke, eenvoudige methode voor het genereren van mutanten en een snelle protocol voor het valideren en opslaan van deze stammen.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cyanocobalamin</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 90 mm triple vented</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro;m filters</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml conical flasks</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp;m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA purification kit&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani broth</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET plasmid miniprep kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml round-bottom tube</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro;m glass beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent bulbs</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron photobioreactor</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van marked en markerless mutanten in model cyanobacteriën species

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteriën zijn ecologisch belangrijke organismen en potentiële platforms voor de productie van biobrandstoffen en nuttige industriële producten. Genetische manipulatie van cyanobacteriën, met name modelorganismen zoals Synechocystis sp. PCC6803 en Synechococcus sp. PCC7002, is een belangrijke tool voor zowel fundamenteel als toegepast onderzoek. Het genereren van ongemarkeerde mutanten, waarbij chromosomale veranderingen in een stam worden geïntroduceerd via het invoegen van een antibioticumresistentiecasset (een manipuleerbaar fragment van DNA dat een of meer genen bevat), gevolgd door het vervolgens verwijderen van deze cassette met behulp van een negatief selecteerbare marker, is een bijzonder krachtige techniek. Ongemarkeerde mutanten kunnen herhaaldelijk genetisch worden gemanipuleerd, waardoor er zoveel wijzigingen in een stam kunnen worden geïntroduceerd als gewenst. Bovendien is de afwezigheid van genen die coderen voor antibioticumresistentie-eiwitten in de gemuteerde stam wenselijk, omdat het de mogelijkheid van 'ontsnapping' van antibioticumresistente organismen in het milieu vermijdt. Echter, gedetailleerde methoden voor herhaalde rondes van genetische manipulatie van cyanobacteriën worden niet goed beschreven in de wetenschappelijke literatuur. Hier bieden we een uitgebreide beschrijving van deze techniek, die we met succes hebben gebruikt om mutanten te genereren met meerdere deleties, enkele puntmutaties binnen een gen van belang en insertie van nieuwe gencassettes.

Plasmide ontwerp is essentieel voor succesvolle productie van zowel gemarkeerde en ongemarkeerde mutanten. Figuur 1 geeft een voorbeeld van plasmide A en B gebruikt om een deletie mutant in het Synechocystis genen cpcC1 en cpcC2 13 genereren. In elk geval de 5 &#39;en 3&#39; flankerende gebieden ongeveer 900-1,000 bp. Verminderde flankerende gebieden kunnen worden gebruikt, hoewel de kleinste hebben we met succes uitgetest ongeveer 5...

Het introduceren van meerdere genomische veranderingen in cyanobacteriën is een essentieel hulpmiddel bij de ontwikkeling van stammen voor industrieel en fundamenteel onderzoek. We beschrijven een systeem voor het genereren van ongemarkeerde mutanten in de model cyanobacteriënsoort Synechocystis sp. PCC6803 en gemarkeerde mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Het algemene doel van deze procedure is om een systeem te demonstreren voor het genereren van ongemarkeerde mutanten in de cyanobacteriële Synechocystis-soort PCC6803 en gemarkeerde mutanten in Synechococcus-soorten PCC7002. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cyanobacteriële genetica. Bijvoorbeeld hoe chromosomaal aanpassingen in een stam kunnen worden geïntroduceerd.Door het inbrengen van een antibioticaresistentiegen, gevolgd door een daaropvolgende verwijdering van deze cassette, met behulp van een negatief selecteerbare marker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat stammen herhaaldelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd. Hierdoor kunnen er zoveel aanpassingen in een stam worden geïntroduceerd als gewenst.Na het voorbereiden van media, cyanobacteriële stammen en plasmiden, volgens het tekstprotocol. Zet een verse cultuur op door een lus vol cyanobacteriële cellen in 30 tot 50 milliliter BG11-medium te inoculeren. Laat de cultuur twee tot drie dagen in het licht bij 30 graden Celsius groeien, tot een OD750, gelijk aan 0,2 tot 0,6.Na de incubatie, centrifugeer één tot twee milliliter van de cultuur bij 2.300 g's gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens het supernatant weg en gebruik BG11-medium om de pellets eenmaal te wassen, voorzichtig pipetterend om de cellen te resuspenderen. Omdat vortexen kan leiden tot het verlies van pili, die essentieel zijn voor DNA-opname.Nadat de cellen opnieuw zijn gepelleteerd en het supernatant is verwijderd, voeg BG11-medium toe tot een eindvolume van 100 microliter en breng de cellen over naar een 14 milliliter ronde bodembuis. Voeg vervolgens 1 microgram van het eerder bereide plasmide A toe aan de cellen. En tik voorzichtig om te mengen.Leg vervolgens de buisjes horizontaal in de incubator bij 30 graden Celsius en incubeer gedurende vier tot zes uur. Na de incubatie, spreid aliquoten van de celcultuur plasmide DNA-mengsel op BG11-agar platen zonder antibiotica. En incubeer bij 30 graden Celsius.Ongeveer 24 uur later, bereid een 0,6% agar oplossing voor, in water met kanamycine. En laat het afkoelen tot 42 graden Celsius. Voeg vervolgens 2,5 tot drie milliliter toe aan de randen van de cultuurplaten en kant de plaat, zodat de oplossing een gelijkmatige topagarlaag op het oppervlak vormt.Incubeer de platen ongeveer zeven dagen totdat kolonies zichtbaar zijn. Verdeel vervolgens een verse BG11-agar plus kanamycine plaat in zes sectoren. En gebruik een stompe tandenstoker om individuele kolonies uit te strijken.Voer PCR uit om de gemarkeerde knockout te bevestigen, breng een kleine hoeveelheid cellen over in een buis met 50 microliter water en ongeveer 20 425 tot 600 micrometer glazen kralen. Schud de cellen en kralen ongeveer 2.000 rpm gedurende vijf minuten, voordat u bij 15.700 g's gedurende vijf minuten centrifugeert. Gebruik vervolgens vijf microliter van het supernatant om 50 microliter PCR-reacties voor te bereiden met tack DNA-voorlopers.Om de mutanten te valideren, ontwerp na het ontwerpen van primers volgens het tekstprotocol, versterkt product met behulp van het volgende programma en neem een wildtype controle op. Door middel van gelelektroforese, verifieer het genotype van knockout transformanten. Dit toont een band van ongeveer vier kilobaseparen en mist de wildtype band.Raadpleeg het tekstprotocol voor verdere details. Als er nog steeds een wildtype band aanwezig is, herstreep de stam op een verse plaat en herhaal de PCR. Herhaal het validatieproces totdat de mutant is gesegregeerd en er geen wildtype band wordt waargenomen in de PCR-reactie.Voor een stam die een gemarkeerd mutantprofiel vertoont, herstreep op een verse plaat voor gebruik bij het genereren van een ongemarkeerde knockout. Om ongemarkeerde Synechocystis-mutanten te genereren, zet een verse cultuur van de gemarkeerde knockout op door de lus vol cellen te inoculeren in 30 tot 50 milliliter BG11-medium. Laat de cultuur twee tot drie dagen groeien tot een OD750, gelijk aan 0,2 tot 0,6.Centrifugeer 10 milliliter van de cultuur bij 2.300 g's gedurende vijf minuten en gooi het supernatant weg. Was vervolgens de cellen voorzichtig met BG11-medium. Na het toevoegen van BG11 tot een eindvolume van 200 microliter en het overbrengen van de cellen naar een 14 milliliter ronde bodembuis, voeg 1 microgram plasmide B DNA toe aan de cellen en tik voorzichtig om te mengen.Leg vervolgens de buisjes horizontaal in de incubator en incubeer gedurende vier tot zes uur. Na de incubatie, voeg 1,8 milliliter BG11-medium toe en incubeer de monsters gedurende een totaal van vier dagen met schudden. Dit is voldoende tijd om recombinatie te laten plaatsvinden in de meerdere chromosomale kopieën.Plaat 50, 10 en 1 microliter aliquoten van de getransformeerde cultuur op BG11 plus 5% sucrose-agar platen en incubeer gedurende ongeveer zeven dagen om enkele kolonies te genereren. Gebruik vervolgens een stompe tandenstoker om 30 tot 50 individuele kolonies op BG11 plus kanamycine platen te haten. Plak vervolgens op BG11 plus 5% sucrose.Kolonies die groeien op BG11 plus sucrose, maar niet op platen met kanamycine zijn potentiële ongemarkeerde knockouts. Kolonies die op beide platen groeien zijn waarschijnlijk sucrose-resistent vanwege een mutatie in het sacB-gen. Volg de PCR-methode, die eerder in deze video is gedemonstreerd, om ongemarkeerde knockouts te verifiëren, die een gelband zullen produceren die overeenkomt met de wildtype-grootte minus het verwijderde gebied.Als de stam een ongemarkeerd mutantprofiel vertoont, herstreep deze dan op verse BG11-agar zonder antibiotica. Om de stammen langdurig te bewaren, zet een verse cultuur van de stam op door een lus vol cellen te inoculeren in 30 tot 50 milliliter BG11-medium. Laat de cultuur drie tot vier dagen groeien tot een OD750 gelijk aan 0,4 tot 0,7

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Weber, N., et al., Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)This video describes a procedure for performing natural transformation in filamentous cyanobacteria using plasmid DNA to achieve stable GFP expression and antibiotic resistance through homologous recombination.

Natural Transformation and GFP Expression in the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Source: Lea-Smith, D. J., et al. Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method for generating antibiotic-marked mutants in cyanobacteria. The protocol begins with culturing cyanobacteria, followed by centrifugation and washing steps that preserve surface pili. A plasmid carrying an antibiotic resistance gene flanked by homologous sequences is then introduced. During incubation, the plasmid is internalized via pili...

Generation of Antibiotic-Marked Mutants in Cyanobacteria via Homologous Recombination

Temperatuurgevoelige (ts) letale mutanten zijn waardevolle hulpmiddelen om essentiële functies te identificeren en te analyseren. Hier beschrijven we methoden om ts letale mutanten op grote schaal te genereren en te classificeren.

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Phormidium lacuna is een filamenteuze cyanobacterie die werd geïsoleerd uit mariene rotspoelen. Dit artikel beschrijft de isolatie van filamenten uit natuurlijke bronnen, DNA-extractie, genoomsequencing, natuurlijke transformatie, expressie van sfGFP, cryoconservatie en motiliteitsmethoden.

Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium

Dit protocol biedt een uitgebreide richtlijn voor het opzetten en kwantitatief monitoren van co-culturen, inclusief fotoautotrofe suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gisten.

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

Met behulp van hoogfrequente elektrische stimulatie, beslag-achtige activiteit kan worden geïnduceerd...

Neurocircuit Testen voor epileptische aanvallen mutanten van Drosophila</em

Leer een methode voor het genereren van gemarkeerde en ongemarkeerde mutanten in cyanobacteriën Synechocystis PCC6803 en Synechococcus PCC7002. Deze techniek maakt herhaalde genetische manipulatie mogelijk.

Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Meer video's verkennen