Name: Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Leer een ethanol-geïnduceerd fibrotisch levermodel in zebravis opzetten voor leverregeneratieonderzoek. Deze kosteneffectieve methode maakt chemische screenings en gedetailleerde tijdreeksanalyses van hepatocytenregeneratie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de GTEC (2731336 en 1411318), de NIH (K01DK081351), en de NSF (1.354.837) naar CHS Wij danken Alem Giorgis voor kritische lezing van het manuscript.

Zebravis zijn gerezen en getogen behulp van een standaard protocol dat voldoet aan de criteria van de National Institutes of Health en door het Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. 1. Voorbereiding van de Solutions <ol><li> Bereid 20 L ei water (door elkaar gebruikt met een &#39;embryo medium&#39;) naar embryonale / larvale zebravis te handhaven. Los op 1,5 g CaSO 4 en 6 g direct oceaan zeezout in 250 ml gedestilleerd water. Giet in een mandfles gevuld met 20 liter gedestilleerd water en schud. </li><li> Bereid 1 L 1-fenyl-2-thioureum (PTU) voorraadoplossing (20x). Los op 0,6 g PTU poeder in 1 liter gedestilleerd water. Voeg 1 ml van de oplossing per 20 ml embryo medium tot een eindconcentratie van 0,003% is als werkoplossing. LET OP: PTU kan systemische toxiciteit na inhalatie of blootstelling van de huid veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren. </li><li> Bereid 1 liter ethyl-3-aminobenzoate methaansulfonaat (tricaïne) stock-oplossing (20x). Ontbinden 4 g tricaïne poeder in gedestilleerd water. Breng de pH op 7 door toevoeging van 1 M Tris buffer (pH 9) en breng het uiteindelijke volume op 1 liter met gedestilleerd water. Aliquot in 50 ml en bewaar bij -20 ° C. Ontdooien voor gebruik. LET OP: tricaïne kan een verlies van gevoel veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren. </li><li> Bereid 100 ml larvale metronidazol (MTZ) werkende oplossing. Voeg vers 15 mM MTZ oplossing door het oplossen van 0,25 g MTZ poeder in 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) in 100 ml embryo medium. Ontbinden MTZ poeder volledig door krachtig schudden. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van MTZ voorkomen. LET OP: MTZ kan irritatie veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren. </li><li> Bereid 100 ml larvale ethanol / metronidazol (EtOH / MTZ) werkende oplossing. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische de voorkominggradatie van MTZ. Voeg 1,5 ml 100% ethanol in 100 ml MTZ oplossing tot een eindconcentratie van 1,5% juist voor gebruik. </li><li> Bereid 500 ml volwassen MTZ werkende oplossing. Maak verse 10 mM MTZ-oplossing door het oplossen van 0,83 g MTZ poeder in 0,1% DMSO in 500 ml water systeem. Ontbinden MTZ poeder volledig door krachtig schudden. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van MTZ voorkomen. </li><li> Bereid 1 L PEM buffer. Los op 30,2 g PIPES, 0,74 g EGTA en 0,12 g MgSO4 in gedestilleerd water. Stel de pH tot 7 met NaOH. Breng uiteindelijke volume tot 1 L met gedestilleerd water. </li></ol> 2. Voorbereiding van de larvale zebravis <ol><li> Opzetten paring van [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] 15,17 volwassen zebravissen met Tg (hand2: EGFP) PD24 13 volwassen zebravissen in paring tanks. Gebruik verdelers om getimede paring te voeren. </li><li> Verwijder de divider de volgende ochtend en laat de vis om te paren zonder onderbreking. Harvest embryo 2 uur later gevolgd door het uitpersen van het systeem water en het overdragen van de embryo&#39;s in 100 mm Petri gerechten met embryo medium. </li><li> Houd niet meer dan 100 embryo&#39;s per petrischaal. Onder een stereomicroscoop, verwijder onbevruchte eieren met een glazen pipet. Embryo groeien bij 28 ° C en voeg fenylthioureum (PTU) tot een eindconcentratie van 0,003% na 10 uur post-bevruchting (HPF) pigment ontwikkeling remmen. </li></ol> 3. Ethanol, Metronidazole Behandeling en leverregeneratie in larvale zebravis <ol><li> Bereid deze EtOH door toevoeging van ethanol in embryo medium tot een eindconcentratie van 1,5%. Do PTU niet toe te voegen. </li><li> Behandel embryo&#39;s met 20 ml ethanol-oplossing per petrischaal 56-80 HPF. Bedek Petri gerechten met plastic folie om ethanol verdamping te voorkomen. </li><li> Uitzoeken [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11 </sup&gt;; Tg (hand2: EGFP) PD24] larven met gelijke afmetingen lever, zoals bepaald door CFP expressie bij 80 HPF. Do tricaïne niet gebruiken bij het sorteren van de-EtOH behandelde larven omdat deze hoog sterftecijfer met daaropvolgende behandeling EtOH / MTZ zal veroorzaken. Houd gesorteerde larven bij een dichtheid van 30 embryo&#39;s per petrischaal. </li><li> Bereid verse 15 mM MTZ in embryo medium in 0,1% DMSO. Voeg juiste hoeveelheid EtOH in MTZ oplossing tot een eindconcentratie van 1,5% te maken. Incubeer larven in 20 ml EtOH / MTZ oplossing per petrischaal gedurende 24 uur bij 28 ° C. Bedek Petri gerechten met plastic folie om EtOH concentratie en met aluminium folie ter bescherming tegen het licht te houden. </li><li> Na afloop van de behandeling, verwijder EtOH / MTZ oplossing overdracht larven nieuwe Petrischalen met verse embryo medium. Was larven 3 maal met embryo medium en bewaar ze in 20 ml embryo medium zonder PTU. </li><li> Te sorteren op de larven met een bijna volledige ablatie van levercellen, observeren fluorescentieonder een epifluorescentiemicroscoop van de GVB-filter bij een vergroting van 80x. Succesvolle ablatie resultaten in minimaal GVB fluorescentie in de lever en significant verminderd volume lever. </li><li> Tot de dood van de EtOH / MTZ-behandelde larven te voorkomen, geen gebruik maken van tricaïne voor het sorteren. Bevestig de larven voor immunokleuring (zie paragraaf 5) of houdt gesorteerde larven in petrischaaltjes bij 28 ° C voor verdere analyse. </li></ol> 4. Chemische schermen in EtOH / MTZ-behandelde Larvale zebravis <ol><li> Breng de 96-well platen met 10 mM voorraden in DMSO chemische (zie Materialen List voor details over de commerciële chemische bibliotheken) van de -80 ° C vriezer. Dek af met aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van chemicaliën te voorkomen. Ontdooi de voorraad oplossingen bij RT met zachte wiegen. </li><li> Bereid chemische oplossingen door verdunning van 10 mM voorraadoplossingen met embryo medium tot een eindconcentratie van 50 uM (in 96 putjesplaten: aanvankelijk screen; in 1,5 ml buizen: herkeuring). Controle larven werden behandeld met gelijke concentraties van DMSO in embryo medium. </li><li> Transfer larven vrijwel volledige hepatocyte ablatie, die werden behandeld met 1,5% EtOH / 15 mM MTZ en gesorteerd zoals voornoemd, ofwel 96 putjes (beginscherm) of 24 putjes (nacontrole) platen voorgevuld met embryo medium bij een dichtheid van 5 larven per putje. Gebruik duplo voor elke chemische stof. </li><li> Verwijderen embryo medium en voeg ofwel 250 ul (96 putjes) of 500 pl (24 putjes) chemische oplossingen voor elk putje. Afdekplaten met aluminiumfolie en behandelen larven gedurende 50 uur bij 28 ° C. Inspecteer-chemische weken larven dagelijks en verwijder alle dode larven van afzonderlijke putjes. </li><li> Aan het einde van de chemische behandeling, acht het aantal en / of de intensiteit van GFP-expressie hepatocyten onder een epifluorescentiemicroscoop de GVB filter bij een vergroting van 80X. Foto van levende larven tonen versterkt of te verminderend nummer en / of de intensiteit van CFP-expressie hepatocyten met een digitale camera voor records. </li><li> Preserve larven door formaldehyde fixatie voor confocale beeldvorming zoals beschreven in hoofdstuk 5. </li><li> Om de chemische stoffen die levercel regeneratie in het beginscherm te vergemakkelijken opnieuw te testen, onderzoeken hun potentie bij hogere en lagere concentraties van de meest doeltreffende concentratie met de in 4,1-4,5 ( &#39;herkeuring&#39;) beschreven procedures te vinden. </li></ol> 5. larvale zebravis Fixation, Immunokleuring en Confocale Imaging <ol><li> Verdoven larven door toevoeging tricaïne een eindconcentratie van 0,02%. Transfer 10-15 larven naar een 1,5 ml buis en eenmaal wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder PBS en voeg 1 ml vers bereide 2% formaldehyde in PEM buffer O / N vast te stellen op 4 ° C. LET OP: Formaldehyde veroorzaakt irritatie en staat bekend als een menselijk carcinogeen zijn. Hanteer in een zuurkast. </li><li> Gooi de vaststelling oplossing naar behoren en vervolgens wash 3 maal met PBS bij kamertemperatuur. Vaste larven in PBS bewaard bij 4 ° C tot enkele dagen. Overgegaan tot de volgende stap geeft onmiddellijk betere immunokleuring resultaten. </li><li> verwijderen dooier en huid die de lever gebied met behulp van een # 55 pincet onder een stereomicroscoop zorgvuldig. </li><li> Doorlaatbaar en blok larven Block buffer (4% runderserumalbumine en 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N bij 4 ° C. </li><li> Incubeer met konijn anti-collageen I antilichaam bij een verdunning van 1: 100 in blok buffer O / N bij 4 ° C. 5 keer wassen gedurende 15 min elk met wasbuffer (0,3% Triton X-100 in PBS). </li><li> Incubate met AlexaFluor 647 geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam bij een verdunning van 1: 200 in Block buffer O / N bij 4 ° C. 5 keer wassen gedurende 15 min elk met wasbuffer. Was daarna eenmaal met PBS. </li><li> Voorzichtig overdracht larven glasplaatjes met behulp van een glazen pipet, en oriënteren vaste larven met de linker zijkant naar boven. Verwijder overtollige PBS met behulp van Kimwipes. Voeg een druppel van de montage mediaEn seal deksel glas met nagellak. Het uitvoeren van confocale imaging onmiddellijk wordt sterk aanbevolen. </li><li> Gebruik een confocale systeem uitgerust met een 40x / 1,3 olie lens om beelden vast te leggen. Met laser sterkte bij 20-50%. Leg Z stapel afbeeldingen 1 um intervallen. </li></ol> 6. Voorbereiding van de Adult zebravis <ol><li> Opzetten paring van [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] 15,17 volwassen zebravissen in paring tanks. Harvest embryo&#39;s de volgende ochtend door overbelasting systeem water en het overdragen van de embryo&#39;s in 100 mm Petri gerechten met embryo medium. </li><li> Houd niet meer dan 100 embryo&#39;s per petrischaal. Onder een stereomicroscoop, verwijder onbevruchte eieren met een glazen pipet. Embryo groeien bij 28 ° C en een uiteindelijke concentratie van 0,003% PTU voeg na 10 HPF pigment ontwikkeling remmen. </li><li> Op 4 DPF, gebruiken tricaïne om larven verdoven en uitzoeken [Tg (fabp10a: GVB-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] larven. Spoel tricaïne door het veranderen van de frisse meerdere malen embryo medium. Laat larven te herstellen bij 28 ° C tot ze bereiken normale hartslag van 120-180 slagen per minuut 18. </li><li> Verhogen gesorteerde larven 6-12 maanden oud op basis van de standaardprocedure 19. </li></ol> 7. Ethanol, Metronidazole Behandeling en leverregeneratie in Adult zebravis <ol><li> Transfer 6-12 maanden oud [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] volwassen zebravissen paring tanks met behulp van een net. Houd vis bij een dichtheid van niet meer dan 10 vissen per tank. </li><li> Bereid deze EtOH door toevoeging van EtOH in systeemwater tot een eindconcentratie van 1%. Behandel volwassen vissen met 500 ml EtOH oplossing in elke tank en te onderhouden in een 28 ° C incubator. </li><li> Transfer volwassen vissen in de frisse EtOH oplossing dagelijks, verwerp dode vissen propErly als biologisch. Continu behandelen dieren voor 72 uur voor MTZ behandeling. </li><li> Bereid verse 10 mM MTZ-oplossing in het systeem water in 0,1% DMSO. Pre-warm de MTZ oplossing in een 28 ° C incubator. Behandel vissen met 500 ml MTZ oplossing 1 L kruising tank voor 8 uur bij 28 ° C, beschermd tegen licht gebruik aluminiumfolie. </li><li> Let op elk uur tijdens de behandeling en onmiddellijk te verwijderen dode vissen. Gooi dode vissen behoren als een biologisch gevaarlijk. Aan het eind van de behandeling MTZ, wassen MTZ door de overdracht van de dieren in de frisse systeem water tweemaal. </li><li> Laat de dieren om te herstellen en te onderhouden in een incubator bij 28 ° C. Voeden en over te dragen vis vers systeem water dagelijks tot het tijdstip voor de analyses. </li></ol> 8. Adult zebravis lever Fixation, Immunokleuring en Confocale Imaging <ol><li> Verdoven volwassen vissen met 0,02% tricaïne en euthanaseren in ijs water gedurende 15 min. Dep de vis droog op een papieren handdoek en leg het op een dissectie mat. </li><li> Expose gastro-intestinale organen door het verwijderen van de huid en spieren zoals eerder beschreven 20. Knip met een schaar de huid en de onderliggende spier vanaf de buik gesneden uit de anale vin de operculum, en posterieur langs de kant van de vis naar de anaalvin. </li><li> Leg de vis in een 15 ml conische buis en eenmaal wassen met PBS. Verwijderen PBS en voeg 4 ml vers bereide 2% formaldehyde in PEM buffer O / N lossen bij 4 ° C. </li><li> Gooi fixeeroplossing gewoon, en was 3 maal met PBS bij kamertemperatuur. Vaste monsters in PBS gedurende meerdere dagen worden bewaard bij 4 ° C. Overgegaan tot de volgende stap geeft onmiddellijk betere immunokleuring resultaten. </li><li> Ontleden de gehele darm met lever van de lichaamsholte van de vis door het snijden van de slokdarm. Integreer de gastro-intestinale organen met 4% laagsmeltende agarose in een mal snijden. </li><li> Gebruik een vibratome monsters gesneden dwarsprofielen op 50 um intervallen in ijskoud PBS, uitgaande van het voorste uiteinde. Transfer secgen tot 6-well plaat met PBS met behulp van een # 1 kwast. </li><li> Doorlaatbaar en blokdelen in Block buffer O / N bij 4 ° C. </li><li> Incubeer met konijn anti-collageen I antilichaam bij een verdunning van 1: 100 in blok buffer O / N bij 4 ° C. Was 5 keer, 15 minuten elk met wasbuffer. </li><li> Incubate met AlexaFluor 647 geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam bij een verdunning van 1: 200 in Block buffer O / N bij 4 ° C. Was 5 keer, 15 minuten elk met wasbuffer en eenmaal met PBS. </li><li> Voorzichtig dragen secties om glasplaatjes met behulp van een # 1 kwast. Verwijder overtollige PBS met behulp van Kimwipes, voeg een druppel van de montage media en seal deksel glas met nagellak. Het uitvoeren van confocale imaging onmiddellijk wordt sterk aanbevolen. </li><li> Gebruik een confocale systeem uitgerust met een 40x / 1,3 olie lens om beelden vast te leggen. Met laser sterkte bij 20-50%. Leg Z stapel afbeeldingen 1 um intervallen. </li></ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem cells and liver regeneration.</a> Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).</li>
<li>Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).</li>
<li>Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of liver fibrosis.</a> Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).</li>
<li>Bataller, R., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis.</a> J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).</li>
<li>Kisseleva, T., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fibrogenic+strategies+and+the+regression+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).</li>
<li>Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+liver+fibrosis+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modeling liver fibrosis in rodents.</a> Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).</li>
<li>Gabele, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+interactive+effects+of+alcohol+and+high-fat+diet+on+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).</li>
<li>Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fatty+liver%3A+its+pathogenesis+and+mechanism+of+progression+to+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis.</a> Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Jang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+an+alcoholic+fatty+liver+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio).</a> Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+animal+model+for+alcoholic+liver+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish.</a> Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li>
<li>Parsons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-responsive+cells+initiate+the+secondary+transition+in+larval+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas.</a> Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).</li>
<li>Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+%27pacemaker%27+current+%28Ih%29+in+a+zebrafish+mutant+with+a+slow+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+structural+evolution+of+the+early+proliferating+oval+cells+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver.</a> Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).</li>
<li>Turner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).</li>
<li>Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+notch+signaling+in+the+development+of+intrahepatic+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts.</a> Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).</li>
<li>Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibration+and+metabolism+of+ethanol+in+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish.</a> Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).</li>
<li>Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+zebrafish+chemical+screening+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in zebrafish chemical screening technologies.</a> Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).</li>
<li>Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zebraflash+transgenic+lines+for+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+stem+cells+and+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).</li>
<li>Westhoff, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+automated+imaging+pipeline+for+the+analysis+of+the+zebrafish+larval+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney.</a> PLoS One. 8 (12), e82137(2013).</li>
<li>Perlman, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+drug+profiling+by+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multidimensional drug profiling by automated microscopy.</a> Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).</li>
<li>Chu, J., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+school+in+liver+development%3A+lessons+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">New school in liver development: lessons from zebrafish.</a> Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure%2C+enzyme+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+liver+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).</li>
<li>Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+the+fibrotic%2Fcirrhotic+rat+liver+by+transplanted+hepatic+stem%2Fprogenitor+cells+and+mature+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes.</a> Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

We observed HPC gemedieerde hepatocyte regeneratie in EtOH / MTZ behandelde levers herstellen, wat suggereert dat zelfs in aanwezigheid van aanzienlijke hoeveelheid ECM eiwitten waaronder fibrillair type I collageen, het HPC&#39;s behouden hun vermogen tot regenereren zoals hepatocyten. Het enige MTZ-behandeling niet significant toenemen afzetting van ECM eiwitten, terwijl de EtOH enige behandeling niet HPC activering 15 hoefden te induceren. Door toepassing van de gecombineerde behandeling EtOH / MTZ, konden...

Ondanks de opmerkelijke regeneratiecapaciteit van hepatocyten 1, waarin de belangrijkste parenchymale cel type de lever, chronisch leverfalen belemmert dit vermogen, wat leidt tot hepatische progenitor cellen (HPC) -afhankelijke regeneratie 2. Chronische leverschade is voornamelijk afkomstig van alcoholmisbruik, chronische hepatitis C virus (HCV) 3 en niet-alcoholische fatty leverziekte (NAFLD) 4. Het leidt tot aanhoudende leverfibrose, die wordt geassocieerd met de accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) proteïnen. Aanhoudende ECM accumulatie vervalsen intact hepatische architectuur door vorming van een fibreus littekenweefsel 5 vervolgens resulteert in cirrose met hoge morbiditeit en mortaliteit. Vele pogingen zijn gedaan om de fibrotische respons voornamelijk te beperken door te focussen op profibrogene cytokinen remmen en geactiveerde myofibroblasten 6. Dit laatste is voornamelijk afkomstig van leverstellaatcellen (HSC&#39;s), het beginsel lever non-parenchymale cellen die verantwoordelijk zijn voor littekenvorming lever 4. Niettemin regeneratieve therapieën die endogene cellulaire bronnen zoals HPC hepatocyten in aanwezigheid van aanhoudende fibrogenen beledigingen regenereren stimuleren wachten verder onderzoek. Vele experimentele modellen van leverfibrose beschreven in zoogdieren. Herhaalde injectie van koolstoftetrachloride (CCl4) wordt veel gebruikt om leverfibrose induceren in muis en ratmodellen 7. In combinatie met een hoog vetgehalte (HF) dieet, alcohol leidde tot een aanzienlijke opwaartse regulatie van genexpressie en profibrogene leverfibrose 8. Terwijl steatose (lipide-accumulatie) het gevolg is van acute blootstelling aan alcohol, het maakt de lever gevoelig voor een ernstigere leveraandoening 9. De zebravis, Danio rerio, heeft ontpopt als een waardevolle gewervelde modelsysteem voor het bestuderen van de regeneratie. hoewelandere lagere gewervelde dieren zoals watersalamanders en axolotls een opmerkelijk vermogen tot regeneratie, de zebravis biedt voordelen boven andere modelsystemen met betrekking tot de genetische manipulatie en visualisatie strategieën worden vastgesteld om potentiële regeneratieve manipuleren factoren 10. De zebravis vertegenwoordigt ook een aantrekkelijk gewervelde model voor het bestuderen van alcoholische leverziekte (ALD) door simpelweg het toevoegen van ethanol (EtOH) om hun water. Acute EtOH blootstelling aan larven en volwassen zebravis veroorzaakt leversteatose 11-13. Bij volwassen zebravissen ontvangen langdurige blootstelling EtOH, werd collageen afzetting waargenomen met opregulatie van fibrose-gerelateerde genen 14. Er bestaat echter behoefte aan het ontwikkelen van modellen leverregeneratie studeren in reactie op EtOH als fibrogenen stimulus. Onlangs ontwikkelden we een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in de zebravis 15. We combineerden een hepatocyt-specifieke genetische ablatie systeem EtOH behandeling larvale en adult zebravis. Genereerden we twee transgene lijnen, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 en Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, waarbij E. coli nitroreductase (NTR) respectievelijk gefuseerd aan de cyaan en mCherry fluorescerend eiwit, onder toezicht van de hepatocyt-specifieke vetzuurbindend eiwit 10a, lever basis (fabp10a) promoter. In dit systeem zet NTR een toxisch progeneesmiddel metronidazol (MTZ) in een DNA-streng inter-verknopingsmiddel 16 induceren expliciete dood van hepatocyten. Met dit model hebben we aangetoond dat een populatie van levercellen, die reageren op Notch signalering, omgezet in hepatocyten in de bijna afwezigheid van hepatocyten en de overmaat ECM. We wijzen deze cellen als HPCs. Bovendien, door middel van chemische schermen, identificeerden we kleine molecule activatoren van Wnt-signalering en remmers van Notch signalering die levercel regeneratie in de fibrotische lever te vergroten. Therefoopnieuw, onze fibrotische lever model in de zebravis staat voor een uitstekende chemische screening systeem in vergelijking tot cel cultuur- of zoogdieren based screening systeem. Het is een in vivo systeem met aanzienlijke kosten- en tijdbesparende voordelen. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures voor de oprichting van een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model en voor het uitvoeren van chemische schermen gebruik van dit model in de zebravis. Verder werden tijdsverloop analyses uitgevoerd om te onderzoeken hoe levercel regeneratie plaatsvindt in de fibrotische lever. Dit protocol zal een waardevol instrument om de mechanismen en strategieën van het verbeteren van levercel regeneratie in de fibrotische lever te bestuderen bieden.

<table><tbody><tr><td>Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablet</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>Los één tablet op met 100 ml gedistilleerd water</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarose&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Signaling Compound Library</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K Library</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>Oplossen met DMSO tot 10&nbsp;mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>Oplossen met DMSO tot 10&nbsp;mM</td></tr><tr><td>Anti-Collagen I antibody</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>Gebruik op 1:100 voor immunokleuring, reageert met vis</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Molecular Probes</td><td>A31573</td><td>Gebruik op 1:200 voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Mounting media (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>Plastic wrap</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoresence microscope</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Confocol microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever model in zebravis om te studeren progenitor cell-gemedieerde hepatocyt regeneration

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Aanhoudende leverfibrose met voortzetting van de opbouw van extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten resulteert in het verlies van cellulaire competentie van de lever, wat leidt tot cirrose met hepatocellulaire disfunctie. Onder verschillende leverbeschadigingen kan alcoholmisbruik leiden tot ernstige gezondheidsproblemen, waaronder leverfalen en hepatocellulair carcinoom. Desalniettemin is de identiteit van endogene cellulaire bronnen die hepatocyten regenereren als reactie op alcohol niet goed onderzocht. Bovendien hebben weinig studies effectief hepatocytenregeneratie gemodelleerd na alcohol-geïnduceerde schade. We rapporteerden onlangs over het opzetten van een ethanol (EtOH)-geïnduceerde fibrotische levermodel in zebravissen waarin hepatische progenitorcellen (HPC's) hepatocyten aangaven bij bijna volledige hepatocytenverlies in aanwezigheid van een fibrogeen stimulus. Verder hebben we door middel van chemische screening met behulp van dit model meerdere kleine moleculen geïdentificeerd die hepatocytenregeneratie verbeteren. Hier beschrijven we in detail de procedures om een EtOH-geïnduceerde fibrotische levermodel te ontwikkelen en om chemische screening uit te voeren met behulp van dit model in zebravissen. Dit protocol zal een cruciaal hulpmiddel zijn om de moleculaire en cellulaire mechanismen van hoe hepatocyten regenereren in de fibrotische lever te bepalen. Bovendien zullen deze methoden de potentiële ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën voor chronische leverziekte in vivo vergemakkelijken.

Figuur 1 toont de ontwikkeling van een EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in larvale zebravis. Om een ​​protocol voor het blootstellen van de zebravis larven EtOH optimaliseren we eerst beoordeeld EtOH toxiciteit. 2,5 dagen post-bevruchting (DPF) larven werden blootgesteld aan EtOH concentratie 1%, 1,5% of 2% gedurende 24 uur, gevolgd door een gelijktijdige 24 uur EtOH / MTZ behandeling. Blootstelling aan 2% EtOH veroorzaakt hoge sterfte, terwijl bijna alle larven...

Aanhoudende fibrose met afzetting van overmatige extracellulaire matrix-eiwitten leidt tot cirrose. Alcoholmisbruik is een van de belangrijkste oorzaken van ernstige leverziekten. We hebben een ethanol-geïnduceerde zebravis model van een fibrotische lever opgezet om de mechanismen en strategieën van het bevorderen van hepatocytenregeneratie bij alcohol-geïnduceerde schade te bestuderen.

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Het hoofddoel van dit protocol is het tot stand brengen van een door ethanol geïnduceerd fibrotisch levermodel in zebravissen en het uitvoeren van chemische screenings met gebruik van dit model. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van leverregeneratie, zoals de moleculaire en cellulaire mechanismen van de wijze waarop hepatocyten regenereren in een fibrotische lever.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kosteneffectief is en tijd bespaart bij in vevo chemische screening. Bovendien kan er een gedetailleerde tijdreeksanalyse worden uitgevoerd door visualisatie van een enkele cel. De procedure zal worden gedemonstreerd door Mianbo Huang, een postdoc, en Jin Xu, een promovendus uit het laboratorium.Nadat de reagentia volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, worden paaltanks met scheidingswanden ingericht met volwassen transgene Zebrafish die fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR bevatten met Tp1:mCherry en Tg(hand2:EGFP)Zebrafish. De volgende ochtend, twee uur na het verwijderen van de scheidingswanden, worden de embryo's geoogst door het systeemwater te zeven en de embryo's over te brengen naar 100 millimeter petrischalen met embryo-medium. Bij 56 uur na bevruchting, of HPF, wordt 1,5 procent ethanol aan de embryo's toegevoegd.Gebruik vershoudfolie om de platen af te dekken om verdamping van ethanol te voorkomen. Incubeer vervolgens gedurende 24 uur bij 28 °C. Bereid verse 15 mM MTZ en embryo-medium met 0,1% DMSO voor en voeg ethanol toe tot een eindconcentratie van 1,5%.Behandel daarna, bij 80 HPF, de gesorteerde embryo's met 20 milliliters ethanol MTZ-oplossing per petrischaal. Gebruik vershoudfolie om de schalen af te dekken om verdamping van ethanol te voorkomen en dek ze af met aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen. Incubeer ze vervolgens 24 uur bij 28 graden Celsius.Observe de embryo's de volgende dag onder een epifluorescentiemicroscoop met een CFP-filter en een vergroting van 80x om de larven met een bijna volledige ablatie van hepatocyten te sorteren. Haal voor het uitvoeren van chemische screenings de 96-wellplaten met chemische voorraadoplossingen van tien millimol in DMSO uit de vriezer van -80 graden. Bedek de platen met aluminiumfolie om fotokatalytische degradatie van de chemicaliën te voorkomen en laat ze ontdooien door voorzichtig te schudden bij kamertemperatuur.Bereid in 1,5 milliliter buisjes chemische oplossingen voor door vijf microliters van tien millimolaire voorraadoplossingen te verdunnen met één milliliter embryo-medium tot een eindconcentratie van 50 micromolair. Verplaats vervolgens vijf larven per putje met bijna volledige hepatocyt-ablatie naar 24-well platen gevuld met embryo-medium. Verwijder daarna het embryo-medium en voeg 500 microliters van de chemische oplossingen toe aan elk putje.Dek de platen af met aluminiumfolie en incubeer de larven gedurende 50 uur bij 28 graden Celsius. Observeer na de incubatie het aantal en/of de intensiteit van CFP-uitdrukkende hepatocyten onder een epifluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 80x. Maak beelden van levende larven met een verhoogd of verminderd aantal en/of intensiteit van CFP-uitdrukkende hepatocyten.Stel kruisingen op van transgene zebravis die fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR bevatten met TP1:mCherry en kweek de gesorteerde larven op tot een leeftijd van zes tot 12 maanden. Gebruik een net om de volwassen transgene zebravis over te brengen naar de paaitanks. Bereid verse één procent ethanol in systeemwater en gebruik vervolgens 500 milliliters van deze oplossing om het systeemwater in de paaitanks te vervangen.Incubeer de tanks bij 28 °C gedurende 72 uur, waarbij de vissen dagelijks worden overgebracht naar een verse ethanoloplossing en eventuele dode vissen worden verwijderd tijdens de incubatie. Bereid een verse 10 mM MTZ-oplossing in systeemwater met 0,1 % DMSO, en voeg vervolgens 500 mL voorverwarmde MTZ-oplossing toe aan de vissen in mating tanks van één liter. Gebruik aluminiumfolie om de tanks af te dekken.Incubeer gedurende acht uur bij 28 °C en analyseer volgens het tekstprotocol. Na het verdoven volgens het tekstprotocol worden de gastro-intestinale organen blootgelegd door met een schaar de huid en de onderliggende spieren langs de buik door te snijden, vanaf de anaalvin tot aan het kieuwdeksel. Snijd vervolgens posterieur langs de zijkant van de vis terug naar de anaalvin.Plaats de vis in een conische buis van vijftien milliliter en was één keer met PBS. Verwijder vervolgens de PBS en voeg vier milliliter vers bereide drie procent formaldehyde in PEM-buffer toe. Incubeer gedurende de nacht bij vier graden Celsius om de vis te fixeren.De volgende dag, nadat de monsters volgens het tekstprotocol zijn gewassen, wordt de slokdarm doorgesneden om het gehele maagdarmkanaal samen met de lever uit de lichaamsholte te dissekeren. Plaats vervolgens de gastro-intestinale organen in een insluitmal en gebruik vier procent laagsmeltende agarose om het weefsel in te bedden. Trim daarna het blok tot een trapezevorm en lijm het aan de basis.Gebruik vervolgens een vibratoom en snijd, beginnend bij het binnenste uiteinde van het weefsel, monsters in transversale secties met intervallen van 50 µm in ijskoud PBS. Gebruik een penseel nummer 1 om de secties over te brengen naar een six-well plaat met PBS. Na het immunokleuren van de secties volgens het tekstprotocol, gebruikt u een penseel nummer 1 om de secties voorzichtig over te brengen naar glazen objectglazen.Gebruik Kimwipes om overtollige PBS te verwijderen voordat u een druppel monteermedium en een dekglas toevoegt. Gebruik vervolgens nagellak om het dekglas af te dichten. Leg tot slot, met behulp van een confocale systeem uitgerust met een 40x 1.3 NA olielens, Z-stack-beelden vast bij een sterkte van 20 tot 50 procent en intervallen van één micrometer.Deze figuur laat zien dat ethanol MTZ-behandelde larven een opwaartse kromming van de romp en staart ontwikkelen, pericardiaal oedeem vertonen en waarbij de zwemblaas niet opblaast. Zoals hier te zien is, vertoonden DMSO-behandelde controlelevers geen fibulaire depositie van type I collageen. Ethanol MTZ-behandelde levers vertoonden daarentegen een verhoogde accumulatie van type I collageen op 25 en 50 uur na ablatie.Daarnaast namen de HSC's in aantal toe en kregen ze een myofibroblast-achtige vorm zonder cytoplasmatische uitlopers in de regenererende levers behandeld met ethanol MTZ, in vergelijking met de met DMSO behandelde controlelevers. Deze figuur toont de ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerd fibrotisch levermodel in volwassen Zebrafish die werden behandeld met één procent ethanol gevolgd door MTZ. Uit deze tijdreeksanalyses bleek dat type one collageenafzettingen significant verhoogd waren in de regenererende levers behandeld met ethanol MTZ op twee, drie en vier dagen na ablatie, vergeleken met de met DMSO behandelde levers.In dit chemische screeningsexperiment werden hepatocyten geablateerd in aanwezigheid van 1,5 procent ethanol en 15 millimolaire MTZ. Vervolgens werden de larven gedurende 50 uur blootgesteld aan chemicaliën. Een aantal Wnt-agonisten, zoals remmers van glycogen synthase kinase-3 en een Wnt-activator, bevorderden de regeneratie van hepatocyten in vergelijking met DMSO.Deze gegevens suggereren dat dit model van aanhoudende fibrose een onschatbaar hulpmiddel biedt om kleine moleculen te ontdekken die de regeneratie van hepatocyten bevorderen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in één week worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een bijna volledige ablatie van hepatocyten moet worden bereikt en dat de ethanolconcentratie gedurende de gehele procedure moet worden gehandhaafd.Na het volgen van deze procedure kan de efficiëntie van de geïdentificeerde chemische verbindingen worden getest in modellen van leverbeschadiging bij zoogdieren. Na de ontwikkeling kan deze techniek nieuwe wegen openen op het gebied van cellulaire regeneratietherapie om de potentiële ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën voor patiënten met chronisch leverfalen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een door ethanol geïnduceerd fibrotisch levermodel in Zebrafish ontwikkelt en hoe u chemische screenings uitvoert.Vergeet niet dat werken met formaldehyde extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van handschoenen en het hanteren van het reagens in een zuurkast.

development-an-ethanol-induced-fibrotic-liver-model-zebrafish-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Om de moleculaire mechanismen van de ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsschade begrijpen, hebben we een zebravis model van ethanol blootstelling en het verkennen van de fysieke, cellulaire en genetische veranderingen die optreden na blootstelling aan...

Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

Metabole geheugen is het verschijnsel waarbij diabetische complicaties bestaan ​​en vooruitgang onbelemmerd zelfs na euglycemie farmaceutisch wordt bereikt. Hier beschrijven we een diabetes mellitus zebravismodel die uniek omdat het zorgt voor het onderzoek van de mitotische overdraagbare epigenetische componenten van het metabool...

De zebravis als model bij diabetes mellitus en Metabole Geheugen

Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de door de galgangen gestuurde leverregeneratie bij zebravis te helpen beoordelen, hebben we een leverbeschadigingsmodel opgesteld waarin de nitroreductase-expresserende hepatocyten genetisch worden afgebroken na behandeling met metronidazol. In dit protocol beschrijven we hoe we op bekwame wijze hepatocytenafbraak en door galgangen gestuurde leverregeneratie kunnen manipuleren, bewaken en analyseren.

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

Dit protocol beschrijft histologische analyses van de levers van zebravislarven die 24 uur met 2% ethanol zijn behandeld. Een dergelijke acute ethanolbehandeling resulteert in hepatische steatosis en zwelling van de hepatische vasculatuur.

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

Dit werk beschrijft een protocol om ethanolniveaus in een embryo van zebravissen te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie van de juiste blootstellingsmethoden voor embryoverwerking en ethanolanalyse.

Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Dit protocol beschrijft de procedures om acute nierschade (AKI) te veroorzaken bij volwassen zebravissen met cisplatine als nefrotoxisch middel. We beschreven de stappen om de reproduceerbaarheid van de techniek te evalueren en twee technieken om respectievelijk ontsteking en celdood in het nierweefsel, flowcytometrie en TUNEL te analyseren.

Acuut nierletselmodel geïnduceerd door Cisplatine bij volwassen zebravissen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Hier presenteren we hoe we een niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) -geassocieerd Hepatocellulair Carcinoom (HCC) zebravismodel kunnen genereren om de impact van cholesteroloverschot op de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap te bestuderen.

Analyse van levermicro-omgeving tijdens vroege progressie van niet-alcoholische leververvetting-geassocieerd hepatocellulair carcinoom bij zebravissen

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Hier presenteren we een protocol voor het transplanteren van cellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie in zebravisembryo's en -larven in elk stadium tussen ten minste 1 en 7 dagen na de bevruchting.

Celtransplantatie met hoge resolutie bij embryonale en larvale zebravissen

Leer een ethanol-geïnduceerd fibrotisch levermodel in zebravis opzetten voor leverregeneratieonderzoek. Deze kosteneffectieve methode maakt chemische screenings en gedetailleerde tijdreeksanalyses van hepatocytenregeneratie mogelijk.

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Meer video's verkennen