Voorbereiding en analyse van In Vitro Three Dimensional mammacarcinoom Surrogates
9 mei 2016
We demonstreren een methode om 3D-surrogaten voor borstkanker te genereren, die kunnen worden gekweekt met behulp van een perfusiebioreactorsysteem om zuurstof en voedingsstoffen af te geven. Na de groei worden surrogaten gefixeerd en verwerkt tot paraffine voor evaluatie van parameters van belang. De evaluatie van één van deze parameters, celdichtheid, wordt uitgelegd.
Het algemene doel van deze set procedures is om driedimensionale celculturen te genereren die kunnen functioneren als in vitro borstkanker-surrogaten, en om een methode te presenteren voor het meten van celgroei in histologische secties van de surrogaten. Driedimensionale celcultuur is een meer fysiologisch relevante methode voor het modelleren van celgedrag in vitro dan tweedimensionale celcultuur. Door de cellulaire samenstelling in experimentele omstandigheden te wijzigen, kan deze set procedures worden aangepast om een verscheidenheid aan biologische vragen te beantwoorden en de werkzaamheid van kandidaat-therapeutica te beoordelen.
Om de cellen in het ECM te incorporeren, voegt u op ijs de cellen en de eerste vier gerelateerde componenten vermeld in tabel één in het bijgevoegde manuscript toe aan een microcentrifugebuisje van twee millimeter. Meng ze vervolgens voorzichtig door te pipetteren en vermijd het vormen van luchtbellen. Controleer het pH-niveau met behulp van de fenolrode kleurstof in de 10XD MEM om ervoor te zorgen dat de mix een oranje-roze kleur vertoont, wat wijst op een pH van zeven.
Als de mix geel lijkt en de pH te laag is, voegt u langzaam 7,5 procent natriumbicarbonaat toe, één druppel per keer, totdat de juiste kleur is bereikt. Vergeet niet om de mix op ijs te houden en werk snel om voortijdige ECM-polymerisatie te voorkomen. Voor solide 3D-culturen houdt u de kamerschuifblokjes op ijs om voortijdige ECM-polymerisatie te voorkomen.
Pipetteer langzaam 100 micro-liter van de cel-ECM-mix in elk putje van de achtputjeskamerschuifblokjes en pipetteer de cel-ECM-mix rond de randen van het putje om de mix beter te verdelen. Vervolgens incubeert u de surrogaten gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius, vijf procent CO2 om ECM-polymerisatie mogelijk te maken. Voeg na vijfenveertig minuten 100 micro-liter van het kweekmedium toe aan elk putje en incubeer gedurende de duur van het experiment bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2.
Ververs het kweekmedium om de twee dagen. Een beperking van 3D-cultuur is dat de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen in het volume mogelijk onvoldoende is om cellevensvatbaarheid te ondersteunen. Het toevoegen van een bioreactorsysteem kan helpen om deze beperking te overwinnen en de groei te verbeteren.
Om profuse 3D-culturen in een bioreactorsysteem te produceren, bereidt u steriel het deel van het bioreactorsysteem voor dat de surrogaten huisvest en assembleert het. Gebruik in een celkweek-hood een spuit met een 26 gauge naald om de cel-ECM-mix in het gebied van de perfusiebioreactor te injecteren dat is ontworpen om cellen te bevatten, en ga snel door naar de volgende stap. Om een meer gelijkmatige verdeling van cellen binnen de surrogaten te garanderen, plaatst u het bioreactor-onderdeel dat de surrogaten huisvest in een 50 milliliter conische buis.
Roteer de surrogaten continu met 18 tpm terwijl u incubeert bij 37 graden Celsius in een in situ hybridisatieoven of een incubator gedurende 45 minuten om ECM-polymerisatie mogelijk te maken. Na polymerisatie en toevoeging van medium, sluit u de bioreactorassemblage aan op de pomp. Start de mediumperfusie in een incubator bij 37 graden Celsius, vijf procent CO2.
Ga door met mediumperfusie gedurende de duur van het experiment en ververs het kweekmedium zoals vereist voor het specifieke experimentele ontwerp. Aan het einde van het experiment omhult u de surrogaten in specimenverwerkingsgel om de surrogaten intact te houden tijdens de verwerking en om histologische sectie te vergemakkelijken. Om dit te doen, smelt u het specimenverwerkingsgel in een waterbad van 60 graden Celsius tot het klaar is om te gebruiken.
Pipetteer vervolgens ongeveer 300 micro-liter specimenverwerkingsgel in de bodem van een gelabelde cryomold. Gebruik een scalpel en een pincet om voorzichtig een surrogaat uit de bioreactor of uit het putje van een achtputjeskamerschuifblokje te verwijderen en plaats het in de cryomolds met specimenverwerkingsgel. Pipetteer ongeveer 300 micro-liter specimenverwerkingsgel om het surrogaat in de cryomold te bedekken.
Incubeer het vervolgens gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Zodra het specimenverwerkingsgel is gestold, verwijdert u het specimenverwerkingsgel met het surrogaat uit de cryomold en plaatst u het in een weefselcassette. Als er meer dan één surrogaat in dezelfde weefselcassette wordt geplaatst, kunnen weefselmarkeringskleuren worden gebruikt om monsters te onderscheiden na fixatie en verwerking.
Plaats vervolgens de weefselcassette met het surrogaat in tien procent neutraal gebufferd formulier gedurende tien tot twaalf uur op kamertemperatuur om volledige fixatie mogelijk te maken. Na fixatie, brengt u de weefselcassette met het surrogaat over naar 70 procent ethanol. De gefixeerde surrogaat is nu klaar voor verwerking tot paraffine en daaropvolgende histologische sectie.
Om de celdichtheid en fotomicroscopische beelden van H en E gekleurde secties te meten, opent u een afbeeldingsbestand van het surrogaat. Gebruik het Polygon-gereedschap in ImageJ en de randen van de ECM als leidraad om het gebied van het surrogaat te omlijnen door de muis te slepen en te klikken om ankerpunten te maken. Selecteer eenmaal omlijnd Meet onder het tabblad Analyseren.
Upload vervolgens de afbeeldingsbestanden die zijn gebruikt om het surrogaatgebied te meten in Cell Profiler door de afbeeldingsbestanden naar de bestandslijst te slepen. Vervolgens wijst u een naam toe aan elk geïmporteerd afbeelding in de module Namen en Typen Import en Selecteert u het afbeeldingstype. Nadat de analysepijplijn is gegenereerd, start u Testmodus en klikt u op Uitvoeren in Cell Profiler.
En evalueer gefilterde objecten om ervoor te zorgen dat de meeste kernen in de testafbeelding op de juiste manier zijn geïdentificeerd en dat de optimale parameters zijn gekozen om de cellen te identificeren. De opgenomen kernen worden omcirkeld in groen. Sla vervolgens het project op, verlaat de testmodus en klikt u op Afbeeldingen analyseren.
Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van de H en E gekleurde sectie van een ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het genereren van driedimensionale borstkankersurrogaten die gekweekt kunnen worden in een perfusiebioreactorsysteem. De surrogaten worden geëvalueerd op parameters zoals de celdichtheid nadat ze zijn gefixeerd en verwerkt voor histologische analyse.
Belangrijke Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Driedimensionale celkweek biedt een fysiologisch relevanter model dan tweedimensionale kweken.
- Deze methode maakt de beoordeling van diverse biologische vraagstukken mogelijk.
- De methode kan worden aangepast om de effectiviteit van kandidaat-therapeutica te evalueren.
- De cellulaire samenstelling kan worden gewijzigd om verschillende experimentele condities te bestuderen.
Doel van de studie
- Om in vitro surrogaatmodellen voor borstkanker te genereren met behulp van driedimensionale celculturen.
- Om een methode te presenteren voor het meten van celgroei in histologische coupes.
- Om het begrip van celgedrag in een relevantere omgeving te vergroten.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een celmengsel met ECM-componenten in een microcentrifugebuisje.
- Voorzichtig mengen van de componenten om belvorming te voorkomen.
- Bewaking van de pH-waarden met fenolrood om optimale condities te waarborgen.
- Gebruik van een perfusiebioreactorsysteem voor het onderhoud van de cultuur.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van driedimensionale surrogaten voor borstkanker.
- Evaluatie van de celdichtheid als een belangrijke parameter van belang.
- Demonstratie van de aanpasbaarheid van de methode voor diverse biologische vraagstukken.
- Vestiging van een betrouwbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een robuust platform voor het bestuderen van borstkanker.
- Driedimensionale culturen kunnen in vitro modellering aanzienlijk verbeteren.
- Deze aanpak kan het testen van therapeutische kandidaten vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt fysiologisch relevante in vitro modellering van borstcarcinoom mogelijk door stromale componenten en extracellulaire matrix te integreren, waarmee een belangrijke beperking van conventionele 2D-culturen wordt opgeheven. Het perfusiebioreactorsysteem overwint beperkingen in de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen, wat langdurige cultuur voor preklinische geneesmiddelentesten ondersteunt. Kwantificering van de dichtheid van gekernde cellen via ImageJ en CellProfiler biedt een meetbare output voor het beoordelen van groeidynamiek en behandelingsrespons.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar tumor-stroma-interacties in een 3D-architectuur die in vivo borstcarcinoom nauwer nabootst.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door de invloed van fibroblasten en ECM op het gedrag van kankercellen te modelleren.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in preklinische bevindingen door artefacten die geassocieerd worden met monolaagculturen te verminderen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde 3D-surrogaten met kwantificeerbare cellulariteit voor consistente screening van verbindingen.
- Operationele waarde: Compatibel met perfusie-bioreactorsystemen om de levensvatbaarheid tijdens uitgebreide assayperioden te behouden.
- Assay-gereedheid: Histologische verwerkings- en beeldanalyse-workflows maken reproduceerbare meting van de celldichtheid als farmacodynamisch eindpunt mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Surrogaten worden gefixeerd en in paraffine ingebed met methoden die analoog zijn aan de verwerking van klinische monsters, wat een directe vergelijking vergemakkelijkt.
- Preklinisch model: Maakt evaluatie mogelijk van groeikinetiek en proliferatiemarkers zoals Ki-67 onder variërende condities.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt modificatie van cellulaire en matrixcomponenten mogelijk om de bijdrage van het stroma aan het tumorgedrag en de respons op therapie te bestuderen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een stroma-bevattend 3D-model te bieden dat kan worden gebruikt voor hypothesetoetsing, assay-ontwikkeling en preklinische validatie voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt mechanistische studies naar interacties in de tumoromgeving en stromale modulatie van kankercel-fenotypes.
- Screening: Maakt perfusiegebaseerde kweek mogelijk voor uitgebreide studies naar blootstelling aan geneesmiddelen met een gecontroleerde toevoer van nutriënten.
- Analytica: Kwantificering van gekernde cellen per oppervlakte via ImageJ en CellProfiler biedt objectieve, schaalbare meetwaarden voor groei- en behandelingseffecten.
- Translationeel onderzoek: Paraffineverwerking en histologische coupes sluiten aan op klinische pathologieworkflows, wat de evaluatie van biomarkers ondersteunt.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: De aanpasbare cellulaire samenstelling maakt het mogelijk om het platform te herprogrammeren voor diverse borstkankersubtypen of stromale co-kweekconfiguraties.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert de fysiologische relevantie van in vitro-modellen door stromale componenten en ECM-componenten te integreren die in standaard monolaags Culturen ontbreken.
- Operationele waarde: Integratie van een perfusiebioreactor vermindert diffusiebeperkingen, waardoor de reproduceerbaarheid en de duur van de kweek worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt meer voorspellende preklinische beoordelingen mogelijk, waardoor het risico op fout-positieven bij therapeutische screening wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt datagestuurde go/no-go-beslissingen door kwantificeerbare metriken te bieden over surrogaatgroei en behandelrespons.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweek, steriele technieken en histologische verwerking.
- Afhankelijk van toegang tot perfusie-bioreactorsystemen, microtomen en software voor beeldanalyse (ImageJ, CellProfiler).
- Maakt standaardisatie van protocollen voor de bereiding van surrogaten, fixatie en doorsneden tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing aan alternatieve modellen kan optimalisatie van de ECM-samenstelling en celratio's vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten langere kweektijden en een verhoogd verbruik van middelen in vergelijking met 2D-modellen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Preparation of Cells in Extracellular Matrix
1:36
Surrogate Preparation
3:51
Surrogate Fixation and Processing
5:27
Measuring Cell Density
6:39
Results: Representative Images of a H&E-stained Section from Perfused and Solid Surrogates
7:37
Conclusion
